葡萄酵素發(fā)酵過程中的酵母菌篩選及品質(zhì)變化分析

王印壯，丁玉峰，段定定，馬艷莉*，牟建樓*，劉亞瓊

1(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，河北 保定，071000)2(南陽理工學(xué)院，河南 南陽，473000)

根據(jù)QB/T 5323—2018《植物酵素》規(guī)定，食用植物酵素是指以可用于食品加工的植物為主要原料，添加或不添加輔料，經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分可供人類使用的酵素產(chǎn)品。其含多種功效酶[1]，多酚類物質(zhì)[2]，有機(jī)酸、氨基酸以及維生素[3-4]等活性成分，使得食用植物酵素具有潤腸通便[1]，清除自由基、抗氧化[4]，解酒護(hù)肝[5]等生理功能。隨著公眾健康意識的增強(qiáng)，酵素產(chǎn)品倍受推崇。葡萄(VitisviniferaL.)為葡萄科葡萄屬落葉藤本植物，廣泛分布于溫帶及亞熱帶地區(qū)[6]。由于其具有較高的食用、藥用及營養(yǎng)價(jià)值而受到公眾歡迎[7]，據(jù)2019年國家統(tǒng)計(jì)局?jǐn)?shù)據(jù)，我國葡萄年產(chǎn)量達(dá)1 419.54萬 t。但其季節(jié)性較強(qiáng)，多汁皮薄含糖量高，采后貯藏期短、易腐爛變質(zhì)，因此葡萄采后深加工對其提高附加值、拓寬市場極為重要，目前產(chǎn)品多以葡萄酒、葡萄干、葡萄果汁等為主。而以葡萄為原料開發(fā)新型酵素產(chǎn)品，不僅可以最大限度保留葡萄固有營養(yǎng)物質(zhì)，還可增加新的活性成分，是集營養(yǎng)、保健、食療等功能于一身的產(chǎn)品，具有廣泛的市場前景[6]。蔣增良等[8-9]通過研究葡萄酵素自然發(fā)酵過程中抗氧化性能的變化及其與有機(jī)酸之間的關(guān)系，表明葡萄酵素在發(fā)酵過程中具有良好的抗氧化性與自由基清除能力，整體呈上升趨勢，并且發(fā)現(xiàn)其功能與有機(jī)酸、多酚以及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)等的協(xié)同作用有關(guān)。但自然發(fā)酵不易控制，易染雜菌且發(fā)酵時(shí)間長，因此安全可控的接種發(fā)酵技術(shù)可為實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

目前，研究表明食用植物酵素發(fā)酵過程中優(yōu)勢微生物主要為酵母菌、醋酸菌和乳酸菌[3]。首先，基質(zhì)中的各種微生物及酶類將多糖分解為單糖，葡萄糖在酵母菌作用下轉(zhuǎn)化為乙醇，同時(shí)，也可在醋酸菌的作用下轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸，并且將乙醇轉(zhuǎn)化為乙酸，基質(zhì)糖濃度下降，此過程伴隨著酶類的釋放，如蛋白酶、淀粉酶以及SOD等，因此酵母菌和醋酸菌在發(fā)酵過程中具有互利共生關(guān)系[10]。乳酸菌則能產(chǎn)生豐富的有機(jī)酸，改善酵素風(fēng)味，同時(shí)作為有益菌還有維持人體腸道菌群平衡、提高免疫力、促進(jìn)蛋白質(zhì)和鎂元素吸收等作用[4]。LUCENA-PADRS等[11]利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳(PCR-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE)技術(shù)研究了西班牙綠橄欖發(fā)酵過程中的微生物變化，檢測出乳酸菌、馬內(nèi)桿菌和丙酸桿菌，其中乳酸菌為整個(gè)發(fā)酵過程的優(yōu)勢菌。王海英[12]利用16S和18S測序技術(shù)分析了番木瓜自然發(fā)酵過程中微生物組成，并從中篩選出2株優(yōu)勢植物乳桿菌菌種以及2株優(yōu)勢畢赤酵母菌種用于發(fā)酵番木瓜酵素，結(jié)果表明接種發(fā)酵的番木瓜酵素抗氧化能力高于自然發(fā)酵。

本研究通過探究不同酵母菌發(fā)酵葡萄過程中物質(zhì)變化規(guī)律，篩選出適合葡萄發(fā)酵的酵母菌，然后將其與醋酸菌、乳酸菌進(jìn)行依次接種發(fā)酵制備葡萄酵素，分析該過程中γ-氨基丁酸、有機(jī)酸、香氣成分等的變化規(guī)律，旨在明確接種發(fā)酵對葡萄酵素品質(zhì)的影響，從而為葡萄酵素發(fā)酵條件的優(yōu)化以及品質(zhì)的提升提供理論基礎(chǔ)，為實(shí)現(xiàn)其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

夏黑葡萄(SummerBlack)，河南南陽社旗縣；釀酒酵母 CL-13、JL-11、JL-24、XQ-05、發(fā)酵畢赤酵母 CL-03、庫德里畢赤酵母 CL-19、曼束里卡畢赤酵母 JL-25，河南省工業(yè)微生物菌種保藏中心；巴氏醋桿菌CGMCC 1.41、植物乳桿菌ACCC 11095，北京生物保藏中心。

MRS肉湯(BR)，北京奧博星生物技術(shù)公司；3,5-二硝基水楊酸(AR)，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；草酸、酒石酸、蘋果酸、丙酮酸、乳酸、乙酸、檸檬酸(HPLC級)，美國Sigma公司；三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二鈉、鄰苯三酚、對硝基苯酚(HPLC級)，上海科密歐公司。

1.2 培養(yǎng)基

YEPD培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母浸出粉10，121 ℃下滅菌20 min(固體培養(yǎng)基，再加入15 g/L瓊脂粉)。

許氏醋酸菌種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖5，酵母浸出粉5，121 ℃下滅菌20 min，冷卻后加入30 mL無水乙醇。

1.3 儀器與設(shè)備

GC-7890氣相色譜儀、7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、Agilent 1260高效液相色譜儀，美國Agilent儀器有限公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭，美國Supelco公司；CR-400色差計(jì)，日本柯尼卡美能達(dá)公司；UV-752 N紫外可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 發(fā)酵基質(zhì)制備

挑選無機(jī)械傷、病害的新鮮葡萄，洗凈、晾干、打漿后倒入滅菌后的玻璃罐中，添加紅糖至糖度為18 °Bx，用75 mg/mL的果膠酶(酶活力500 U/mg)于50 ℃下酶解40 min。之后100 ℃滅菌15 min[6,13]，為避免轉(zhuǎn)移過程污染雜菌再置于超凈工作臺上紫外殺菌15 min，冷卻至室溫，得發(fā)酵基質(zhì)。

1.4.2 酵母菌篩選

1.4.2.1 酵母菌液制備

活化：將甘油管中的7株酵母菌，分別取20 μL涂布于YEPD固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2～3 d，挑取單菌落，接種于液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)36 h，得酵母菌活化液，菌液濃度>106CFU/mL。

生長曲線測定：采用比濁法，將7種酵母菌活化液，分別以3%接種量接種于液體培養(yǎng)基中，置于28 ℃、150 r/min下?lián)u床培養(yǎng)，并于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h測定其OD600值，以未接種活化液YEPD培養(yǎng)基為對照，繪制生長曲線[14]。

分別將7株酵母菌對數(shù)生長期末期的菌液進(jìn)行收集，做接種用酵母菌液。

1.4.2.2 不同酵母菌發(fā)酵

將7種酵母菌液，分別以5%接種量接種于發(fā)酵基質(zhì)中，常溫避光發(fā)酵6 d，每隔1 d取樣，分析不同酵母菌發(fā)酵特性與主要功效酶活性的動態(tài)變化。

1.4.3 葡萄酵素制備

將篩選出的酵母菌于對數(shù)生長期末期收集，制備酵母菌液；將前期試驗(yàn)篩選出的醋桿菌、乳桿菌，按1.4.2.1中的方法培養(yǎng)至對數(shù)生長期末期(醋桿菌于30 ℃，180 r/min搖床培養(yǎng)48 h；乳桿菌于37 ℃、200 r/min 搖床培養(yǎng)22 h)收集，制備醋酸菌液、乳酸菌液。

將3%酵母菌液接入發(fā)酵基質(zhì)中，發(fā)酵6 d，再接入5%醋酸菌液，發(fā)酵至第27天，過濾除菌，最后接入3%乳酸菌液，發(fā)酵至第41天。分別于第0、3、6、13、20、27、34、41天取樣。為避免雜菌污染所有操作均在超凈工作臺中進(jìn)行。

1.4.4 發(fā)酵特性測定

采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定還原糖含量[15]；參照陳玉香等[16]的方法測定乙醇含量；參照GB 12456—2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總酸的測定》測定總酸含量；利用酸度計(jì)測定pH值。

1.4.5 主要功效酶活性測定

采用GB/T 5009.171—2003中鄰苯三酚自氧化法測定SOD活性；參照侯曉瑞[17]的方法測定β-葡萄糖苷酶活性。

1.4.6 顏色評估

采用色差計(jì)和CIELab 顏色空間分析顏色變化[18]，其中L*描述從黑色到白色的亮度范圍，a*表示紅色到綠色、b*表示黃色到藍(lán)色的變化情況，色度(CI)為A420、A520和A620之和，色調(diào)(Hue)為A420/A520的比值。

1.4.7 有機(jī)酸含量測定

樣品前處理：將2.5 mL樣品與1 mL 10.6%的K4Fe(CN)6·3H2O溶液、1 mL 30.0%的ZnSO4溶液混合，用去離子水定容至50 mL，反應(yīng)30 min后取上清液離心，然后經(jīng)0.45 μm膜和C18柱過濾，待測[19]。

色譜檢測條件：色譜柱Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm×5 μm)，進(jìn)樣量10 μL，流速0.9 mL/min，流動相0.02 mol/L NaH2PO4(用磷酸調(diào)pH至2.1)，柱溫30 ℃，二極管陣列檢測器，波長210 nm[20]。

1.4.8 γ-氨基丁酸含量測定

參照QB/T 4587—2013《γ-氨基丁酸》中的方法測定。

1.4.9 香氣成分測定

采用頂空固相微萃取法對香氣成分進(jìn)行富集。將7.5 mL樣品、1 g NaCl和25 μL 300 μg/mL的3-辛醇置于20 mL頂空瓶中，40 ℃水浴平衡15 min后插入纖維頭吸附40 min，再放入GC進(jìn)樣器中解析6 min。

檢測條件參照AUBERT等[21]氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法稍作修改。色譜柱HP-INNOWax毛細(xì)管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，烘箱升溫程序：50 ℃保持2 min，以3 ℃/min升溫至80 ℃，再以5 ℃/min升溫至230 ℃，保持6 min，注射器溫度240 ℃，載氣(氦氣)流量1.45 mL/min，分流比5∶1，離子源和質(zhì)譜傳輸線溫度分別為240、250 ℃，電子能量70 eV，質(zhì)量范圍33～550m/z。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用IBM SPSS Statistics 26對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(P<0.05)及LSD、Duncan多重比較分析，采用Origin 2019進(jìn)行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌篩選

2.1.1 不同酵母菌生長曲線分析

酵母菌生長曲線一般分為4個(gè)時(shí)期，在制備酵素時(shí)，酵母菌最佳收集菌體接種時(shí)間為對數(shù)生長期末期，故通過測定7株酵母菌生長曲線，確定最佳收集菌體接種時(shí)間[22]。由圖1可知，JL-25、CL-03于20 h，JL-11、JL-24、XQ-05、CL-13于14 h，CL-19于16 h左右進(jìn)入對數(shù)生長期末期。因此，確定20 h為JL-25、CL-03的收集接種時(shí)間，14 h為JL-11、JL-24、XQ-05、CL-13，16 h為CL-19的收集接種時(shí)間。

圖1 不同酵母菌的生長曲線Fig.1 Growth curve of different yeasts

2.1.2 不同酵母菌發(fā)酵特性分析

糖類是酵母菌生長代謝的主要碳源，通過糖代謝可生成酒精等代謝產(chǎn)物，還原糖、乙醇含量的變化不僅能反映出微生物生長代謝情況，還可直接影響產(chǎn)品風(fēng)味[23]。由圖2-a、圖2-b可知，不同酵母菌在發(fā)酵過程中還原糖含量逐漸下降，其中JL-11、JL-24、CL-13和XQ-05在發(fā)酵基質(zhì)中適應(yīng)能力強(qiáng)，發(fā)酵速度快，第2天時(shí)含量即趨于0，同時(shí)，酒精度也于第2天達(dá)到最大值，之后趨于穩(wěn)定；JL-25、CL-3和CL-19適應(yīng)能力弱，發(fā)酵時(shí)間較長，還原糖含量分別于第4、5、6天趨于0。不同酵母菌發(fā)酵結(jié)束時(shí)酒精含量在8.00%vol左右?？偹岫群蚿H的變化可反映發(fā)酵過程是否正常。由圖2-c、圖2-d可知，不同酵母菌在發(fā)酵過程中總酸度總體呈升高趨勢，pH值則與之相反，其中釀酒酵母XQ-05相較于其他菌株產(chǎn)酸能力穩(wěn)定，受基質(zhì)酸度影響不大，表現(xiàn)出較強(qiáng)發(fā)酵產(chǎn)酸性能與基質(zhì)適應(yīng)能力，在發(fā)酵第6天時(shí)總酸含量顯著高于其他菌株(P<0.05)且pH最低為3.50。

2.1.3 不同酵母菌主要功效酶活性分析

由表1可知，7株酵母菌在發(fā)酵過程中，SOD活力呈先上升后下降再上升趨勢，下降的原因可能是由于酵母菌正處于快速生長時(shí)期，密度增高以及衰老時(shí)消耗次級代謝產(chǎn)物，使得SOD活力降低[24]，其中XQ-05 于第2天達(dá)到最大值58.06 U/mL，其余菌株均在第6天達(dá)到最大值，表明其產(chǎn)酶速度相較于其他菌株快。β-葡萄糖苷酶對酵素香氣成分的形成有重要作用[25]，由表2可知，不同酵母菌產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的能力有顯著差異(P<0.05)，JL-11和JL-24僅在發(fā)酵第2天檢出，CL-19和CL-13在發(fā)酵過程中未檢出、CL-03和JL-25呈不穩(wěn)定的波動趨勢，而XQ-05在發(fā)酵過程中β-葡萄糖苷酶活性穩(wěn)步升高，并于第5天增至518.06 μU/mL。這可能是由于不同酵母菌合成、釋放β-葡萄糖苷酶的能力及所處發(fā)酵環(huán)境的影響所導(dǎo)致[17]。

a-還原糖；b-酒精度；c-總酸；d-pH值圖2 不同酵母菌發(fā)酵過程中還原糖、酒精度、總酸和pH值的變化Fig.2 Changes of reducing sugar, alcohol, total acid and pH of different yeasts during fermentation 注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

表1 不同酵母菌發(fā)酵過程中SOD活力的變化 單位：U/mL

表2 不同酵母菌發(fā)酵過程中β-葡萄糖苷酶活力的變化 單位：μU/mL

綜上分析7株酵母菌發(fā)酵過程中物質(zhì)變化規(guī)律可知，釀酒酵母XQ-05在葡萄基質(zhì)中適應(yīng)性強(qiáng)，發(fā)酵速度快，產(chǎn)酶能力較強(qiáng)且穩(wěn)定，適合葡萄酵素快速發(fā)酵生產(chǎn)，可用于進(jìn)一步研究。

2.2 葡萄酵素品質(zhì)特性分析

將篩選出的釀酒酵母XQ-05與巴氏醋桿菌、植物乳桿菌依次接種發(fā)酵制備葡萄酵素。經(jīng)測定，發(fā)酵結(jié)束后其各項(xiàng)基本理化指標(biāo)，如還原糖含量0.46 g/L，酒精度(0.47±0.02)%vol，總酸含量(19.09±0.36)g/L，pH(3.19±0.03)等，均滿足QB/T 5323—2018《植物酵素》規(guī)定的要求。

2.2.1 葡萄酵素發(fā)酵過程中顏色的變化

顏色是葡萄酵素最直觀的感官特征，主要呈色物質(zhì)為花色苷，其組成和含量對酵素色澤有顯著影響，花色苷不穩(wěn)定在發(fā)酵中易受pH值、溫度和微生物等因素的影響，顏色特征能夠反映出酵素發(fā)酵工藝和原料的好壞，也是人們接受度的重要參考指標(biāo)[26]。由表3可知，發(fā)酵過程中，a*值在0.40～2.15內(nèi)波動，發(fā)酵結(jié)束時(shí)顏色偏紅；b*值在-4.29～2.34內(nèi)變化；第41天時(shí)樣品亮度(L*)顯著的高于其他樣品(P<0.05)。ΔE表示總色差，反映葡萄酵素在發(fā)酵過程中與葡萄汁相比顏色的變化程度，發(fā)現(xiàn)第41天時(shí)樣品色差最大，其次是第20和27天的樣品，表明接種發(fā)酵改變了葡萄酵素的顏色，這可能是由于發(fā)酵過程中酚類物質(zhì)的轉(zhuǎn)變和發(fā)酵基質(zhì)酸堿度的變化所導(dǎo)致[27]。葡萄酵素發(fā)酵過程中CI和Hue呈先降低后升高的趨勢，與對照相比，發(fā)酵結(jié)束后色調(diào)升高，色度降低。

表3 葡萄酵素發(fā)酵過程中顏色的變化Table 3 Changes of color during fermentation of grape Jiaosu

2.2.2 葡萄酵素發(fā)酵過程中γ-氨基丁酸的變化

γ-氨基丁酸是一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有改善腦功能、降血壓、促進(jìn)生長激素分泌等功能，為新型功能食品因子[3]。由圖3可知，葡萄酵素發(fā)酵過程中γ-氨基丁酸含量呈逐漸上升趨勢，發(fā)酵前3 d即酵母菌發(fā)酵前期，γ-氨基丁酸含量增長速度較快，而后(3～20 d)逐漸減慢，這可能是由于前期酵母菌生長代謝旺盛，分泌的蛋白酶活性高，故合成γ-氨基丁酸的速率較快，隨著發(fā)酵進(jìn)行，酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生乙醇、醋酸菌發(fā)酵產(chǎn)生乙酸等代謝產(chǎn)物，使得發(fā)酵基質(zhì)環(huán)境發(fā)生改變，導(dǎo)致其合成的關(guān)鍵酶谷氨酸脫羧酶活性下降，故增加速度減慢[28]。第27天后，隨著乳酸菌發(fā)酵的作用，γ-氨基丁酸含量持續(xù)增加，發(fā)酵結(jié)束時(shí)達(dá)到38.95 μg/mL，顯著高于其他發(fā)酵時(shí)間樣品(P<0.05)，符合QB/T 5323—2018中規(guī)定的γ-氨基丁酸含量≥0.03 mg/kg的要求。葡萄酵素在接種發(fā)酵過程中，γ-氨基丁酸主要在酵母菌發(fā)酵階段產(chǎn)生，因此，在后續(xù)優(yōu)化葡萄酵素品質(zhì)時(shí)，可對酵母菌發(fā)酵階段的參數(shù)進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而提高葡萄酵素γ-氨基丁酸含量。

圖3 葡萄酵素發(fā)酵過程γ-氨基丁酸的變化Fig.3 Changes of γ-aminobutyric acid content during fermentation of grape Jiaosu

2.2.3 葡萄酵素發(fā)酵過程中SOD活力的變化

食用植物酵素富含多種功效酶類，例如淀粉酶、蛋白酶和SOD等。其中SOD常被用來評價(jià)酵素酶活性的高低[1]。因此，分析葡萄酵素發(fā)酵過程中SOD活力的變化具有重要意義。如圖4所示，葡萄酵素發(fā)酵過程中SOD活力整體呈升高趨勢，分析其原因主要是由于發(fā)酵過程中基質(zhì)環(huán)境的改變以及微生物不斷分泌相應(yīng)的功效酶等因素，從而使得SOD活力逐漸升高[22]。發(fā)酵前20 d，SOD活力變化不顯著(P>0.05)，為22.89～45.00 U/L；第20～27天時(shí)，SOD活力顯著升高(P<0.05)；接種乳酸菌后，SOD活力持續(xù)升高，于第41天升至135.00 U/L。表明葡萄酵素在依次接種發(fā)酵過程中SOD活力主要在醋酸菌發(fā)酵后期以及乳酸菌發(fā)酵過程中大幅提高，因此，在優(yōu)化葡萄酵素品質(zhì)以及工業(yè)化生產(chǎn)中可針對性對發(fā)酵階段進(jìn)行調(diào)節(jié)控制，從而生產(chǎn)出富含高活性功效酶的產(chǎn)品，提高附加值。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，葡萄酵素SOD活力符合QB/T5323—2018 中≥15 U/L的要求。與葡萄漿汁相比，發(fā)酵結(jié)束時(shí)SOD活力增長6倍，表明在葡萄酵素發(fā)酵過程中產(chǎn)生了較多抗氧化酶系，有利于清除活性氧。

圖4 葡萄酵素發(fā)酵過程中SOD活力的變化Fig.4 Changes of SOD activity during fermentation of grape Jiaosu

2.2.4 葡萄酵素發(fā)酵過程中有機(jī)酸的變化

有機(jī)酸是酵素發(fā)酵過程中的代謝產(chǎn)物，可賦予酵素獨(dú)特風(fēng)味，所形成的酸性環(huán)境對某些有害微生物有抑制作用，并且在發(fā)酵過程中其種類和數(shù)量也會發(fā)生變化[29]。因此，研究酵素發(fā)酵過程中有機(jī)酸的種類和含量，對其感官質(zhì)量評價(jià)極為重要。由表4可知，在發(fā)酵前6 d未檢測到乙酸，而丙酮酸、檸檬酸和蘋果酸含量增多，表明這一時(shí)期酵母菌主要通過糖代謝積累代謝產(chǎn)物；接種醋酸菌后，醋酸菌利用乙醇生成乙酸，乙酸顯著增加(P<0.05)；第27天時(shí)未檢測出乳酸，乙酸含量顯著升高(P<0.05)，這可能是由于某些微生物具有降解乳酸轉(zhuǎn)化為乙酸的能力[9]；而接種乳酸菌后，乳酸和檸檬酸含量分別增至102.09 mg/L和67.70 mg/L，蘋果酸含量下降至0，這可能是由于乳酸菌通過三羧酸循環(huán)將蘋果酸轉(zhuǎn)化成檸檬酸、通過蘋果酸發(fā)酵途徑將蘋果酸轉(zhuǎn)化成乳酸所致[30]。

表4 葡萄酵素發(fā)酵過程中有機(jī)酸的變化Table 4 Changes of organic acid during fermentation of grape Jiaosu

2.2.5 葡萄酵素發(fā)酵過程中香氣成分的變化

葡萄酵素香氣成分與原料、菌種和發(fā)酵環(huán)境等多種因素有關(guān)，研究發(fā)酵過程中香氣成分的變化，對酵素品質(zhì)評價(jià)具有重要意義。葡萄酵素發(fā)酵過程中香氣成分變化的相應(yīng)結(jié)果見附表1(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20211115.2144.004.html)。發(fā)酵過程中共檢出43種香氣成分，其中醇類化合物和酯類化合物占比較高，香氣成分的種類隨著發(fā)酵時(shí)間而變化。

醇類化合物來源于酵母菌等微生物分解糖、蛋白質(zhì)及氨基酸等物質(zhì)產(chǎn)生[13]，共檢出14種。其中苯乙醇主要是由酵母菌以L-苯丙氨酸為前體通過戊糖磷酸途徑或利用葡萄糖通過草莽酸途徑生成，具有玫瑰香、紫羅蘭香和茉莉花香等多種香味，于第3天顯示出最高的濃度，隨后降低，這可能是由于發(fā)酵后期醇類物質(zhì)與脂肪酸酯化所致[31]。高級醇是酵母菌的次級代謝產(chǎn)物，包括異丁醇、正丁醇、異戊醇、1-戊醇、5-甲基-2-環(huán)己醇、2-庚醇，主要來自葡萄糖的合成代謝及相應(yīng)氨基酸的分解代謝途徑。酯類化合物構(gòu)成了葡萄酵素的獨(dú)特風(fēng)味，共檢出13種，總體呈先升高后降低的趨勢，降低的原因可能是由于發(fā)酵后期pH降低，酯類物質(zhì)發(fā)生水解所致[32]。其中乙酸乙酯是葡萄酵素中含量較高的成分，在發(fā)酵第13天檢測出最高質(zhì)量濃度，為30.07 μg/mL，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長濃度降低，該物質(zhì)廣泛存在于蘋果、梨等水果中，是構(gòu)成葡萄酵素令人愉悅的花果香氣的主體成分。脂肪酸是構(gòu)成葡萄酵素風(fēng)味的重要化合物，共檢出4種，分別是乙酸、丙酸、異丁酸和異戊酸。乙酸在發(fā)酵過程中呈先升高后降低的趨勢，并于第27天檢測出最高值47.49 μg/mL，可能是因?yàn)檫@一時(shí)期醋酸菌利用乙醇生成大量乙酸。

醛類化合物是構(gòu)成葡萄酵素發(fā)酵前期成熟果味的化學(xué)成分之一，其感官閾值較低，共檢出4種，分別是乙醛、己醛、(2Z)-2-庚醛和反式-2-己烯醛，乙醛在發(fā)酵過程中呈先升高后降低的趨勢，己醛、(2Z)-2-庚醛和反式-2-己烯醛僅在葡萄汁中檢測得到，質(zhì)量濃度為0.03～0.14 μg/mL。酮類化合物在葡萄酵素香氣成分中占比較少，共檢出3種。其中3-羥基-2-丁酮在發(fā)酵后期濃度較大，4-羥基-2-丁酮僅在第27天檢出，2,3-丁二酮在發(fā)酵第34天檢出，3-羥基-2-丁酮和2,3-丁二酮是醋酸發(fā)酵階段的代表性產(chǎn)物，并且研究指出該物質(zhì)的生成與乳酸有關(guān)[33]。

3 結(jié)論

在分析7株酵母菌發(fā)酵特性及功效酶的動態(tài)變化中，發(fā)現(xiàn)釀酒酵母XQ-05消耗還原糖能力快，產(chǎn)酸能力強(qiáng)，發(fā)酵速度快，且表現(xiàn)出較強(qiáng)的產(chǎn)酶能力，因此該菌株能很好地適應(yīng)葡萄基質(zhì)，適合葡萄快速發(fā)酵。在依次接種發(fā)酵葡萄酵素過程中，相比葡萄漿汁而言，產(chǎn)品偏紅；發(fā)酵過程中γ-氨基丁酸含量和SOD活力逐漸升高，第41天時(shí)分別達(dá)到38.95 μg/mL和135.00 U/L；有機(jī)酸含量的變化與微生物之間有著密切關(guān)系，造成各微生物發(fā)酵階段有機(jī)酸差異的主要為蘋果酸、乙酸和乳酸；發(fā)酵過程中共檢出43種香氣成分，其中醇類化合物和酯類化合物占比較高。本研究明確了不同酵母菌發(fā)酵葡萄過程中物質(zhì)變化規(guī)律以及接種發(fā)酵過程中對葡萄酵素品質(zhì)變化的影響，從而為葡萄酵素發(fā)酵條件的優(yōu)化以及品質(zhì)的提升提供理論基礎(chǔ)。