油莎豆塊莖油脂積累相關(guān)基因CeWRI1的克隆與功能分析

徐碩　鄒智　肖艷華　張麗　孔華　郭靜遠　郭安平

1. 海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院，海南?？??570228;2.?中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院三亞研究院，海南三亞 ?572024;3. 海南省南繁生物安全與分子育種重點實驗室/中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南海口??571101;4. 中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護與利用湖北省重點實驗室，湖北武漢??430074

摘 ?要：起源于非洲的油莎豆是迄今唯一已知在塊莖中高水平積累油脂的新型草本油料作物?；谖覈斍笆秤弥参镉秃蜕锊裼驮瞎┙o緊張的局面，挖掘參與油莎豆塊莖油脂積累的關(guān)鍵基因具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。WRI1（WRINKLED1）隸屬于AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族，是一類被證實在油料種子發(fā)育過程中控制碳源由糖向油分配的關(guān)鍵基因。本研究采用RT-PCR技術(shù)從油莎豆的塊莖中分離到一個WRI1同源基因（CeWRI1），該基因的編碼區(qū)為1116 bp，預(yù)測編碼371 AA，其理論分子量為41.58 kDa，等電點為5.76，總平均疏水指數(shù)為–0.750，不穩(wěn)定系數(shù)為60.75，細胞核定位，這與其轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能是一致的。與擬南芥WRI1類似，序列分析顯示CeWRI1含有2個保守的AP2結(jié)構(gòu)域（PF00847）、1個VYL基序和1個14-3-3/BPM結(jié)合基序;相比AP2結(jié)構(gòu)域和N端，其C端序列的變異較大，但包含與蛋白降解相關(guān)的PEST基序。qRT-PCR分析顯示，CeWRI1在葉片、葉鞘、根、匍匐莖和塊莖等主要組織中都有表達，且其在起始期、膨大初期、膨大中期、膨大晚期和成熟期等不同發(fā)育時期塊莖中呈現(xiàn)先降后升的J型表達趨勢，表達豐度最高的為成熟期，最低是膨大中期，這與油脂的積累模式大體一致。在煙草中的功能分析顯示，CeWRI1的異源瞬時過表達可顯著提高葉片的油脂（甘油三酯）含量，這進一步證實該基因具有油脂調(diào)控功能。上述結(jié)果表明CeWRI1是調(diào)控油莎豆塊莖高水平積累油脂的關(guān)鍵基因之一，這不僅為進一步揭示油莎豆塊莖油脂積累的調(diào)控機制奠定了堅實的基礎(chǔ)，也為后期的品種改良提供了寶貴的基因資源。

關(guān)鍵詞：甘油三酯;油脂積累;WRINKLED1;qRT-PCR;瞬時表達中圖分類號：S565.9??????文獻標識碼：A

Cloning and Functional Characterization?of CeWRI1， a Gene Involved in Oil Accumulation from Tigernut （Cyperus esculentus?L.）?Tubers

Abstract：Tigernut （Cyperus esculentusL.）， which originates from Africa， is an herbaceous oil crop uniquely accumulating high level of oil in underground tubers. In view of the shortage of edible vegetable oil and biodiesel in China currently， it is of great significance to explore?key genes involved in tuber oil accumulation.WRINKLED1（WRI1）， which encodes a transcription factor belonging to the AP2/ERF family， has been proven to be a key factor controlling carbon distribution from sugar toward oil during seed development of oil crops.?In this study， a gene namedCeWRI1that is homologous toArabidopsis thalianaWRI1（AtWRI1） was successfully isolated from tigernut tubers?by using the reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR） technique.?The gene， of an open reading frame 1116 bp， was predicted to encode?371 amino acids with the theoretical molecular weight （MW） of 41.58?kDa，?the isoelectric point （pI） of 5.76， the grand average of hydropathicity?（GRAVY） of –0.750， and the instability index?（II） of 60.75， implying its hydrophilic?and instable features. Subcellular localization analysis?suggests that the CeWRI1?protein is?located in the nucleus， corresponding?to its transcriptional regulatory function?as a transcription factor. As observed?in?AtWRI1， sequence analyses show that CeWRI1 harbors several conserved structural features， i.e. two AP2 domains （PF00847）， one VYL motif， and one 14-3-3/BPM-binding motif. Compared with the N?terminus?and AP2 domains， the C-terminal sequences?of CeWRI1 are relatively variable， though a PEST?motif associated with protein degradation?was found. Quantitative real-time?PCR?（qRT-PCR）?analysis reveals thatCeWRI1is expressed in all tested tissues， i.e.?leaf blade， sheath， root， rhizome， and tuber; during various?stages?of developmental tuber， i.e. initial，?early swelling，?middle swelling，?late swelling，?and mature stages， a typical J-shape expression pattern was observed， peaking at the mature stage?and minimizing at the middle swelling stage， which is generally consistent with the accumulation pattern of oil. Transient over-expression?ofCeWRI1 in tobacco?（Nicotiana tabacum）?leaves significantly?increased the triacylglycerol?（TAG） content， supporting its role in oil accumulation. Taken together， our data suggests thatCeWRI1is most likely to be one of?the key genes?controlling high oil accumulation in tigernut tubers， which would not only lay a solid foundation for further uncovering the regulatory mechanism of tuber oil accumulation， but also provide?a valuable resource?for genetic improvement?in tigernut?and species beyond.6F173DBC-5E0E-4456-8EDA-520B1FEBBD37

Keywords： triacylglycerol; oil accumulation;WRINKLED1;?qRT-PCR; transient expression

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2022.05.006

油莎豆（Cyperus esculentusL.），別名虎堅果，是一種隸屬于禾本目莎草科的多年生草本^[1-2]。生產(chǎn)上，油莎豆作為1年生作物栽培，以收獲地下塊莖為主要經(jīng)濟目標。油莎豆塊莖的頂端含有芽點，可以像紅薯、馬鈴薯等塊根塊莖類作物一樣用作種豆進行無性繁殖;不同的是，油莎豆的塊莖除富含淀粉（25%～45%）和可溶性糖（15%～20%）外，還積累24%～35%的油脂（甘油三酯， TAG），其中，油酸和亞油酸等不飽和脂肪酸的含量高達85%，屬于保健食用油^[3-6]。與大豆、油菜等傳統(tǒng)油料作物相比，油莎豆具有適應(yīng)性廣、發(fā)展?jié)摿Υ?、每畝產(chǎn)油量高等特點，便于在不擠占現(xiàn)有耕地的情況下利用沙化邊際土地增加我國的食用油供給，滿足國家的戰(zhàn)略需求^[7]。然而，當前關(guān)于油莎豆的研究主要集中于栽培和產(chǎn)品開發(fā)^[8-9]，而對其遺傳特性尤其是塊莖油脂積累的分子機制知之甚少。

WRI1（WRINKLED1）隸屬于AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族，是一類被證實在油料種子發(fā)育過程中調(diào)控油脂積累的關(guān)鍵基因^[10]。WRI1基因最先在模式植物擬南芥中被鑒定，其突變體（wri1-1）的種子表現(xiàn)為種皮表面皺縮，種子含油量降低80%，究其原因是該突變體無法有效地將碳水化合物轉(zhuǎn)化為脂肪酸合成所需的前體物質(zhì)^[11-12]。深入研究發(fā)現(xiàn)，WRI1主要通過結(jié)合順式作用元件AW-box（[CnTnG]?（n）₇[CG]）進而調(diào)控下游基因的表達，這些基因主要參與糖酵解以及質(zhì)體中脂肪酸的生物合成，如質(zhì)體丙酮酸激酶-α和β亞基、丙酮酸脫氫酶E1-α亞基、生物素載體蛋白、?；d體蛋白、β-酮脂酰-ACP合酶、烯酰-ACP還原酶1等^[13-14]。至今，WRI1同源基因已在油菜、大豆、玉米、蓖麻、麻瘋樹、油棕等植物中得到克隆，其過表達可明顯提高轉(zhuǎn)基因植株的油脂含量^[15-20]。2015年，GRIMBERG等^[21]從油莎豆的塊莖中分離到一個WRI1同源基因（CeWRI1tp），其瞬時過表達可顯著提高煙草葉片的含油量，這表明該基因具有油脂調(diào)控功能。本研究組基于團隊前期構(gòu)建的油莎豆基因組草圖發(fā)現(xiàn)該物種僅編碼1個WRI1基因，將其命名為CeWRI1。CeWRI1的編碼區(qū)與CeWRI1tp僅存在96.4%的序列一致性，推測其因品種差異所致，雖然如此，CeWRI1是否具有油脂調(diào)控功能還有待實驗證實。本文重點報道CeWRI1基因及其編碼蛋白的序列特征、理化特性、表達模式及其在煙草中的油脂調(diào)控功能，以期為下一步的品種改良奠定基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?植物材料??本氏煙草由本實驗保存，種子萌發(fā)后移栽于25℃光照培養(yǎng)箱。供試油莎豆品系為‘熱研1號，種豆催芽后播種于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院文昌試驗基地，組織及不同發(fā)育時期塊莖等樣品的采集詳見鄒智等^[5]的方法。

1.1.2 ?菌株及載體??大腸桿菌DH5α和根癌農(nóng)桿菌GV3101由本實驗室保存;植物表達載體pNC-Cam1304-SubN由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所言普副研究員惠贈。

1.1.3 ?主要試劑??各類限制性內(nèi)切酶、試劑盒詳見肖艷華等^[2]的文獻，試劑均為國產(chǎn)分析純。引物合成和常規(guī)DNA測序委托北京六合華大基因科技有限公司完成。

1.2方法

1.2.1 ?總RNA的提取及cDNA的合成??樣品總RNA的提取參照天根植物總RNA提取試劑盒說明書，經(jīng)純度、濃度和完整性檢測合格后用Takara PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA?Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈，并將其置于–20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2??基因克隆與載體構(gòu)建??根據(jù)前期的文獻報道從擬南芥和玉米的基因組（https：//phytozome-?next.jgi.doe.gov/pz/portal.html）中提取AtWRI1（AT3G54320）、AtWRI2（AT2G41710）、AtWRI3（AT1G16060）、AtWRI4（AT1G79700）、ZmWRI1a（GRMZM2G124524）、ZmWRI1b（GRMZM2G?174834）、ZmWRI2（GRMZM2G013657）和ZmWRI3（GRMZM2G131266）的基因序列。根據(jù)從油莎豆基因組中獲得的CeWRI1全長轉(zhuǎn)錄本序列，設(shè)計如表1所示的基因特異性引物，以上述反轉(zhuǎn)錄的塊莖cDNA作為模板，參照鄒智等^[22]的方法進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后切膠回收目的條帶，并利用同源重組的方法^[2]將其克隆到pNC-Cam1304-SubN;構(gòu)建的重組質(zhì)粒pCam1304-6F173DBC-5E0E-4456-8EDA-520B1FEBBD37

CeWRI1采用凍融法^[22]轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞中，經(jīng)菌落PCR驗證后選取陽性克隆進行序列測定。

1.2.3 ?序列分析??采用在線軟件ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）、SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）和WoLF PSORT（https：//www.genscript.com/wolf-psort.html）分別分析蛋白的理化特性、保守結(jié)構(gòu)域和亞細胞定位;用MEGA6.0軟件進行多序列比對（MUSCLE）及進化樹的構(gòu)建（鄰接法、bootstrap=1000）。

1.2.4 ?基因表達分析??參照鄒智等^[22]的方法進行熒光定量分析，引物信息詳見表1，其中18SrRNA^[2]和NtRPL23^[21]分別為油莎豆和煙草的內(nèi)參照基因，每個樣品3次生物學(xué)重復(fù)，基因相對表達值和顯著性差異分析分別用2^–ΔΔCT法和SPSS軟件進行。

1.2.5??煙草瞬時轉(zhuǎn)化與鑒定??采用凍融法^[22]將pCam1304-CeWRI1轉(zhuǎn)入GV3101感受態(tài)細胞中;參照GRIMBERG等^[21]的方法，采用微量注射器將農(nóng)桿菌工程菌導(dǎo)入6周齡煙草葉片;分別采集轉(zhuǎn)化后1、3、5?d的葉片，其中一部分用于甘油三脂含量的測定，另一部分用于總RNA的提取和表達分析。

2??結(jié)果與分析

2.1基因克隆

如圖1所示，以CeWRI1-F/R作為引物的首輪PCR成功獲得1條約1300 bp的特異條帶（圖1A），而以第一輪PCR產(chǎn)物作為模板、以CeWRI1-HF/R作為引物的第二輪PCR擴增到1條約1100 bp的目的條帶（圖1B）;片段切膠回收后構(gòu)建植物表達載體pCam1304-CeWRI1。

2.2CeWRI1生物信息學(xué)分析

測序及序列分析表明，CeWRI1的編碼區(qū)（CDS）為1116 bp，略高于CeWRI1tp的1110 bp;序列比對顯示其由6個堿基（AGAATG）的重復(fù)序列插入所致;此外，兩序列還存在34個單核苷酸多態(tài)性（SNP）（圖2）。CeWRI1預(yù)測編碼371 AA，其理論分子量為41.58 kDa、等電點（pI）為5.76、總平均疏水指數(shù)（GRAVY）為–0.750、不穩(wěn)定系數(shù)（II）為60.75、脂肪族指數(shù)（AI）為61.11，與CeWRI1tp相當（表2）。SMART分析和序列比對顯示CeWRI1含有2個保守的AP2結(jié)構(gòu)域（PF00847）、1個VYL基序和1個14-3-3/BPM結(jié)合基序;相比AP2結(jié)構(gòu)域和N端，蛋白的C端序列變異較大，但與AtWRI1一樣包含PEST基序（圖3）。WoLF PSORT分析顯示，CeWRI1定位在細胞核（表2）。

2.3CeWRI1進化分析

為進一步揭示CeWRI1的進化特征，研究將其與已報道的擬南芥和玉米同源蛋白構(gòu)建了進化樹。如圖4所示，這些蛋白明顯聚為三組，其中，CeWRI1與CeWRI1tp、AtWRI1、ZmWRI1a和ZmWRI1b聚在第一組，其序列一致性分別為96.0%、43.1%、46.1%和46.6%，暗示它們具有類似的生物學(xué)功能;在玉米中，第一組出現(xiàn)了擴張;第二組包括AtWRI3、AtWRI4和ZmWRI3，其在擬南芥中出現(xiàn)了擴張;第三組包括AtWRI2和ZmWRI2，其與前兩組的親緣關(guān)系相對較遠。

2.4 CeWRI1基因表達分析

為揭示CeWRI1的表達特性，本研究首先分析了基因在葉片、葉鞘、根、匍匐莖和塊莖（起始期）等主要組織中的表達模式。如圖5A所示，CeWRI1在所有組織中均有微弱表達，其中在根和葉片中的表達豐度最高，其次是塊莖和匍匐莖，均顯著高于葉鞘。進一步對起始期（S1）、膨大初期（S2）、膨大中期（S3）、膨大晚期（S4）及成熟期（S5）等不同發(fā)育時期塊莖的表達模式分析顯示，基因呈現(xiàn)先降后升的J型表達模式，豐度最高的為成熟期，最低是膨大中期（圖5B）。

2.5CeWRI1的功能分析

為證實CeWRI1在油脂積累方面的功能，本研究對煙草葉片進行了瞬時轉(zhuǎn)化。qRT-PCR分析顯示，轉(zhuǎn)空載的對照3個時間點均未檢測到CeWRI1的轉(zhuǎn)錄本，而實驗組在轉(zhuǎn)化后1 d即檢測到轉(zhuǎn)錄，隨后穩(wěn)步上升，分別增加了6.6和8.4倍（圖6A），這與TAG的積累模式（圖6B）相似;相比基因表達，TAG的積累水平存在一定的滯后性，3 d時僅增加1.2倍，5 d時增加到2.2倍（圖6B）。

3??討論

我國是油脂消費大國，其中，超七成的食用植物油依賴進口，嚴重超過國際安全警戒線，而這種供需矛盾隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展變得愈加突出^[7]。在當今錯綜復(fù)雜的國際形勢下，如何提升我國食用油脂的自給能力是油料科研工作者面臨的一項重要課題。傳統(tǒng)食用植物油主要來源于大豆、油菜、玉米、花生等油料作物的種子，存在產(chǎn)量偏低且易受氣候條件影響等問題。相比而言，用塊根、塊莖等營養(yǎng)組織生產(chǎn)油脂更具優(yōu)勢及較好的互補性，然而自然情況下這些組織通常不積累油脂^[23]，而目前有關(guān)油脂代謝與調(diào)控的知識主要來自以擬南芥為代表的種子類植物^[10]。油莎豆是迄今唯一已知在塊莖中高水平積累油脂的新型油料作物^[3]，深入揭示其油脂積累機制具有重要理論意義和應(yīng)用價值。

鑒于WRI1基因在種子油脂調(diào)控方面的關(guān)鍵作用^[15-20]，本研究從油莎豆的塊莖中分離到其同源基因CeWRI1。CeWRI1與前人報道的CeWRI1tp存在較大的序列差異，其中包括六堿基的插入和數(shù)十個SNP，這不僅額外增加了2個氨基酸，同時也造成13個氨基酸的變異。雖然如此，CeWRI1和CeWRI1tp都定位在細胞核，具有相似的理化特性，并且都含有AP2結(jié)構(gòu)域、VYL基序和14-3-3/ BPM結(jié)合基序等保守結(jié)構(gòu)。在擬南芥中，位于第一個AP2結(jié)構(gòu)域的VYL基序為AtWRI1的油脂調(diào)控功能所必須^[17]，14-3-3/BPM結(jié)合基序是磷酸化修飾位點，其與蛋白的穩(wěn)定性密切相關(guān)^{[10， 24]}。與AtWRI1相比，CeWRI1和CeWRI1tp蛋白的C端序列變異很大，即便如此，它們都含有類似的PEST基序，該基序被證明與蛋白的降解有關(guān)^[25]。進化分析進一步證實了CeWRI1與AtWRI1的直系同源關(guān)系;相對而言，CeWRI1與第二組ZmWRI3的親緣關(guān)系較近，而與第三組ZmWRI2較遠。在玉米中，存在2個WRI1基因，即ZmWRI1a和ZmWRI1b，共線性分析顯示它們來源于禾本科特異的全基因組重復(fù)，雖然它們都可以互補擬南芥wri1-4突變體，但其表達出現(xiàn)了明顯的分化，ZmWRI1a已進化成調(diào)控油脂代謝的主效基因^[16]。與CeWRI1tp^[21]一樣，CeWRI1在煙草中瞬時過表達可顯著提高葉片的油脂含量，且該基因在塊莖發(fā)育過程中的表達模式與油脂積累模式^[3]大體一致，這表明CeWRI1是調(diào)控塊莖高水平積累油脂的關(guān)鍵基因之一，雖然如此，其具體的調(diào)控機制還有待進一步研究。此外，CeWRI1也在塊莖以外的其他組織（如葉片、葉鞘、根和匍匐莖）中表達，且在根和葉片中的表達水平甚至高于剛起始的塊莖，暗示該基因可能參與塊莖以外組織的油脂積累或者參與其他代謝通路。

綜上，本研究完成了油莎豆CeWRI1基因的克隆及序列特征、進化關(guān)系、表達模式（包括主要組織和典型發(fā)育時期的塊莖）和油脂調(diào)控功能的分析。這些結(jié)果不僅為進一步揭示CeWRI1調(diào)控油莎豆塊莖高水平積累油脂的分子機制奠定了堅實的基礎(chǔ)，也為今后的品種改良提供了寶貴的基因資源。

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