纖維素酶輔助水蒸氣蒸餾提取肉豆蔻揮發(fā)油的品質(zhì)及其活性評(píng)價(jià)

秦宇仙，徐琳，余馮萍，黃軒語(yǔ)，李昊辰，胡濱

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安，625000)

肉豆蔻(Myristicafragrans)別名肉蔻、玉果等，為肉豆蔻科常綠高大喬木，目前在廣東、云南等地大量種植[1]。其種子呈卵珠形，在冬、夏兩季果實(shí)成熟時(shí)采收，種子中含有多種活性成分，尤其揮發(fā)油含量較高?，F(xiàn)代科學(xué)研究表明，肉豆蔻揮發(fā)油是肉豆蔻中重要的功能成分，具有抑菌、抗癌、保肝等多種功能作用[2-3]。

目前，已報(bào)道的有關(guān)肉豆蔻揮發(fā)油的提取方法有水蒸氣蒸餾提取、超臨界CO2萃取工藝、亞臨界萃取工藝、微波輔助水蒸氣蒸餾提取和超聲輔助提取工藝法等[4-5]。在這些提取方法中，均存在不同程度的缺陷，如水蒸氣蒸餾法提取時(shí)間較長(zhǎng)；超臨界CO2萃取和亞臨界萃取所需儀器設(shè)備昂貴；微波輔助提取時(shí)溫度較高，容易對(duì)揮發(fā)油產(chǎn)生過(guò)熱反應(yīng)；超聲輔助提取時(shí)熱效應(yīng)較差，不能達(dá)到提取所需要的溫度。因此，探尋操作方便，成本低廉的揮發(fā)油提取方法依然是研究熱點(diǎn)。而采用酶法輔助水蒸氣蒸餾提取肉豆蔻揮發(fā)油的工藝還未見(jiàn)報(bào)道，尤其酶法輔助水蒸氣蒸餾提取對(duì)揮發(fā)油的品質(zhì)是否產(chǎn)生影響值得深入研究。此外，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者做了大量有關(guān)植物揮發(fā)油抗氧化活性的研究，而關(guān)于肉豆蔻揮發(fā)油清除亞硝酸鹽作用和阻斷亞硝胺合成的作用還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，采用纖維素酶輔助水蒸氣蒸餾和傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾提取肉豆蔻揮發(fā)油，通過(guò)對(duì)揮發(fā)油提取率、感官特征、理化性質(zhì)、化學(xué)成分、主要官能團(tuán)結(jié)構(gòu)、熱力學(xué)性質(zhì)和肉豆蔻原料的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，再研究揮發(fā)油消除亞硝酸鹽的作用和阻斷亞硝胺合成的作用，為擴(kuò)大肉豆蔻揮發(fā)油的應(yīng)用范圍，實(shí)現(xiàn)高效利用肉豆蔻揮發(fā)油提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.2 儀器與設(shè)備

XH-JSG揮發(fā)油測(cè)定器，上海臻潯金屬制品有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，安捷倫科技有限公司；NicoletIS10傅里葉變換紅外光譜儀，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；Q200MDSC差示掃描量熱儀，美國(guó)TA儀器有限公司；Evo18掃描電子顯微鏡，德國(guó)卡爾·蔡司股份公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 肉豆蔻揮發(fā)油的提取

1.3.1.1 水蒸氣蒸餾提取

按照《中國(guó)藥典》I部(2010年)附錄XD中甲法進(jìn)行提取。稱取20 g肉豆蔻粉末置于500 mL圓底燒瓶，按一定料液比加水，連接揮發(fā)油測(cè)定器與回流冷凝管，將燒瓶置電熱套中加熱至沸騰，并保持沸騰300 min，至測(cè)定器中油量不再增加。揮發(fā)油提取率計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：c為提取率，%；m1為揮發(fā)油體積，mL；ρ為揮發(fā)油密度，g/mL；m2為肉豆蔻粉末質(zhì)量，g。

1.3.1.2 酶法輔助水蒸氣蒸餾提取

動(dòng)力系統(tǒng)是艦船的一個(gè)重要子系統(tǒng)。船舶動(dòng)力系統(tǒng)在各種工況下均可連續(xù)、可靠、高質(zhì)量運(yùn)行，它不僅是保證艦船發(fā)揮其效能的必要條件，也是保證艦船生命力和重要設(shè)備生命力的必要條件。因此，提高動(dòng)力系統(tǒng)(主要是推進(jìn)式異步電動(dòng)機(jī))在船體遭受波浪、水下爆炸等沖擊載荷作用下的抗沖擊能力，就相應(yīng)提高了動(dòng)力系統(tǒng)的穩(wěn)定性，同時(shí)提高了整個(gè)艦船和重要設(shè)備的生命力[1]。

稱取20 g肉豆蔻粉末于具塞燒瓶中，加入一定體積的水，調(diào)節(jié)溫度和pH，再按照肉豆蔻粉末質(zhì)量加入一定量纖維素酶，蓋塞，在水浴恒溫振蕩器中進(jìn)行酶解；酶解完成后，連接揮發(fā)油測(cè)定器和冷凝管，采用電熱套加熱至微沸，進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取。揮發(fā)油提取率按公式(1)計(jì)算。單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)確定的纖維素酶輔助水蒸氣蒸餾提取肉豆蔻揮發(fā)油的最佳提取工藝條件為：酶添加量1.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，pH 4.0，酶解溫度45 ℃，液料比13∶1(mL∶g)，酶解時(shí)間47 min，蒸餾時(shí)間193 min，進(jìn)行蒸餾提取。

1.3.2 肉豆蔻粉末的掃描電鏡觀察

將未提取處理、水蒸氣蒸餾提取和纖維素酶輔助水蒸氣蒸餾提取后的肉豆蔻粉末經(jīng)真空干燥后，作噴金處理，用掃描電子顯微鏡觀察其微觀結(jié)構(gòu)的變化。

1.3.3 肉豆蔻揮發(fā)油感官品質(zhì)及其基本理化指標(biāo)測(cè)定

1.3.3.1 感官品質(zhì)評(píng)價(jià)

將2種方法提取的揮發(fā)油按照GB/T 14454.2—2008 《香料 香氣評(píng)定法》第2法成對(duì)比較檢驗(yàn)法測(cè)定。

1.3.3.2 理化指標(biāo)測(cè)定

將2種方法提取的肉豆蔻揮發(fā)油按GB/T 11540—2008 《香料 相對(duì)密度的測(cè)定》、GB/T 14454.6—2008《香料 蒸發(fā)后殘留物含量的評(píng)估》、GB/T 14455.5—2008 《香料 酸值或含酸量的測(cè)定》、GB/T 14455.6—2008 《香料 酯值或含酯量的測(cè)定》和GB/T 33918—2017 《香料 過(guò)氧化值的測(cè)定》分別測(cè)定相對(duì)密度、蒸發(fā)后殘留物含量、酸值、酯值和過(guò)氧化值；按GB/T 14455.5測(cè)得的酸值加上按GB/T 14455.6測(cè)得的酯值計(jì)算皂化值。

1.3.4 GC-MS測(cè)定

參考李力等[6]方法稍作修改，分析條件如下：GC條件：HP-5MS彈性石英毛細(xì)管柱(柱長(zhǎng)30 m，膜厚0.25 μm，內(nèi)徑0.25 mm)；載氣為高純氦氣，流速為1 mL/min。進(jìn)樣量1 μL，進(jìn)樣口溫度250 ℃，分流比20∶1；升溫程序：起始溫度50 ℃，保持5 min，以5 ℃/min 速率升至230 ℃，保持10 min。MS條件：電子轟擊(electron impact，EI)離子源，電子能量70 eV，GC與MS接口溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；電子檢測(cè)器檢測(cè)電壓350 V；質(zhì)量掃描范圍50～550 amu。

1.3.5 紅外光譜測(cè)定

采用溴化鉀片涂布法：取2 μL肉豆蔻揮發(fā)油均勻涂布在KBr窗片上，放入樣品槽。掃描范圍400～4 000 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)32次，用KBr鹽窗作背景采集。

1.3.6 差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry,DSC)測(cè)定

將肉豆蔻揮發(fā)油樣品10 μL裝入微型液體鋁坩堝中，加上坩堝蓋，將其密封后放入樣品室內(nèi)，用空坩堝作空白對(duì)照，DSC分析在高純氮?dú)鈿夥毡Ｗo(hù)下進(jìn)行。溫度在-50～300 ℃，升溫速率為10 ℃/min，流速為50 mL/min，記錄其吸熱和放熱曲線。

1.3.7 肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)亞硝酸鹽清除率的測(cè)定

參考廖曉峰等[7]的方法：將0.5 mol/L的檸檬酸鈉-鹽酸緩沖液(pH 3.0)5 mL置于10 mL容量瓶中，加入100 mg/L的NaNO2溶液1 mL，分別加入提取液(0、100、200、300、400、500、600、700、800 μg，下同)，定容至刻度，37 ℃下反應(yīng)1 h。取1 mL反應(yīng)液于50 mL容量瓶，加入0.4%對(duì)氨基苯磺酸溶液2 mL，0.2%鹽酸萘乙胺溶液1 mL，搖勻放置15 min后，于540 nm處測(cè)吸光度值A(chǔ)x，同時(shí)測(cè)定保溫反應(yīng)時(shí)不加揮發(fā)油的空白試驗(yàn)的吸光值A(chǔ)0。所有樣品平行測(cè)定3次，取平均值。測(cè)定結(jié)果以清除率(E)表示，清除率計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

1.3.8 肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)亞硝胺阻斷率的測(cè)定

參考廖曉峰等[7]的方法，分別取不同用量肉豆蔻揮發(fā)油于25 mL比色管中，加入pH 3.0檸檬酸—磷酸氫二鈉緩沖液10 mL，1 mmol/L NaNO2溶液和二甲胺溶液各1.0 mL，稀釋至刻度并于37 ℃恒溫水浴1 h。然后吸取1.0 mL上述反應(yīng)液至50 mL燒杯，加入0.5%Na2CO3溶液0.5 mL，于紫外分析儀上照15 min；取出后加入1%對(duì)氨基苯磺酸1.5 mL、0.1% α-萘胺1.5 mL和蒸餾水0.5 mL，靜置15 min，525 nm 下測(cè)吸光度A1，同時(shí)測(cè)定以去離子水代替NaNO2標(biāo)液的空白試驗(yàn)吸光度A2，及以去離子水代VOMF的空白試驗(yàn)吸光度A0。所有樣品平行測(cè)定3次，取平均值。測(cè)定結(jié)果以阻斷率(B)表示，阻斷率計(jì)算如公式(3)所示：

(3)

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種方法肉豆蔻揮發(fā)油提取率的比較

由表1可知，水蒸氣蒸餾耗時(shí)300 min的提取率為9.15%，纖維素酶輔助水蒸氣蒸餾耗時(shí)240 min的提取率為10.69%，比水蒸氣蒸餾法提高了16.83%，說(shuō)明此方法不僅能明顯縮短水蒸氣蒸餾的時(shí)間、節(jié)約能耗，還顯著提高了肉豆蔻揮發(fā)油的提取率。

表1 兩種方法提取率的比較Table 1 Comparison of extraction rate of two methods

2.2 兩種提取方法對(duì)肉豆蔻原料微觀結(jié)構(gòu)的影響

由圖1可知，提取前后肉豆蔻原料微觀結(jié)構(gòu)存在明顯差異，未提取處理樣品(圖1-a)的整體外部形狀相對(duì)完整，結(jié)構(gòu)緊密沒(méi)有明顯破壞；水蒸氣蒸餾提取后(圖1-b)肉豆蔻的表面結(jié)構(gòu)被明顯破壞，出現(xiàn)部分孔洞。相比水蒸氣蒸餾，纖維素酶處理后(圖1-c)肉豆蔻的表面結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞，變得雜亂無(wú)序和松散，出現(xiàn)更多孔洞、碎塊和不規(guī)則的腔。CHANDRAN等[8]在研究酶預(yù)處理對(duì)從香料(即黑胡椒和豆蔻)中提取活性化合物的影響時(shí)，通過(guò)微觀結(jié)構(gòu)觀察證實(shí)了酶的作用能破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，促進(jìn)釋放細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)。BABY等[9]在研究酶前處理對(duì)茴香揮發(fā)油提取率的影響時(shí)觀察了酶對(duì)茴香種子細(xì)胞壁的影響，也發(fā)現(xiàn)了經(jīng)酶處理過(guò)的茴香種子微觀結(jié)構(gòu)明顯發(fā)生破裂。尤其纖維素酶輔助水蒸氣蒸餾提取的耗時(shí)明顯短于水蒸氣蒸餾提取，但是其原料微觀結(jié)構(gòu)的破裂程度卻比水蒸氣蒸餾更加嚴(yán)重。因此，肉豆蔻揮發(fā)油提取率增加和提取時(shí)間縮短的主要原因是纖維素酶對(duì)原料細(xì)胞壁進(jìn)行了降解，使被束縛在細(xì)胞內(nèi)的有效成分充分溶出，從而使得揮發(fā)油得到快速提取。

a-未經(jīng)處理組；b-水蒸氣蒸餾處理組；c-酶法輔助水蒸氣蒸餾處理組圖1 未經(jīng)處理、水蒸氣蒸餾處理、酶法輔助水蒸氣蒸餾 處理提取后的肉豆蔻原料的電鏡掃描觀察Fig.1 Scanning electron microscope observation of nutmeg powder extracted by untreated, steam distillation and enzyme assisted steam distillation

2.3 兩種方法提取肉豆蔻揮發(fā)油的感官品質(zhì)及其基本理化指標(biāo)比較

由表2可知，2種方法提取的肉豆蔻揮發(fā)油都具有較好的感官品質(zhì)，為無(wú)色透明、擁有純正肉豆蔻香味的油狀液體。其他的理化指標(biāo)也非常相近，表明纖維素酶輔助水蒸氣蒸餾提取對(duì)肉豆蔻揮發(fā)油的理化性質(zhì)沒(méi)有任何決定性影響。GIBBINS等[10]在做響應(yīng)面法優(yōu)化酶輔助水提取紅花油時(shí)也有同樣的結(jié)論。肉豆蔻揮發(fā)油比水輕，2種方法提取的揮發(fā)油相對(duì)密度均在0.850～1.065 g/mL正常區(qū)間內(nèi)。蒸發(fā)后殘留物含量均在1.30%左右，說(shuō)明肉豆蔻揮發(fā)油的揮發(fā)性較好，且提取的揮發(fā)油純度較高。酸值和過(guò)氧化值均較低，說(shuō)明肉豆蔻揮發(fā)油的抗氧化性好，品質(zhì)純正[11]。

表2 兩種方法提取的揮發(fā)油感官品質(zhì)和基本理化指標(biāo)比較Table 2 Comparison of sensory quality and basic physical and chemical indexes of volatile oil extracted by two methods

2.4 兩種方法提取肉豆蔻揮發(fā)油的化學(xué)成分比較

利用NIST11質(zhì)譜數(shù)據(jù)檢索標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)解析成分，以相似度>85%作為結(jié)果確認(rèn)依據(jù)，小于該值即定義為未知，以峰面積歸一法計(jì)算各組分相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。成分解析結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，兩種方法提取的肉豆蔻揮發(fā)油中組成成分種類和含量基本相同。水蒸氣蒸餾提取的揮發(fā)油總共鑒定出占揮發(fā)油含量94.85%的38種化合物，纖維素酶輔助提取的揮發(fā)油共鑒定出占揮發(fā)油含量94.31%的42種化合物。2種方法提取得肉豆蔻揮發(fā)油的主要成分均是萜烯類、醇類、醚類、酯類、酚類化合物，其中β-松油烯和肉豆蔻醚含量最高。王瑩等[12]在分析商品肉豆蔻揮發(fā)油的化學(xué)成分時(shí)得出肉豆蔻醚和萜類化合物是其主要成分的結(jié)論，DUPUY等[13]在分析肉豆蔻精油成分也得出了類似結(jié)論，與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)論相符。GC-MS結(jié)果表明，纖維素酶處理后對(duì)肉豆蔻揮發(fā)油的化學(xué)成分和含量并沒(méi)有顯著影響，可以為酶法輔助水蒸氣蒸餾提取提供參考。

表3 兩種方法提取肉豆蔻揮發(fā)油的化學(xué)成分分析Table 3 Chemical composition analysis of volatile oil from nutmeg extracted by two methods

2.5 兩種方法提取肉豆蔻揮發(fā)油的紅外光譜比較

a-水蒸氣蒸餾法；b-纖維素酶輔助水蒸氣蒸餾法圖2 兩種方法提取的肉豆蔻揮發(fā)油紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectrum of volatile oil extracted from nutmeg by two methods

2.6 兩種方法提取肉豆蔻揮發(fā)油的熱力學(xué)性質(zhì)比較

DSC是一種消耗更少的時(shí)間和樣本，可以快速表征物質(zhì)熱力學(xué)特性的熱分析方法[16]。由圖3可知，在升溫過(guò)程中，兩種方法提取的油樣均只出現(xiàn)了1個(gè)吸熱峰，峰值溫度均在210 ℃左右，油樣在高溫作用下吸熱汽化，形成了明顯的吸熱峰。在降溫過(guò)程中，2個(gè)油樣均無(wú)放熱峰，原因是肉豆蔻揮發(fā)油已經(jīng)揮發(fā)完全，無(wú)法形成放熱峰。由于兩種方法提取的肉豆蔻揮發(fā)油的吸熱和放熱曲線整體形狀、峰型均相似，表明纖維素酶處理對(duì)肉豆蔻揮發(fā)油的熱力學(xué)性質(zhì)沒(méi)有影響。

2.7 肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)亞硝酸鹽清除作用的影響

由圖4可知，兩種方法提取肉豆蔻揮發(fā)油均對(duì)NaNO2有明顯清除作用，且隨著濃度增大清除率逐漸增大，在一定濃度范圍內(nèi)具有量效關(guān)系。整體上來(lái)看，酶法輔助提取揮發(fā)油對(duì)NaNO2的清除能力略大于水蒸氣蒸餾提取揮發(fā)油對(duì)NaNO2的清除能力，差異不顯著(P>0.05)。當(dāng)肉豆蔻揮發(fā)油用量為800 μg時(shí)，兩種方法提取的肉豆蔻揮發(fā)油的清除率分別達(dá)到69.34%和73.89%。鄭立輝等[17]在研究白芷精油對(duì)NaNO2的清除作用時(shí)認(rèn)為不飽和雙鍵在清除NaNO2時(shí)起到了重要作用。而肉豆蔻揮發(fā)油的組成成分復(fù)雜，又含較多萜烯類、烯醇類和酚類等化合物，具有一定還原能力，所以肉豆蔻揮發(fā)油具有清除亞硝酸鹽的能力。

a-水蒸氣蒸餾法；b-纖維素酶輔助水蒸氣蒸餾法圖3 兩種方法提取肉豆蔻揮發(fā)油的DSC曲線Fig.3 DSC diagram of nutmeg volatile oil extracted by two methods

圖4 兩種方法提取揮發(fā)油對(duì)NaNO2的清除作用Fig.4 Scavenging effect of volatile oil extracted by two methods on sodium nitrite

2.8 肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)阻斷亞硝胺合成作用的影響

由圖5可知，隨著肉豆蔻揮發(fā)油用量的增加，揮發(fā)油對(duì)亞硝胺合成的阻斷率增加，當(dāng)用量從100 μg增加至500 μg時(shí)，阻斷率隨用量的增加明顯提高，之后隨著揮發(fā)油用量的增加，阻斷率趨于平穩(wěn)。當(dāng)揮發(fā)油用量為800 μg時(shí)，兩種方法提取的肉豆蔻精油的阻斷率分別達(dá)到74.80%和76.92%，兩者差異不明顯，整體上來(lái)看，后者略大于前者。與清除率相比，阻斷率隨濃度而增加的趨勢(shì)更陡峭，但在相同用量下，阻斷率與清除率比較相近。姚新成等[18]報(bào)道了新疆兩色金雞菊揮發(fā)油具有很強(qiáng)抑制亞硝胺形成的能力，其原因是具有抗氧化功能的揮發(fā)油能夠阻斷亞硝酸鹽與次級(jí)胺結(jié)合的過(guò)程。而現(xiàn)代研究表明，肉豆蔻揮發(fā)油具有一定抗氧化能力[19-20]。由此可知，肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)亞硝胺的合成具有明顯阻斷作用。

圖5 兩種方法提取揮發(fā)油阻斷亞硝胺合成的能力Fig.5 The ability of volatile oil extracted by two methods to block the synthesis of nitrosamine

3 結(jié)論

(1)肉豆蔻揮發(fā)油的酶法輔助水蒸氣蒸餾提取與水蒸氣蒸餾提取相比，不僅提取率高，而且還明顯節(jié)約提取時(shí)間，降低了能耗。通過(guò)對(duì)原料微觀結(jié)構(gòu)觀察表明，纖維素酶對(duì)原料細(xì)胞壁的水解是促進(jìn)酶法輔助水蒸氣蒸餾快速提取的主要原因。

(2)通過(guò)對(duì)肉豆蔻揮發(fā)油的感官品質(zhì)、理化性質(zhì)、GC-MS、紅外光譜分析和DSC分析表明，酶法輔助水蒸氣蒸餾提取沒(méi)有對(duì)肉豆蔻揮發(fā)油的感官品質(zhì)、基本理化性質(zhì)、化學(xué)組成、主要官能團(tuán)結(jié)構(gòu)和熱力學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生影響。

(3)兩種方法提取的肉豆蔻揮發(fā)油均有較好的清除NaNO2能力和阻斷亞硝胺合成的作用，且酶法輔助水蒸氣蒸餾法提取的肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)亞硝酸鹽的清除作用稍強(qiáng)。肉豆蔻揮發(fā)油清除NaNO2能力和對(duì)亞硝胺合成的阻斷能力隨著揮發(fā)油用量增加而增強(qiáng)。

因此，酶法輔助水蒸氣蒸餾是提取肉豆蔻揮發(fā)油的有效方法。