木薯塊根不同發(fā)育期β-胡蘿卜素和蛋白質(zhì)積累變化及其有色體蛋白質(zhì)組學(xué)研究

周鍇 　安飛飛　李開綿　陳松筆

摘 ?要：木薯是世界重要的糧食作物，在我國發(fā)展?jié)摿薮?。蛋白質(zhì)和類胡蘿卜素是重要的營養(yǎng)品質(zhì)特性，但木薯蛋白質(zhì)含量低，提高木薯塊根類胡蘿卜素和蛋白質(zhì)含量，提高其營養(yǎng)成分，已成為木薯選育種的重要目標(biāo)。本研究以蛋黃木薯（‘SC9）、紫葉黃心木薯（‘BGM019）和白心面包木薯（‘SC101）3個木薯品種為試驗材料，開展黃心和白心木薯塊根營養(yǎng)品質(zhì)特性的研究，分析其不同發(fā)育期類胡蘿卜素和蛋白質(zhì)含量的變化，同時利用雙向電泳和質(zhì)譜法開展木薯塊根有色體亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組的研究，揭示其蛋白質(zhì)含量提高與類胡蘿卜素積累的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果表明：3個木薯品種塊根b-胡蘿卜素含量在塊根形成期、膨大期和成熟期差異顯著（P<0.05），‘BGM019和‘SC9蛋白質(zhì)含量在同一生長發(fā)育時期差異不顯著（P>0.05），但顯著高于‘SC101（P<0.05）。隨著木薯塊根發(fā)育成熟，其類胡蘿卜素和蛋白質(zhì)含量均呈上升趨勢，且二者表現(xiàn)為正相關(guān)。以膨大期為對照，在‘SC9成熟期塊根有色體中檢測到36個差異表達(dá)蛋白質(zhì)，其中26個上調(diào)表達(dá)，10個下調(diào)表達(dá);‘BGM019中檢測到49個差異表達(dá)蛋白質(zhì)，其中28個上調(diào)表達(dá)，21個下調(diào)表達(dá);‘SC101檢測到38個差異蛋白質(zhì)，其中20個上調(diào)表達(dá)，18個下調(diào)表達(dá)。通過對上述差異蛋白質(zhì)的功能分析，發(fā)現(xiàn)它們均參與抗氧化、碳代謝和能量代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多個代謝過程，說明木薯塊根類胡蘿卜素積累是由多個代謝途徑協(xié)同作用的結(jié)果。對比分析3個木薯品種塊根有色體亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的差異蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)20個差異表達(dá)蛋白質(zhì)在其中2個品種或3個品種間出現(xiàn)相同的表達(dá)趨勢。它們主要涉及到碳代謝及能量代謝、抗氧化、細(xì)胞骨架蛋白、無機離子運輸及代謝、分子伴侶和蛋白質(zhì)合成等代謝途徑，其中與抗氧化相關(guān)的蛋白質(zhì)占20%。構(gòu)建蛋白質(zhì)生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)揭示塊根有色體蛋白質(zhì)與β-胡蘿卜素積累的關(guān)聯(lián)性，為培育優(yōu)質(zhì)高營養(yǎng)的木薯新品種提供新思路。

關(guān)鍵詞：木薯塊根;蛋白質(zhì)含量;b-胡蘿卜素含量;有色體;蛋白質(zhì)組學(xué)中圖分類號：S533??????文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Changes of b-carotene and Protein Accumulation and Proteomic Analysis of Chromoplasts in Different Developmental Stages of Cassava Tuberous Roots

Abstract： Cassava is one of the most important crops in the world and has a great potential as food crop in China. Protein and carotenoids are important nutritional quality characteristics. The content of protein?in the cassava tuberous root?is low. Hence， to improve the carotenoid and protein content and the value nourishment of the tuberous root is an important goal for cassava breeding. In the present study， three cassava varieties?including yellow cassava ‘SC9， ‘BGM019 and white cassava ‘SC101 were selected to analyze the nutritional quality characteristics， and measure the change of b-carotene and protein?content at different developmental stages of cassava tuberous roots. Additionally， 2-DE in combination with mass spectrometry were used to analyze the proteome profile of the chromoplast in order to understand the coupling mechanism of increasing the protein content related with carotenoid accumulation. The results showed that there were significant differences （P<0.05） between the genotypes in?β-carotene content in the periods of formation， enlargement and maturation of cassava tuberous roots. There were no significant differences （P>0.05） between ‘SC9 and ‘BGM019 regarding?the?protein content of tuberous roots， however， the protein contents in both yellow cassava genotypes weresignificantly higher than that of ‘SC101 （P<0.05）. A positive correlation between the carotenoid and protein content was observed during the development of the tubers in the genotypes. The tuberous-root chromoplasts of enlargement?period were used as references， proteome profile of tuberous-root chromoplast in maturation?period revealed a total of 36?protein spots in ‘SC9， in which 26?were classified as up-regulated and 10 down-regulated， while in ‘BGM019， 49 differential proteins were identified with 28 up-regulated spots and 21 down-regulated， and in ‘SC101 38 differential proteins identified， in which 20 were up-regulated and 18 were down-regulated. Most of the identified differential proteins were found to be involved in carbon and energy metabolism， detoxifying and antioxidant and signal transduction mechanism. The results indicate that the accumulation of proteins and carotenoid in cassava storage roots is regulated by different proteins complex. There were 20 common proteins observed between or among the genotypes. The proteins played?the same expression pattern and were?related to carbon and energy metabolism， detoxifying and antioxidant， structure， inorganic ion transport and metabolism， chaperones and protein biosynthesis. The protein biological regulatory network was constructed and revealed the relationship of protein content and b-carotene accumulation in chromoplast of tuberous root， and would?provide a new clue for the selection of new cassava varieties with high quality and high nutrition.ACDE1028-4A24-4A8A-A57E-0E8C924F09CF

Keywords： cassava tuberous roots; protein contents; b-carotene content; chromoplasts; proteome

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2022.05.001

木薯（Manihot esculenta Crantz）為大戟科（Euphorbiaceae）木薯屬（Manihot）植物，是世界第六大糧食作物。食用木薯風(fēng)味獨特，然而相比其他谷類作物（蛋白質(zhì)占干重7%～14%），木薯蛋白質(zhì)含量低，一般為干重的0.7%～2.5%，造成許多以木薯為主食的非洲國家青少年營養(yǎng)不良、生長發(fā)育遲緩、免疫力下降等。目前在我國的糧食作物中，木薯占比很低，食用性能差的木薯粗糧逐步向飼料、淀粉加工和生產(chǎn)能源酒精轉(zhuǎn)移，但隨著我國經(jīng)濟的快速發(fā)展，人們生活水平不斷提高，與其他山珍野菜一樣，木薯又以營養(yǎng)美味的粗糧雜糧形式，逐漸回歸人們的餐桌。目前中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院已培育出塊根富含b-胡蘿卜素的蛋黃木薯和紫葉黃心木薯等品種，其塊根蛋白質(zhì)含量顯著高于普通白心木薯，因此，木薯作為糧食作物和低糖、高能、美味的特色食品又重新成為人們關(guān)注的焦點。

木薯塊根中有色體是b-胡蘿卜素的載體，但關(guān)于b-胡蘿卜素在蛋黃和紫葉黃心木薯有色體中的高積累與有色體是否也可能作為蛋白質(zhì)積累的載體目前仍不很清楚。研究發(fā)現(xiàn)塊根中造粉體可以向有色體轉(zhuǎn)變，但對造粉體向有色體轉(zhuǎn)變的調(diào)控知之甚少。而從基因表達(dá)到最終合成蛋白質(zhì)，很多因素會影響并改變蛋白質(zhì)的功能，如蛋白質(zhì)翻譯的調(diào)控、糖基化、磷酸化等，因此直接研究蛋白質(zhì)的變化意義無法替代。而采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)能夠?qū)K根內(nèi)淀粉體向有色體轉(zhuǎn)變以及類胡蘿卜素積累過程中的蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有廣泛而完整的認(rèn)識，找到關(guān)鍵蛋白質(zhì)，有利于揭示類胡蘿卜積累的機理^[1]。

本研究選用蛋黃木薯（‘SC9，b-胡蘿卜素和蛋白質(zhì)含量高）、紫葉黃心木薯（‘BGM019，b-胡蘿卜素含量中等）和白心面包木薯（‘SC101，b-胡蘿卜素含量低）塊根及有色體為研究對象，研究木薯塊根不同生長發(fā)育時期b-胡蘿卜素和蛋白質(zhì)含量的變化，篩選出與b-胡蘿卜素積累和蛋白質(zhì)含量相關(guān)的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，為推測出關(guān)鍵基因和蛋白質(zhì)，培育優(yōu)質(zhì)高營養(yǎng)木薯新品種提供新思路。

1??材料與方法

1.1材料

供試材料‘BGM019、‘SC101和‘SC9由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所儋州國家木薯種質(zhì)資源圃提供。選擇生長健壯、無病蟲感染的木薯主莖為種莖，在直徑40 cm，高45 cm的盆內(nèi)盆栽種植。盆插木薯桿長15 cm，盆栽土為椰糠、菜園土（2∶1）的混合基質(zhì)。常規(guī)管理，并于植后1個月進(jìn)行間苗及補苗，分別于木薯塊根形成期（植后3個月）、膨大期（植后6個月）、成熟期（植后9個月）取樣進(jìn)行實驗。3個木薯品種塊根成熟期橫切面如圖1所示。

1.2方法

1.2.1 ?塊根可溶性蛋白質(zhì)含量測定??參考CARVALHO等^[2]的丙酮沉淀法經(jīng)改良后應(yīng)用于木薯塊根蛋白質(zhì)的提取，根據(jù)蛋白沉淀物含量加入適量的蛋白質(zhì)溶解液[9.5?mol/L?Urea，2?mol/L?Thiourea，4%（W/V）CHAPS，1% DDT，2.5 mmol/L?EDTA，2.5?mmol/L?EGTA]，常溫下溶解45?min后轉(zhuǎn)移至0.5?mL離心管內(nèi)，常溫下以13?000?r/min離心2?min。取上清液，再使用Sigma公司生產(chǎn)的Bradford試劑盒對蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測定。

1.2.2 ?塊根β-胡蘿卜素含量測定??參考楊龍等^[3]優(yōu)化后的方法，以丙酮/石油醚為提取液，甲醇/叔丁基甲醚（70/30，V/V）為流動相的高效液相色譜法測定不同生長發(fā)育時期木薯塊根中β-胡蘿卜素含量。

1.2.3 ?塊根有色體蛋白質(zhì)提取、分離、差異蛋白質(zhì)分析及質(zhì)譜鑒定等 ?參考鄧昌哲等^[4]改良后的Percoll密度梯度離心法提取塊根有色體。參考CHEN等^[5]的苯酚抽提法提取有色體蛋白質(zhì)，溶解后離心取上清液后用Bradford試劑盒進(jìn)行定量，之后再參考CHEN等^[5]的蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)進(jìn)行分離。使用Delta 2D軟件分析獲得的蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜，比較分析不同生長發(fā)育時期圖譜的蛋白質(zhì)點，從中選出重復(fù)性較好的差異表達(dá)蛋白質(zhì)點，進(jìn)行下一步的蛋白質(zhì)鑒定。參考AN等^[6]的蛋白質(zhì)譜鑒定方法，將樣品點到Anchorchip標(biāo)靶上，并置于質(zhì)譜儀（Bruker Daltonics）中掃描，進(jìn)行肽指紋圖譜及二級質(zhì)譜測定，獲取差異蛋白質(zhì)點的MALDI-TOF-TOF-MS/MS圖譜。使用在線程序Matrix Science（http：//www.matrixscience.com）在NCBI數(shù)據(jù)庫（分類學(xué)選擇綠色植物Vuiridi plantae）中進(jìn)行檢索，以半胱氨酸碘乙酰胺化為固定修飾，甲硫氨酸氧化為可變修飾，每次匹配允許最大的未被酶切位點數(shù)為1，二級質(zhì)譜肽段質(zhì)量誤差為1.5?Da，檢出與二級質(zhì)譜圖最佳匹配的多肽段。ACDE1028-4A24-4A8A-A57E-0E8C924F09CF

1.3數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件和DPS 7.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2??結(jié)果與分析

2.1木薯塊根不同生育期可溶性蛋白質(zhì)含量與b-胡蘿卜素含量變化分析

從表1可看出，‘SC9、‘BGM019和‘SC101在塊根形成期b-胡蘿卜素含量差異達(dá)顯著水平（P<0.05），其中‘SC9的b-胡蘿卜素含量最高，為1.727?mg/g，高于‘BGM019的1.063?mg/g;‘SC101的b-胡蘿卜素含量最低，為0.653?mg/g。而‘SC9（1.270?mg/g）和‘BGM019（1.150 mg/g）塊根形成期蛋白質(zhì)含量沒有顯著性差異，但明顯高于‘SC101（1.093 mg/g）（P<0.05）。在木薯塊根膨大期，‘SC9、‘BGM019和‘SC101b-胡蘿卜素和蛋白質(zhì)含量與形成期相比，均有明顯提高。‘SC9b-胡蘿卜素和蛋白質(zhì)含量均達(dá)最高，分別為2.470?mg/g和1.420 mg/g，‘BGM019次之，分別為1.210?mg/g和1.280 mg/g，‘SC101最低，分別為0.807?mg/g和1.143?mg/g。在木薯塊根成熟期，‘SC9和‘BGM019的b-胡蘿卜素（‘SC9：2.737?mg/g;‘BGM019：1.267?mg/g）和蛋白質(zhì)含量（‘SC9：1.537 mg/g;‘BGM019：1.383 mg/g）均比膨大期高，相反‘SC101塊根b-胡蘿卜素（‘SC101：0.653?mg/g）和蛋白質(zhì)含量（SC101：0.883 mg/g）比膨大期低。

從表1可知，隨著‘SC9塊根發(fā)育從形成期到膨大期到成熟期，β-胡蘿卜素與蛋白質(zhì)含量也逐漸升高，成熟期達(dá)到最高。在不同的發(fā)育期，隨著β-胡蘿卜素含量的積累，蛋白質(zhì)含量也呈上

升趨勢?！瓸GM019的β-胡蘿卜素和蛋白質(zhì)含量均是隨著塊根的不斷成熟而積累增多;但‘SC101塊根中β-胡蘿卜素和蛋白質(zhì)含量卻是在塊根膨大期時達(dá)到最大值，到成熟期反而下降。根據(jù)這一結(jié)果對不同木薯品種在塊根發(fā)育的不同階段進(jìn)行收獲以獲得最大的食用營養(yǎng)品質(zhì)。

2.2 木薯塊根不同生育期有色體蛋白質(zhì)組學(xué)分析

2.2.1 ?‘SC9塊根不同生育期有色體蛋白質(zhì)組學(xué)分析??‘SC9塊根成熟期與膨大期有色體蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜如圖2所示。‘SC9塊根成熟期有色體與膨大期有色體蛋白質(zhì)組相比，有36個差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點，其中上調(diào)表達(dá)26個，下調(diào)表達(dá)10個。經(jīng)MALDI-?TOF-TOF-MS/MS質(zhì)譜法結(jié)合在線程序MASCOT與NCBI數(shù)據(jù)庫搜索分析，成功鑒定到其中23個差異蛋白質(zhì)，包括上調(diào)表達(dá)蛋白質(zhì)15個，下調(diào)表達(dá)蛋白質(zhì)8個，其詳細(xì)信息見附表1。這些差異蛋白質(zhì)涉及能量代謝（3個）、分子伴侶（5個）、抗氧化（5個）、細(xì)胞骨架（3個）、核酸代謝（1個）、防御（1個）、無機離子運輸及代謝（1個）共7個蛋白質(zhì)功能群，此外，還包括4個功能未知的蛋白質(zhì)。參與碳代謝與能量代謝的蛋白有ATP結(jié)合蛋白及磷酸丙糖異構(gòu)酶;抗壞血酸類過氧化酶、超氧化物歧化酶及硫氧還蛋白與抗氧化相關(guān);分子伴侶主要為各種熱激蛋白;酰谷胱甘肽裂解酶參與細(xì)胞防御;與結(jié)構(gòu)相關(guān)的主要為肌動蛋白及等離子體膜多肽家族蛋白;而與無機離子運輸及代謝相關(guān)蛋白主要為鈣調(diào)蛋白。

2.2.2 ?‘BGM019塊根不同生育期有色體蛋白質(zhì)組學(xué)分析??‘BGM019成熟期與膨大期塊根有色體蛋白質(zhì)的表達(dá)圖譜如圖3所示?！瓸GM019塊根成熟期有色體與膨大期有色體蛋白質(zhì)組相比，共得到49個差異表達(dá)量在2.0倍以上的蛋白質(zhì)點，其中28個上調(diào)表達(dá)，21個下調(diào)表達(dá)。經(jīng)二級質(zhì)譜鑒定技術(shù)結(jié)合數(shù)據(jù)庫搜索分析，成功鑒定到其中37個差異蛋白質(zhì)，其中包括上調(diào)點20個，下調(diào)點17個，其詳細(xì)信息見附表2。這些差異蛋白質(zhì)涉及能量代謝（7個）、分子伴侶（7個）、抗氧化（7個）、結(jié)構(gòu)（5個）、核酸代謝（2個）、蛋白合成（1個）、光合作用相關(guān)（1個）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（1個）、無機離子運輸及代謝（1個）共9個蛋白質(zhì)功能群，此外，還包括5個功能未知的蛋白質(zhì)。參與碳代謝和能量代謝的7個蛋白質(zhì)中，分別為異黃酮還原酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、ADP葡糖焦磷酸化酶、ATP合酶β亞基、芥子醇脫氫酶、尿卟啉原脫羧酶、多萜基磷酸甘露糖合成酶;7個分子伴侶主要為各種熱激蛋白;抗壞血酸類過氧化酶為主要的抗氧化蛋白質(zhì);與蛋白合成相關(guān)的是一個延伸因子;與核酸代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)為富含甘氨酸的RNA結(jié)合蛋白和二磷酸核苷激酶B;參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的為表達(dá)上調(diào)的生長素應(yīng)答蛋白X10A;鈣調(diào)蛋白參與無機離子運輸及代謝過程，上調(diào)表達(dá)。

2.2.3 ?‘SC101塊根不同生育期有色體蛋白質(zhì)組學(xué)分析??以膨大期塊根有色體蛋白質(zhì)圖譜為對照，對膨大期及成熟期塊根有色體的雙向電泳圖譜進(jìn)行分析，如圖4A～C所示。共發(fā)現(xiàn)38個重復(fù)性較好且差異表達(dá)量達(dá)2.0倍以上的蛋白質(zhì)點，其中上調(diào)蛋白質(zhì)點為20個，其余18個為下調(diào)蛋白。經(jīng)過MALDI-TOF-TOF-MS/MS鑒定技術(shù)成功鑒定出其中的31個蛋白質(zhì)，包括15個上調(diào)表達(dá)蛋白質(zhì)和16個下調(diào)表達(dá)蛋白質(zhì)。

這些差異蛋白質(zhì)涉及能量代謝（8個）、分子伴侶（5個）、抗氧化（3個）、結(jié)構(gòu)（3個）、蛋白合成（1個）、氨基酸代謝（1個）、光合作用相關(guān)（1個）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（1個）、無機離子運輸及代謝（1個）共9個蛋白質(zhì)功能群，此外，還包括7個功能未知的蛋白質(zhì)（附表3）。8個參與碳代謝和能量代謝的蛋白質(zhì)中，包括表達(dá)上調(diào)的ATP結(jié)合蛋白，下調(diào)表達(dá)的磷酸甘油酸酯酶、葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、丙酮酸脫氫酶E1β亞基等;除硫氧還蛋白H表達(dá)下調(diào)外，抗壞血酸過氧化酶及異黃酮還原酶等與抗氧化相關(guān)的蛋白質(zhì)上調(diào)表達(dá);天冬氨酸蛋白酶前體參與氨基酸代謝;與生長素相關(guān)的SAUR家族蛋白上調(diào)表達(dá);同樣上調(diào)表達(dá)的還有參與無機離子運輸與代謝的鈣調(diào)蛋白。ACDE1028-4A24-4A8A-A57E-0E8C924F09CF

2.3 ?3個木薯品種不同生育期塊根有色體差異表達(dá)蛋白質(zhì)分析

木薯生長發(fā)育進(jìn)入成熟期后，‘SC9塊根有色體檢測出36個差異表達(dá)蛋白質(zhì)，‘BGM019塊根有色體中檢測到49個蛋白質(zhì)出現(xiàn)了差異表達(dá)，而‘SC101塊根有色體則檢測到38個差異表達(dá)蛋白質(zhì)。利用質(zhì)譜法結(jié)合數(shù)據(jù)庫搜索成功鑒定出23個在‘SC9塊根有色體內(nèi)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點、37個在‘BGM019塊根有色體內(nèi)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點，以及31個在‘SC101塊根有色體內(nèi)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點。對比分析3個品種木薯塊根有色體差異蛋白質(zhì)（圖5），發(fā)現(xiàn)5個差異表達(dá)蛋白質(zhì)在3個品種內(nèi)表達(dá)趨勢相同，其中2個蛋白質(zhì)均上調(diào)表達(dá)，2個蛋白質(zhì)均下調(diào)表達(dá)。但有1個蛋白質(zhì)表達(dá)特殊，僅在‘SC9塊根有色體中下調(diào)表達(dá)，而在另外2個品種內(nèi)上調(diào)表達(dá)。此外，‘SC9與‘BGM019塊根有色體共同出現(xiàn)了4個差異表達(dá)蛋白質(zhì)，除了1個蛋白質(zhì)在‘SC9上調(diào)表達(dá)，而在‘BGM019則下調(diào)表達(dá)外，其他3個均表現(xiàn)為相同表達(dá)特性。而‘SC9與‘SC101塊根有色體蛋白質(zhì)有2個共同的蛋白質(zhì)出現(xiàn)差異表達(dá)，且均為上調(diào)表達(dá)?！瓸GM019與‘SC101塊根有色體中則發(fā)現(xiàn)了9個共同表達(dá)的蛋白質(zhì)，其中有1個功能未知的蛋白質(zhì)在‘BGM019內(nèi)下調(diào)表達(dá)而在‘SC101中則上調(diào)表達(dá)，另外8個共同差異表達(dá)的蛋白質(zhì)中，6個均為下調(diào)表達(dá)，2個均為上調(diào)表達(dá)。

對3種品種塊根有色體間共有差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點進(jìn)行功能分析，發(fā)現(xiàn)它們主要涉及碳代謝與能量代謝、分子伴侶、抗氧化、細(xì)胞骨架蛋白、蛋白質(zhì)合成、無機離子運輸與代謝和光合作用等。其中抗氧化、分子伴侶和細(xì)胞骨架蛋白各占20%，碳代謝與能量代謝占10%，而蛋白質(zhì)合成、無機離子運輸與代謝以及光合作用各占5%，功能未知的占15%（附表4）。

2.4 木薯塊根有色體類胡蘿卜素合成蛋白質(zhì)生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

通過‘SC9、‘BGM019和‘SC101塊根有色體差異蛋白質(zhì)鑒定得出，‘SC9有色體的獨有蛋白質(zhì)12個，‘BGM019有色體19個，‘SC10115個（表2）。這些有色體特有的差異蛋白質(zhì)對黃心木薯和白心木薯在類胡蘿卜素和蛋白質(zhì)的積累中起到比較重要的作用，根據(jù)KEGG代謝途徑的數(shù)據(jù)庫（http：//www.genome.jp/kegg/pathway.html）

和差異蛋白質(zhì)的功能構(gòu)建木薯塊根有色體類胡蘿卜素合成蛋白質(zhì)生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，如圖6所示。

類胡蘿卜素的合成和積累涉及糖酵解、三羧酸循環(huán)和MEP/DOXP等代謝途徑，其中MEP/DOXP主要發(fā)生在有色體中。在‘SC9、‘BGM019和‘SC101塊根有色體的獨特蛋白質(zhì)主要和糖酵解、三羧酸循環(huán)和MEP/DOXP等代謝途徑相關(guān)。據(jù)報道，在花椰菜中發(fā)現(xiàn)的OR蛋白具有類似DnaJ的鋅指結(jié)構(gòu)，能夠調(diào)控細(xì)胞中豐富的前體或無色體向有色體轉(zhuǎn)變，在有色體中形成豐富的類胡蘿卜素螯合結(jié)構(gòu)，從而使大量的β-胡蘿卜素積累得到合成和積累^[7]。研究還發(fā)現(xiàn)獨特的類胡蘿卜素生物合成調(diào)控因子能促進(jìn)有色體的發(fā)育，如在番茄中發(fā)現(xiàn)的HSP21能夠促進(jìn)葉綠體向有色體的轉(zhuǎn)化，過量表達(dá)HSP21促進(jìn)了果實提前積累類胡蘿卜素^[8]。在本研究中黃心木薯‘SC9和‘BGM019的chaperones蛋白質(zhì)均有上調(diào)表達(dá)，而‘SC101的chaperones蛋白質(zhì)下調(diào)，這也說明黃心木薯有色體形成比白心木薯多，黃心木薯類胡蘿卜素合成和積累比白心木薯高（表2）。

3 ?討論

本研究結(jié)果表明，隨著黃心木薯‘SC9和‘BGM019塊根發(fā)育成熟，從形成期、膨大期至成熟期，其塊根蛋白質(zhì)含量和類胡蘿卜素含量呈不斷增加趨勢，且二者成正相關(guān)。原因主要是木薯塊根中有色體是類胡蘿卜素的載體，而有色體一般認(rèn)為是由白色體或葉綠體轉(zhuǎn)變而形成的。在木薯塊根中白色體主要是淀粉體，因此，淀粉體向有色體轉(zhuǎn)變后，為類胡蘿卜的合成和積累提供了場所和載體。為保證有色體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和功能發(fā)揮以及類胡蘿卜素積累的持續(xù)，導(dǎo)致一系列蛋白質(zhì)參與促成這些代謝過程的穩(wěn)定運行，因而從總體上提高了蛋白質(zhì)的含量。本研究結(jié)果與CARVALHO等^[8]研究結(jié)果一致。

以‘SC9與‘SC101為例，其類胡蘿卜素含量在2個生長發(fā)育時期差異均達(dá)極顯著，而‘SC9上調(diào)表達(dá)蛋白質(zhì)在差異表達(dá)蛋白質(zhì)中占優(yōu)勢，這可能與其有色體類胡蘿卜積累能力更強相關(guān)。此外，對3個木薯品種在膨大期與成熟期差異蛋白質(zhì)點進(jìn)行進(jìn)一步的對比分析發(fā)現(xiàn)，20個差異表達(dá)蛋白質(zhì)在其中2個品種或3個品種間出現(xiàn)相同的表達(dá)趨勢。但這20個差異蛋白質(zhì)點表達(dá)特征并不完全一致，有4個差異蛋白質(zhì)點在其中1個品種上調(diào)表達(dá)，而在另外的1個或2個品種則下調(diào)表達(dá)。這4個差異蛋白質(zhì)點分別是：屬于細(xì)胞骨架蛋白的肌動蛋白（actin-1），其在‘SC9塊根有色體上調(diào)表達(dá)，而在‘BGM019塊根有色體則下調(diào)表達(dá);功能未知的假定蛋白（hypothetical protein SORBIDRAFT_08g0185 60），在‘BGM019塊根有色體下調(diào)表達(dá)，而在‘SC101塊根有色體則上調(diào)表達(dá);分子伴侶的小熱激蛋白（small heat shock protein isoform 2-T. cacao），其在‘SC9塊根有色體下調(diào)表達(dá)，而在‘BGM019及‘SC101塊根有色體均上調(diào)表達(dá);以及在‘SC9表達(dá)上調(diào)，而在‘BGM019表達(dá)下調(diào)的抗壞血酸過氧化物酶。肌動蛋白是生物體中微絲的兩個單體亞基之一，對細(xì)胞活動起著很大的作用，比如細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、分裂和原質(zhì)的流動、細(xì)胞間信息的傳遞、以及細(xì)胞的形狀和連結(jié)的建立和維持等^[9]。因此推測‘SC9塊根成熟期由于類胡蘿卜素的不斷積累導(dǎo)致細(xì)胞活動更頻繁，從而使肌動蛋白上調(diào)表達(dá)?？箟难徇^氧化物酶（APX）是植物活性氧代謝中重要的抗氧化酶之一，在植物抗氧化系統(tǒng)中，是清除過氧化氫的主要酶類。有關(guān)擬南芥的某些研究表明，APX2主要在極端光照或者熱脅迫時起作用。有研究表明APX2也與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)，而且ABA也參與到了此信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中^[10]。APX2在‘SC9上調(diào)表達(dá)，在‘BGM019下調(diào)表達(dá)，而成熟期時‘SC9類胡蘿卜含量極顯著高于‘BGM019，可能是由于APX2提高了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率，同時ABA促進(jìn)了類胡蘿卜素的積累;當(dāng)細(xì)胞受到感染、熱激或氧化損傷等反應(yīng)時，熱激蛋白會大量表達(dá)，識別錯誤折疊或去折疊的蛋白質(zhì)，同時標(biāo)記它們以供蛋白酶體降解^[11]。而小熱激蛋白在‘SC9下調(diào)表達(dá)，而在‘BGM019和‘SC101均上調(diào)表達(dá)，推測在成熟期時3個品種同時發(fā)生了細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，從而導(dǎo)致熱激蛋白的表達(dá)，而其在‘BGM019和‘SC101中上調(diào)表達(dá)，則致使一些蛋白質(zhì)被降解，從而導(dǎo)致塊根蛋白質(zhì)含量下降。ACDE1028-4A24-4A8A-A57E-0E8C924F09CF

還有16個差異表達(dá)蛋白質(zhì)點在3個品種間或兩兩間表達(dá)特征一致，主要功能為抗氧化（3個，占總相同差異蛋白質(zhì)點的15%）、碳代謝與能量代謝（2個）、分子伴侶（3個）、細(xì)胞骨架蛋白（3個）、蛋白合成（1個）、光合作用（1個）和無機離子運輸與代謝（1個），另外2個蛋白質(zhì)功能未知?？寡趸惖闹饕獮長-抗壞血酸氧化酶、硫氧還蛋白h、異黃酮還原酶同系物。碳代謝與能量代謝的主要為磷酸丙酮異構(gòu)酶、ATP結(jié)合蛋白。分子伴侶類均為熱激蛋白，而細(xì)胞骨架蛋白主要為肌動族蛋白，以及Remorin蛋白。與無機離子運輸與代謝相關(guān)的蛋白是鈣調(diào)蛋白，而與光合作用相關(guān)的蛋白質(zhì)與光系統(tǒng)Ⅰ相關(guān)。

抗壞血酸氧化酶是一種存在于細(xì)胞質(zhì)中，能與細(xì)胞壁結(jié)合的含銅的酶，作為一種末端氧化酶參與一系列的氧化還原反應(yīng)。能催化抗壞血酸的氧化過程，具有抗衰老等作用，是植物體內(nèi)物質(zhì)代謝中重要的酶類。有研究表明，使用脫落酸（ABA）處理植物后，植株體內(nèi)抗壞血酸氧化酶的活性顯著提高，而ABA是類胡蘿卜素合成的前體^[12]，因此抗壞血酸氧化酶活性也影響類胡蘿卜素的合成與積累。硫氧還蛋白h主要存在植物細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體內(nèi)也有發(fā)現(xiàn)。硫氧還蛋白在谷物類種子中含量豐富，在種子萌發(fā)初期作為種子萌發(fā)的信號，導(dǎo)致水解酶抑制劑失活，從而激活絲氨酸蛋白酶活性，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解^[13]。還可參與細(xì)胞通訊、繁殖等過程。硫氧還蛋白h活性在3個品種木薯塊根成熟期都表達(dá)上調(diào)，而3個品種木薯塊根成熟期蛋白質(zhì)含量高于膨大期含量，故推測硫氧還蛋白h促進(jìn)了合成酶活性，使蛋白質(zhì)含量升高。

磷酸丙糖異構(gòu)酶在糖酵解中的作用不可替代，是有效的能量生成不可或缺的酶。ATP結(jié)合蛋白也與能量代謝相關(guān)，而‘SC9在成熟期這2個蛋白均上調(diào)表達(dá)，而‘BGM019和‘SC101分別是磷酸丙糖異構(gòu)酶與ATP結(jié)合蛋白上調(diào)表達(dá)，說明類胡蘿卜素的積累與蛋白質(zhì)的合成都是需要大量能量的代謝過程，而3個木薯品種在能量代謝的主要途徑上有相同也有不同的地方。

Remorin蛋白是一個與質(zhì)膜/脂筏相聯(lián)的植物專一性的蛋白家族，在細(xì)胞骨架和膜骨架中發(fā)揮重要作用，而且可能參與植物發(fā)育過程中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，響應(yīng)植物防御及生長發(fā)育基因的激活而磷酸化^[14]。因此，在塊根成熟期，在3個木薯品種塊根表達(dá)水平均上調(diào)，提高了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率，促進(jìn)了塊根的生長發(fā)育，提高了類胡蘿卜素及蛋白質(zhì)的積累。

鈣調(diào)蛋白（也稱鈣調(diào)素）是一種能與鈣離子相結(jié)合的蛋白，且僅在與Ca²⁺結(jié)合后才具有活性。但其可以與多種蛋白質(zhì)相結(jié)合，從而影響細(xì)胞功能的發(fā)揮。主要可參與新陳代謝、細(xì)胞內(nèi)運動、細(xì)胞凋亡等生命活動。但很多鈣調(diào)素結(jié)合蛋白本身并不能與鈣離子直接結(jié)合，但鈣離子在細(xì)胞信號傳導(dǎo)過程中作為第二信使，意義重大，因此這些鈣調(diào)素結(jié)合蛋白便利用鈣調(diào)素作為鈣感應(yīng)器和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子^[15]。轉(zhuǎn)錄以及如磷酸化、乙?；偷鞍酌附獾鹊姆g后修飾均可調(diào)節(jié)鈣調(diào)蛋白的功能^[16]。鈣調(diào)蛋白表達(dá)水平的上調(diào)提高了塊根有色體在類胡蘿卜素積累及蛋白質(zhì)合成過程中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率，使塊根迅速響應(yīng)類胡蘿卜素及蛋白質(zhì)的合成與積累機制，提高蛋白質(zhì)含量與類胡蘿卜素的積累。

很多與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)了整個過程的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，加速塊根對蛋白質(zhì)含量與有色體類胡蘿卜素積累偶聯(lián)機制的響應(yīng)，從而提高了蛋白質(zhì)含量與類胡蘿卜素含量。整個積累代謝過程是需要大量能量供應(yīng)的，從而導(dǎo)致了與能量代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)。因此，根據(jù)上述代謝過程中相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化，說明影響木薯塊根蛋白質(zhì)含量與有色體中類胡蘿卜素的積累的蛋白質(zhì)表達(dá)是一個復(fù)雜的調(diào)控過程，是由很多蛋白質(zhì)群組協(xié)同作用的結(jié)果。

4 ?結(jié)論

隨著木薯塊根發(fā)育成熟，b-胡蘿卜素含量和蛋白質(zhì)含量均呈上升趨勢，且二者之間表現(xiàn)為正相關(guān)。說明食用木薯塊根中蛋白質(zhì)含量與β-胡蘿卜素的積累可能存在一定的關(guān)聯(lián)性。3個食用木薯品種在同一生長發(fā)育時期β-胡蘿卜素含量差異達(dá)極顯著水平，‘BGM019和‘SC9蛋白質(zhì)含量差異不顯著，但顯著高于‘SC101。

以膨大期木薯塊根為對照，研究成熟期木薯塊根有色體蛋白質(zhì)表達(dá)的變化，在‘SC9成熟期塊根有色體檢測到36個差異表達(dá)蛋白質(zhì)點，其中26個上調(diào)表達(dá)，10個下調(diào)表達(dá);在‘BGM019成熟期塊根有色體檢測到49個差異表達(dá)量達(dá)2.0倍以上的蛋白質(zhì)點，其中28個上調(diào)表達(dá)，21個蛋白質(zhì)下調(diào)表達(dá);而在‘SC101成熟期塊根有色體則檢測到38個差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點，其中有20個上調(diào)表達(dá)，18個下調(diào)表達(dá)。上述差異表達(dá)蛋白質(zhì)分別參與碳代謝與能量代謝、抗氧化、蛋白質(zhì)合成、無機離子運輸與代謝等多個代謝途徑，說明木薯塊根蛋白質(zhì)含量的提高和類胡蘿卜素積累是由多個代謝途徑協(xié)同作用的結(jié)果。

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