基于轉(zhuǎn)錄組的荔枝泛素結(jié)合酶基因家族的鑒定及表達(dá)分析

董晨　李金枝　鄭雪文　王弋　李偉才

摘 ?要：泛素結(jié)合酶在泛素化級(jí)聯(lián)反應(yīng)中居于中心位置，是連接泛素活化酶和泛素連接酶的橋梁，在泛素化系統(tǒng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。本研究基于荔枝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，利用生物信息學(xué)方法對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)泛素結(jié)合酶UBC基因家族進(jìn)行鑒定，最終得到28個(gè)LcUBC基因家族成員。通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)LcUBC基因家族在‘妃子笑荔枝不同組織中進(jìn)行時(shí)空表達(dá)分析，并對(duì)花穗對(duì)照和烯效唑處理花穗發(fā)育的不同時(shí)期進(jìn)行表達(dá)分析。結(jié)果表明：LcUBC基因家族成員對(duì)應(yīng)所編碼的氨基酸數(shù)分布在85～1146 aa之間，等電點(diǎn)大小在4.03～9.61之間，5個(gè)LcUBC蛋白為穩(wěn)定蛋白，其余均為不穩(wěn)定蛋白。2個(gè)LcUBC蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)，2個(gè)LcUBC蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，1個(gè)LcUBC蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，其余蛋白均定位于細(xì)胞核。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，LcUBC蛋白分為10個(gè)亞家族;28個(gè)LcUBC基因家族成員在不同組織的表達(dá)量存在差異;烯效唑處理‘妃子笑荔枝花穗與對(duì)照相比，烯效唑處理21?d后，LcUBC基因家族成員的多個(gè)基因表達(dá)量較高。這是在轉(zhuǎn)錄組水平分析LcUBC基因家族成員，本研究結(jié)果對(duì)今后該基因家族的分類(lèi)、克隆和功能研究提供了參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：荔枝;泛素結(jié)合酶;基因家族;表達(dá)分析中圖分類(lèi)號(hào)：S667.1??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Transcriptome-wide Identification and Analysis of UBCGene?Family in Litchi chinensis?Sonn.

Abstract： Ubiquitin-conjugating enzymes play a central role in the ubiquitination cascade. They are the bridge between ubiquitin activating enzymes and ubiquitin ligases， and play a key role in the ubiquitination system. Through the local BLAST search and keyword search of transcriptome database， 32 ubiquitin-conjugating enzyme gene family members， including 5UEVand 28UBCgenes， were obtained through smart screening of conserved domains. OnlyLcUBC1–LcUBC28was studied in the article. Based on the litchi transcriptome database， the ubiquitin-conjugating enzyme gene family was identified by bioinformatics methods， and the temporal and spatial expression of ubiquitin-conjugating enzyme gene family in different tissues and organs of Feizixiao litchi was analyzed by the fluorescence quantitative PCR technology. Meanwhile， the expression of the control and uniconazole treatment at different stages of flower development was analyzed. The results showed that the amino acids were 85–1146?aa. The isoelectric point ranged?from 4.03 to 9.61. Five LcUBC proteins were?stable， and the others?LcUBC proteins were?unstable. Two LcUBC proteins were located in cytoplasm， two LcUBC proteins?in cytoplasm and nucleus， one?LcUBC protein in endoplasmic reticulum and the rest LcUBC proteins?in nucleus. There were?great differences in the length of the protein and the changes in the characteristics of the protein， indicating that the proteins of the ubiquitin protease gene family had?different characteristics. In the multiple sequence alignment， all 28?LcUBC?genes contained an evolutionarily highly conserved amino acid residue cysteine active site， and the C-terminal tryptophan （W） located behind the cysteine active site.?The 28 LcUBC proteins?were also highly conserved， and the “HPNI” conserved motif was located 7–10 amino acids before the active site of cysteine. The?LcUBC?gene?family was predicted to contain 10 conserved motifs. There were?certain differences in the number and types of conserved motifs contained in the members of the LcUBC?gene family. Among them， the conserved motifs 1 and 2 were?very important conserved motifs in the LcUBC domain. Phylogenetic analysis showed that the?litchi?UBC protein was divided into 10 subfamilies， namely UBC1， UBC2/11， UBC3/7， UBC4/5， UBC6， UBC8， UBC10/12， UBC13， UBC14， UBC15.?The 28?LcUBCgenes were?expressed in at least one tissue， and the expression levels of different genes in different tissues?were?different. Among them， the expression ofLcUBC4，?LcUBC5， andLcUBC18in seeds?were?significantly higher than that of other tissues， and the expression of?LcUBC7 in male flowers was significantly higher than that of other tissues. The expression level of female flowers ofLcUBC14andLcUBC15was significantly higher than that of other tissues， andLcUBC10was highly expressed in pericarp and old leaves. Compared with the control， the expression levels of LcUBC?genes in different developmental stages of Feizixiao litchi flower spikes treated with uniconazole were higher at 21 days after the treatment with Uniconazole. This is the first time that the?litchi?UBC?gene family was?analyzed at the transcriptome level. The results of the study would?provide some referrences for future studies on the classification， cloning and function of this gene family.30975874-6D9F-44F5-991C-F8B3C587AB3B

Keywords： Litchi chinensisSonn.; ubiquitin-conjugating enzyme; genes family; expression analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2022.05.002

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）是熱帶、亞熱帶發(fā)展中國(guó)家的最重要的作物之一。目前荔枝產(chǎn)業(yè)已成為中國(guó)華南熱作產(chǎn)業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)之一，對(duì)中國(guó)南方農(nóng)村經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和熱區(qū)農(nóng)民收入水平的提高發(fā)揮了舉足輕重的作用。2018年是我國(guó)有史以來(lái)最豐產(chǎn)的一年，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全國(guó)荔枝種植面積約為54.2萬(wàn)hm²，產(chǎn)量約為301萬(wàn)t，種植面積排在蘋(píng)果、柑橘、梨、葡萄和桃之后，屬于大宗果樹(shù)，但從總產(chǎn)量來(lái)看卻還算“小水果”。2018年荔枝結(jié)果面積按照總種植面積的80%計(jì)算，平均單產(chǎn)不足7.0 t/hm^2[1]?！有哂谢ㄋ腴L(zhǎng)、花量大、坐果率低的特點(diǎn)，坐果率低是其生產(chǎn)中亟待解決的一個(gè)“瓶頸”問(wèn)題，調(diào)控坐果的分子機(jī)理是當(dāng)今果實(shí)發(fā)育領(lǐng)域研究的一個(gè)熱點(diǎn)問(wèn)題。

泛素-蛋白酶體途徑（ubiquitin-proteasome pathway，UPP）廣泛存在于真核生物中，并且在維持細(xì)胞功能、細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)、抵御環(huán)境脅迫、胚胎發(fā)育、激素響應(yīng)和衰老等方面發(fā)揮著重要的作用^[2-5]。在泛素化過(guò)程中，關(guān)鍵酶主要包括泛素活化酶（E1）、泛素結(jié)合酶（E2）和泛素-蛋白連接酶（E3）。編碼E2及E2-like的基因已報(bào)道37個(gè)，根據(jù)結(jié)構(gòu)和序列的相似性可分為12個(gè)亞家族或14個(gè)組，E2-like基因8個(gè)^[6]。E2蛋白的典型特征是包含一個(gè)長(zhǎng)約140～200 aa的保守催化結(jié)構(gòu)域——UBC結(jié)構(gòu)域，內(nèi)含有1個(gè)高度保守的半胱氨酸活性位點(diǎn)，另外還存在一類(lèi)UEV（ubiqutin E2 variants）蛋白，該蛋白家族在序列和結(jié)構(gòu)上與泛素結(jié)合酶相似，但是缺少半胱氨酸催化位點(diǎn)，其功能也與典型的泛素結(jié)合酶蛋白有所不同。E2多以基因家族的形式存在，參與許多植物生理活動(dòng)^[7]。泛素結(jié)合酶在泛素化級(jí)聯(lián)反應(yīng)中居于中心位置，是連接泛素活化酶和泛素連接酶的橋梁，在泛素化系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。

目前，對(duì)E2基因的研究多集中在對(duì)DNA的修復(fù)進(jìn)程。如在核酸修復(fù)途徑中，UBC35/UBC36和 Mms2p/Uev1a蛋白形成復(fù)合物，在賴(lài)氨酸位點(diǎn)催化形成泛素鏈，來(lái)引發(fā)核酸修復(fù)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，完成對(duì)受損核酸的修復(fù)^[8]。UBC13協(xié)同E3連接酶RNF 8相互作用形成復(fù)合物，DNA損傷信號(hào)通過(guò)依賴(lài)泛素化的信號(hào)途徑來(lái)傳遞至染色質(zhì)，引發(fā)染色質(zhì)蛋白的磷酸化，促使RNF 8-UBC 13復(fù)合物定位到受損傷的核酸部位，產(chǎn)生泛素鏈后觸發(fā)DNA修復(fù)信號(hào)通路，使RAP 80蛋白和整個(gè)Brca1A復(fù)合物定位到受損傷的DNA部位，對(duì)損傷的DNA進(jìn)行修復(fù)^[9]。另外還有研究表明RNF 8-UBC 13復(fù)合物可獨(dú)立的行使底物蛋白的泛素化，并促進(jìn)DNA損傷的調(diào)節(jié)子53BP1蛋白的積累^[10]。

泛素結(jié)合酶在植物衰老和果實(shí)發(fā)育過(guò)程中起重要作用。PICTON等^[11]首次從番茄中克隆到泛素結(jié)合酶基因，研究發(fā)現(xiàn)泛素結(jié)合酶基因在番茄葉片衰老和果實(shí)成熟過(guò)程中表達(dá)。香蕉采后早期抑制差減文庫(kù)中篩選得到香蕉中的泛素結(jié)合酶基因MaUCEI，該基因介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)小的調(diào)節(jié)蛋白的降解，與酵母中的UBC 4/UBC 5結(jié)合，推測(cè)該基因可能通過(guò)影響果實(shí)成熟過(guò)程中淀粉酶的活性或含量而參與對(duì)淀粉降解的調(diào)控，在果實(shí)成熟衰老的分解代謝中發(fā)揮作用^[2]。2013年日本學(xué)者研究表明，大豆近等基因系成熟基因座等位基因E2/E3對(duì)基因型的修飾可以提供新品種，與對(duì)照相比，新品種花期較晚且產(chǎn)量高，可以適應(yīng)不同的緯度環(huán)境，并可保留原來(lái)的種子質(zhì)量^[12]。WANG等^[13]研究發(fā)現(xiàn)，番茄中2個(gè)E2基因（SlUBC 32和SlUBC 41）參與調(diào)控番茄果實(shí)成熟，但具體分子調(diào)控機(jī)制尚不清楚。DONG等^[14]研究香蕉花后果實(shí)不同發(fā)育階段E2基因家族的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)E2基因家族不同成員在果實(shí)發(fā)育不同階段行使功能，推測(cè)這些基因在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。陳曙等^[15]研究低磷處理下玉米幼苗不同組織中E2基因的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ZmUBC 17基因具有組織表達(dá)特異性，在葉片中大量表達(dá)，推測(cè)ZmUBC 17基因是通過(guò)調(diào)控玉米對(duì)磷元素吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)間接影響光合作用效率。

通過(guò)對(duì)擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)搜索顯示，E2基因以多拷貝形式存在，造成E2蛋白功能冗余，這可能是使E2基因的研究進(jìn)展不大的主要原因^[7]。近年來(lái)，隨著基因組測(cè)序技術(shù)的不斷提高，越來(lái)越多的植物完成全基因組的測(cè)序工作，越來(lái)越多的植物物種中泛素結(jié)合酶基因家族在基因組學(xué)上得到鑒定，如玉米^[16]、可可^[17]、水稻^[18]、葡萄^[19]、普通油茶^[20]和香蕉^[14]等。目前，關(guān)于荔枝基因家族的研究有XTH^[21]、ARF^[22-23]基因家族，關(guān)于荔枝泛素結(jié)合酶基因家族僅僅研究了LcUBC12基因^[24]。30975874-6D9F-44F5-991C-F8B3C587AB3B

本研究基于荔枝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，利用生物信息學(xué)方法對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)UBC基因家族進(jìn)行鑒定，并通過(guò)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)對(duì)LcUBC基因家族在‘妃子笑荔枝不同組織中進(jìn)行時(shí)空表達(dá)分析，并對(duì)花穗對(duì)照和烯效唑處理花穗發(fā)育的不同時(shí)期進(jìn)行表達(dá)分析，挖掘關(guān)鍵的LcUBC基因家族成員，為今后LcUBC基因功能的研究奠定基礎(chǔ)。本研究結(jié)果將為從蛋白質(zhì)降解方面深化荔枝坐果機(jī)理的研究和生產(chǎn)上調(diào)控荔枝坐果技術(shù)措施提供理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 材料

供試品種為‘妃子笑荔枝，取自廣東省湛江市麻章區(qū)湖光鎮(zhèn)湖秀路一號(hào)南亞熱帶作物研究所荔枝栽培示范園，荔枝UBC蛋白序列來(lái)源于本課題組前期構(gòu)建的‘妃子笑花穗發(fā)育轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)（GenBank accession SRP092890）。

1.2 方法

1.2.1 ?LcUBC基因家族的鑒定與分析??利用模式植物擬南芥和水稻UBC序列作為探針序列，運(yùn)用本地Blast軟件對(duì)荔枝測(cè)序轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中的unigene進(jìn)行搜索;同時(shí)，利用關(guān)鍵詞“Ubiquitin-?conjugating enzymes”和“UBC”直接檢索，得到所有可能的UBC序列后，對(duì)檢索結(jié)果進(jìn)行整合分析，去除重復(fù)序列后，利用Pfam在線(xiàn)軟件對(duì)序列保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行鑒定，去除不含LcUBC基因家族保守結(jié)構(gòu)域的序列。

1.2.2 ?LcUBC蛋白的基本理化性質(zhì)、序列比對(duì)和進(jìn)化分析??運(yùn)用ProtParam在線(xiàn)軟件（http：//web.?expasy.org/protparam/）分析預(yù)測(cè)LcUBC蛋白序列的分子量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪指數(shù)和疏水性等基本的理化性質(zhì);采用Plant-mPLoc Server在線(xiàn)軟件（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/?plant-multi/#）分析LcUBC蛋白的亞細(xì)胞定位;運(yùn)用MEME?4.12.0在線(xiàn)軟件（http：//meme.nbcr.net/?meme/）分析LcUBC家族蛋白的保守基序，參數(shù)設(shè)置：基序的最大數(shù)目設(shè)置為10， 基序長(zhǎng)度設(shè)為6～150個(gè)氨基酸，其他參數(shù)為默認(rèn)值。通過(guò)MEGA?6.0的MUSCLE程序比對(duì)氨基酸多重序列，參數(shù)為程序默認(rèn)參數(shù)。利用多重序列比對(duì)產(chǎn)生的LcUBC保守結(jié)構(gòu)域145個(gè)氨基酸殘基后續(xù)進(jìn)行NJ（Neighbor-Joining）分析。采用MEGA?6.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap值設(shè)為1000次重復(fù)，以獲得更為可靠的分支聚類(lèi)，其他參數(shù)為默認(rèn)參數(shù)。

1.2.3 ?LcUBC基因家族在花穗調(diào)控下的表達(dá)特征分析??選擇樹(shù)齡相同、長(zhǎng)勢(shì)相近的‘妃子笑荔枝樹(shù)，分別選取荔枝樹(shù)的不同組織如嫩葉、根、莖、老葉、雌花、雄花、果肉、果皮、種子，液氮速凍后存放于–80℃冰箱中，用于RNA的提取。

花穗處理：選擇樹(shù)齡相同、長(zhǎng)勢(shì)相近的‘妃子笑荔枝樹(shù)，當(dāng)花穗長(zhǎng)度抽生至約18?cm時(shí)，進(jìn)行如下操作：（1）對(duì)照組（CK），不做任何處理;（2）烯效唑（Un）處理，用50?mg/L烯效唑（品牌：四川國(guó)光，有效成分含量5%）噴施，噴至葉面滴水;分別取對(duì)照及烯效唑處理后0、7、14、21、28、35、42?d的花穗，液氮速凍后存放于–80℃冰箱中，用于RNA的提取。

選用前期課題組篩選的LcActin為內(nèi)參，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組中注釋的LcUBC的核苷酸序列，利用在線(xiàn)軟件Primer?3?plus設(shè)計(jì)熒光定量引物（表1），通過(guò)Blast分析引物的特異性，引物序列委托廣州艾基生物技術(shù)有限公司合成。將處理好的材料按照RNA提取標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行磨樣，采用華越洋生物科技有限公司RAN提取試劑盒QK型，分別對(duì)根、莖、嫩葉、老葉、雌花、雄花、果肉、果皮、種子和花穗的總RNA進(jìn)行提取，提取1?μL檢測(cè)RNA的質(zhì)量和濃度，樣品符合要求后利用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。qPCR分析采用SYBR Premix Ex Taq?（TaKaRa）試劑盒，Roche480Ⅱ定量PCR系統(tǒng)（瑞士），采用384孔板，qPCR反應(yīng)體系為10?μL，其中cDNA?1?μL（相當(dāng)于25?ng總RNA），10??mol/L基因特異性引物1??L，2×SYBR Premix ExTaq?5?μL，最后用ddH₂O補(bǔ)足10?μL。qPCR反應(yīng)條件：50℃預(yù)變性2?min，95℃預(yù)變性2?min;95℃變性15?s，56℃退火15?s，72℃延伸30?s，共55個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。采用2^–DDCT法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 LcUBC基因家族的鑒定

首先對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)的本地Blast進(jìn)行比對(duì)檢索和關(guān)鍵詞搜素，再通過(guò)SMART對(duì)保守結(jié)構(gòu)

域進(jìn)行篩選，最終得到28條LcUBC蛋白序列。為了便于研究，按照轉(zhuǎn)錄組中的基因ID大小前后順序統(tǒng)一為L(zhǎng)cUBC蛋白編號(hào)為L(zhǎng)cUBC 1～LcUBC 28（表2），對(duì)應(yīng)所編碼的氨基酸數(shù)分布在85～ 1149?aa之間;預(yù)測(cè)的理論分子量大小范圍在9.668～102.307?kDa之間。等電點(diǎn)大小范圍在4.03～9.61之間，其中 18個(gè)LcUBC蛋白的等電點(diǎn)小于7，顯酸性;10個(gè)LcUBC蛋白等電點(diǎn)大于7，顯堿性;LcUBC蛋白平均等電點(diǎn)小于7，表明UBC蛋白為弱酸性，在酸性的亞細(xì)胞環(huán)境中發(fā)揮作用。不穩(wěn)定指數(shù)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5個(gè)LcUBC蛋白（LcUBC?4、LcUBC 9、LcUBC 18、LcUBC 23和LcUBC 25）的不穩(wěn)定指數(shù)小于40，為穩(wěn)定蛋白，其余均為不穩(wěn)定蛋白。平均親水系數(shù)結(jié)果表明，除了LcUBC 4蛋白疏水，其余均為親水蛋白。亞細(xì)胞定位分析結(jié)果表明，LcUBC 7和LcUBC 16蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)，LcUBC 1和LcUBC 24蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，LcUBC 6蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，其余蛋白均定位于細(xì)胞核。綜合上述分析結(jié)果，無(wú)論從氨基酸序列的長(zhǎng)度還是蛋白的特性變化分析，LcUBC蛋白都有很大差異，這表明LcUBC基因家族蛋白具有不同特性。30975874-6D9F-44F5-991C-F8B3C587AB3B

2.2 LcUBC基因家族蛋白保守基序分析

通過(guò)多重序列比對(duì)LcUBC基因家族的氨基酸序列全長(zhǎng)，比較不同LcUBC家族成員間UBC保守結(jié)構(gòu)域的特點(diǎn)（圖1），多重序列比對(duì)中，28個(gè)LcUBC基因均含有進(jìn)化上高度保守的氨基酸殘基半胱氨酸的活性位點(diǎn)，位于半胱氨酸活性位點(diǎn)后的C-端色氨酸（W）在28個(gè)LcUBC蛋白中也高度保守，“HPNI”保守基序位于半胱氨酸活性位點(diǎn)之前的7～10位氨基酸。

通過(guò)在線(xiàn)軟件MEME分析LcUBC蛋白中的保守基序，結(jié)果見(jiàn)圖2。預(yù)測(cè)LcUBC基因家族中含有10個(gè)保守基序，LcUBC基因家族成員之間所包含的保守基序數(shù)目及種類(lèi)存在一定的差異。在LcUBC基因家族中有25個(gè)成員含Motif?1基序，有15個(gè)成員含Motif 2基序。通過(guò)SMART分析Motif?1、Motif 2為L(zhǎng)cUBC蛋白結(jié)構(gòu)域中非常重要的保守基序。

為進(jìn)一步了解LcUBC基因家族成員之間的進(jìn)化關(guān)系，利用模式物種擬南芥中的37個(gè)AtUBC和酵母中的13個(gè)ScUBC同荔枝中的28個(gè)LcUBC構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖3），結(jié)果表明，荔枝中的28個(gè)LcUBC分為10個(gè)亞家族，分別為UBC1、UBC2/11、UBC3/7、UBC4/5、UBC6、UBC8、UBC10/12、UBC13、UBC14、UBC15，其中UBC14和UBC15在酵母基因組中缺失，推測(cè)UBC14和UBC15是植物中特有的或是酵母進(jìn)化過(guò)程中丟失。

2.3LcUBC基因家族時(shí)空表達(dá)分析

UBC參與DNA的損失修復(fù)、生長(zhǎng)、發(fā)育及脅迫響應(yīng)等方面，為了研究LcUBC基因家族在不同發(fā)育過(guò)程中的功能，分析9個(gè)不同組織（如嫩葉、嫩莖、果皮、種子、根、雄花、老葉、雌花、果肉）中LcUBC基因的表達(dá)情況（圖4）。在植物正常的發(fā)育過(guò)程中，不是所有的UBC基因在不同組織部位都表達(dá)，28個(gè)LcUBC基因家族成員中至少在某一個(gè)組織部位表達(dá)（圖5），推測(cè)這些基因有可能是在生物脅迫或非生物脅迫條件下表達(dá)。其中，LcUBC4、LcUBC5、LcUBC18在種子中的表達(dá)顯著高于其他組織，LcUBC7在雄花中的表達(dá)上顯著較高于其他組織，LcUBC14、LcUBC15在雌花中的表達(dá)量顯著高于其他組織，LcUBC10在果皮和老葉中高表達(dá)。

2.4LcUBC基因家族在花穗調(diào)控表達(dá)模式

利用qPCR分析LcUBC基因家族在荔枝花穗調(diào)控的表達(dá)量（圖5），結(jié)果表明，與對(duì)照相比，LcUBC基因家族在烯效唑處理后表達(dá)量存在顯著變化，經(jīng)烯效唑處理后，LcUBC27在7、14、21、28、35 d表達(dá)量上調(diào)，LcUBC2、LcUBC7、LcUBC12、LcUBC13、LcUBC15、LcUBC16、LcUBC17、LcUBC28在21?d表達(dá)量最高，LcUBC 20、LcUBC21在35?d表達(dá)量最高，LcUBC16表達(dá)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在21?d表達(dá)量最高。LcUBC12、LcUBC 23、LcUBC24、LcUBC25與對(duì)照相比表達(dá)有變化，但差異不顯著。

3??討論

本研究參考擬南芥和水稻UBC家族基因的信息，基于烯效唑處理荔枝花穗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)方法全面分析鑒定LcUBC基因家族。結(jié)果共鑒定出28個(gè)LcUBC基因家族成員，并對(duì)其基本理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位進(jìn)行了分析。通過(guò)對(duì)LcUBC基因家族蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析可看出，LcUBC蛋白的結(jié)構(gòu)域具有高度的保守性，包含典型的保守結(jié)構(gòu)域UBC domain，且含有半胱氨酸活性位點(diǎn)，這與香蕉中UBC蛋白的分析結(jié)果一致^[14]。

通過(guò)轉(zhuǎn)錄組及qPCR的結(jié)果分析，在荔枝的時(shí)空表達(dá)和烯效唑處理后的花穗調(diào)控中，大多數(shù)LcUBC基因家族的表達(dá)水平發(fā)生了變化，推測(cè)這些基因很可能通過(guò)參與激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑或調(diào)控果實(shí)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的水平，進(jìn)而影響荔枝果實(shí)成熟過(guò)程中的各種生理變化。LcUBC 4、LcUBC 5、LcUBC8、LcUBC18、LcUBC19在種子中表達(dá)量較高，推測(cè)這5個(gè)LcUBC家族基因在果實(shí)種子發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用;LcUBC 6、LcUBC14、LcUBC15、LcUBC23、LcUBC24在雌花中表達(dá)量較高，LcUBC 7、LcUBC 26在雄花中表達(dá)量較高，推測(cè)這7個(gè)LcUBC家族基因在果實(shí)花發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用;LcUBC 10、LcUBC12、LcUBC18、LcUBC27在老葉中表達(dá)量較高，而LcUBC 13、LcUBC17、LcUBC20、LcUBC21在果皮中表達(dá)量較高。多個(gè)LcUBC家族基因的表達(dá)水平在烯效唑處理后第21天的表達(dá)量較高，這表明LcUBC基因家族在該時(shí)期調(diào)控荔枝花穗發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。該研究結(jié)果為進(jìn)一步研究LcUBC基因家族的生物學(xué)功能奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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