不同香型白酒大曲微生物群落及其與風(fēng)味的相關(guān)性

張清玫，趙鑫銳,2,3，李江華,2,3，堵國(guó)成,2,3，陳堅(jiān),2,3*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)2(江南大學(xué) 未來(lái)食品科學(xué)中心，江蘇 無(wú)錫，214122) 3(江南大學(xué), 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)

白酒是世界上最古老的蒸餾酒之一，不同白酒酒體風(fēng)格迥異，可分為多種香型，其中醬香型、濃香型和清香型是白酒的基本香型[1]。影響白酒香型的因素諸多，除地域環(huán)境與釀造工藝等因素外，大曲對(duì)白酒風(fēng)味的形成也做出了重要貢獻(xiàn)。白酒大曲是白酒釀造所需的發(fā)酵劑和生香劑，為白酒釀造提供了豐富的微生物、酶和風(fēng)味物質(zhì)及其前體，不同香型的大曲為其對(duì)應(yīng)白酒的釀造過(guò)程提供了不同的功能菌群，并在產(chǎn)香能力與產(chǎn)香種類方面存在一定的差異[2]。因此有必要研究不同香型大曲中微生物群落功能和風(fēng)味組成差異以及兩者之間的內(nèi)在聯(lián)系。

近年來(lái)，隨著組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，對(duì)于大曲中微生物的研究已經(jīng)不再局限于傳統(tǒng)可培養(yǎng)技術(shù)[3]。研究者們借助擴(kuò)增子測(cè)序研究了不同時(shí)期[4]、等級(jí)[5]、季節(jié)[6]的大曲，揭示了大曲微生物組成并基于關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)大曲在發(fā)酵過(guò)程中微生群落受到發(fā)酵時(shí)間、溫度、濕度等影響。ZANG等[7]、XU等[8]分別通過(guò)發(fā)酵微生物群落與發(fā)酵風(fēng)味的關(guān)聯(lián)性分析，探索了發(fā)酵魚(yú)和辣椒發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)香核心功能菌群。HUANG等[9]、WANG等[10]也以風(fēng)味為導(dǎo)向探索了白酒釀造過(guò)程中的產(chǎn)香核心功能菌群。然而，擴(kuò)增子測(cè)序缺乏功能基因的具體信息，使得進(jìn)一步深入研究面臨瓶頸。相比之下宏基因組測(cè)序在一定程度上彌補(bǔ)了這些缺陷[11]，可以更系統(tǒng)深入地研究微生物群落結(jié)構(gòu)及其功能基因，全面分析其組成、變化規(guī)律、親緣進(jìn)化并挖掘出潛力豐富的功能基因，從而進(jìn)一步揭開(kāi)發(fā)酵食品微生物群落的神秘面紗[12]。

本研究選取了3種香型白酒大曲，基于宏基因組學(xué)技術(shù)對(duì)3種酒曲中微生物群落結(jié)構(gòu)和功能基因進(jìn)行研究，采用了頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用(headspace solid-phase microextraction/gas chromatography-mass spectrometry)方法解析了大曲中風(fēng)味物質(zhì)，并對(duì)大曲核心菌群以及特征風(fēng)味進(jìn)行了關(guān)聯(lián)性分析。以此探索微生物和風(fēng)味之間的關(guān)系，以及各自的關(guān)鍵產(chǎn)香功能微生物，這對(duì)于在微觀層面了解3種香型大曲的差異原因，以及穩(wěn)定和改善白酒大曲風(fēng)味和品質(zhì)從而保證不同香型白酒主體香突出具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

大曲樣品：醬香型白酒大曲HT,四川省某酒廠；濃香型白酒大曲MT，江蘇省某酒廠；清香型白酒大曲LT，山西省某酒廠。

主要試劑：磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉、氯化鉀，均為分析純，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司；DNeasy PowerSoil Pro Kit，QIAGEN公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電泳儀、Gel Doc 凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó) Bio-Rad 公司；臺(tái)式高速離心機(jī)，德國(guó) Eppendorf 公司；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀SCIONSQ-456-GC，美國(guó)布魯克公司；Illumina HiSeq4000測(cè)序平臺(tái)，美國(guó)Illumina 公司。

1.3 DNA提取

稱取5 g大曲樣品，加入15 mL PBS緩沖液于50 mL 的離心管中，加入玻璃珠3顆，充分振蕩5 min后以離心力150×g離心5 min，取上清液于離心管中。再向沉淀中加入5 mL PBS緩沖液重復(fù)洗兩次，150×g離心5 min，收集上清液。將收集的上清液10 000×g離心10 min，收集菌體沉淀，后參照QIAGEN公司DNeasy PowerSoil Pro Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA。提取得到的DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳和分光光度法進(jìn)行質(zhì)量和濃度檢測(cè)。質(zhì)檢合格的樣本樣品貯存在-20 ℃以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.4 宏基因組測(cè)序

1.4.1 建庫(kù)測(cè)序

檢測(cè)合格的DNA樣品用Covaris超聲波破碎儀將基因組DNA隨機(jī)打斷成長(zhǎng)度約300 bp左右的小片段，經(jīng)末端修復(fù)、加A尾、加測(cè)序接頭、純化、PCR擴(kuò)增等步驟完成整個(gè)文庫(kù)制備。文庫(kù)構(gòu)建完成后，先使用Qubit 2.0進(jìn)行初步定量，稀釋文庫(kù)至2 ng/μL，隨后使用Agilent 2100對(duì)文庫(kù)的插入片段進(jìn)行檢測(cè)，插入片段符合預(yù)期后，使用qPCR方法對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量(文庫(kù)有效濃度3 nmol/L)，以保證文庫(kù)質(zhì)量。文庫(kù)質(zhì)檢合格后，把不同文庫(kù)按照有效濃度及目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求pooling后在Illumina HiSeq4000平臺(tái)測(cè)序。

1.4.2 數(shù)據(jù)分析處理

對(duì)原始下機(jī)數(shù)據(jù)使用Trimmomatic軟件進(jìn)行質(zhì)控，包括去除接頭序列、低質(zhì)量reads。(1) 過(guò)濾帶有測(cè)序接頭的reads；(2) 過(guò)濾N(不確定堿基)含量比例>1%的reads；(3) 過(guò)濾低質(zhì)量堿基(Q20)含量>50%的reads。并過(guò)濾質(zhì)控后片段長(zhǎng)度仍<150 bp的reads。質(zhì)控后將得到的高質(zhì)量序列clean reads使用DIAMOND BLASTX算法進(jìn)行比對(duì)和物種注釋，使用組裝軟件MEGAHIT (v1.0.6) 對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，并過(guò)濾掉組裝結(jié)果中500 bp以下的片段。采用prodigal軟件對(duì)組裝得到的contig序列進(jìn)行ORF (Open Reading Frame) 預(yù)測(cè)，使用CD-HIT軟件對(duì)預(yù)測(cè)的結(jié)果去冗余，從而得到非冗余基因集。采用Bowtie軟件將測(cè)序數(shù)據(jù)與構(gòu)建的非冗余基因集進(jìn)行比對(duì)，并統(tǒng)計(jì)單個(gè)基因在不同樣本的豐度信息。將預(yù)測(cè)得到非冗余基因集與功能注釋數(shù)據(jù)庫(kù)NR、KEGG進(jìn)行比對(duì)和注釋。

1.5 HS-SPME-GC-MS解析大曲揮發(fā)性物質(zhì)

1g大曲樣品與內(nèi)標(biāo)10 μL 2-辛醇 (10 mg/L) 混合，用SPME纖維(50∶30 mm二乙烯基苯-羧基-聚二甲基硅氧烷)在60 ℃下萃取30 min。在DB-Wax色譜柱(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm)上進(jìn)行化合物的分離。氦氣以0.8 mL/min的恒定流速用作載氣。在40 ℃下保持3 min，以6 ℃/min到100 ℃，然后以10 ℃/min到230 ℃，并保持6 min。質(zhì)譜儀以電子碰撞模式操作，電子能量設(shè)置為70 eV，掃描范圍為33～400m/z。MS源和四級(jí)桿的溫度分別設(shè)置為200 ℃和230 ℃。使用美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究所 (National Institute of Standards and Technology, NIST) 和Wiley數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定每種化合物。選擇正負(fù)匹配度>800的化合物。根據(jù)內(nèi)標(biāo)峰面積與風(fēng)味物質(zhì)峰面積的比值，計(jì)算出大曲揮發(fā)風(fēng)味的相對(duì)濃度。

1.6 核心微生物與差異風(fēng)味的關(guān)聯(lián)性分析

將偏最小二乘法判別分析(partial least squares discrimination analysis，PLS-DA)得到的變量重要性投影 (variable Importance for the projection,VIP)值>1的風(fēng)味物質(zhì)和每種大曲豐度前3以及線性判別分析 (linear discriminant analysis，LDA)值>3.5的細(xì)菌屬和真菌屬作為變量，通過(guò)R語(yǔ)言批量計(jì)算變量之間的Spearman相關(guān)系數(shù)，選取微生物與風(fēng)味成分之間相關(guān)性系數(shù)絕對(duì)值>0.6且相關(guān)性顯著 (P<0.05) 的部分進(jìn)行關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)可視化。使用Cytoscape對(duì)大曲微生物與風(fēng)味成分的相關(guān)性和微生物之間的互作關(guān)系進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種香型大曲微生物結(jié)構(gòu)差異分析

對(duì)3種香型大曲的微生物群落進(jìn)行物種注釋。首先對(duì)其進(jìn)行多樣性差異分析，由圖1-a可知，3種大曲中，清香型大曲的細(xì)菌多樣性與豐富度最高，而濃香型大曲細(xì)菌群落的豐富度與多樣性均顯著低于其他兩種曲(P<0.05)。醬香型大曲的真菌多樣性與豐富度都顯著高于其他兩種曲(圖1-b,P<0.05)，清香型大曲的真菌多樣性最低而濃香型大曲的真菌豐富度最低。基于主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)可知(圖1-c～圖1-d)，3種大曲無(wú)論在細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)還是真菌群落結(jié)構(gòu)上都存在著顯著的差異。

a-細(xì)菌α-多樣性分析；b-真菌α-多樣性分析；c-細(xì)菌β-多樣性分析；d-真菌β-多樣性分析圖1 三種香型大曲微生物多樣性分析Fig.1 Microbial diversity analysis of three types of Daqu

2.2 三種香型大曲微生物群落組成

3種香型大曲中主要注釋到3種細(xì)菌門(mén)，分別是Firmicutes，Actinobacteria和Proteobacteria，其中Firmicutes在濃香型大曲占據(jù)主導(dǎo)地位，其平均相對(duì)豐度總和>97%。在清香型大曲中Firmicutes，Actinobacteria占據(jù)主導(dǎo)地位，其平均相對(duì)豐度總和>99%。在醬香型大曲中Firmicutes，Actinobacteria和Proteobacteria占據(jù)主導(dǎo)地位，其平均相對(duì)豐度總和>99%，且Proteobacteria的豐度遠(yuǎn)高于其他兩種大曲。同時(shí)主要注釋到兩種真菌門(mén)，Ascomycota和Mucoromycota，其相對(duì)豐度總和在3種大曲中均>99%，其中Ascomycota在醬香型大曲中的相對(duì)豐度最高而Mucoromycota在濃香型大曲中的相對(duì)豐度最高。

在屬水平上對(duì)3種香型大曲相對(duì)豐度前20的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌與優(yōu)勢(shì)真菌進(jìn)行分析，由圖2可知，Desmospora、Saccharopolyspora和Bacillus是醬香型大曲主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，Byssochlamys、Aspergillus、Rasamsonia和Lichtheimia是醬香型大曲的優(yōu)勢(shì)真菌屬，通過(guò)線性判別分析(linear discriminant analysis effect size，LEfSe)可知，細(xì)菌屬Desmospora、Saccharopolyspora和真菌屬Byssochlamys、Aspergillus、Rasamsonia是醬香型大曲的標(biāo)記微生物屬 (LDA>3.5)；濃香型大曲微生物群落主要由優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬Bacillus、Leuconostoc和優(yōu)勢(shì)真菌屬Lichtheimia、Saccharomyces、Pichia組成，其標(biāo)記微生物主要為Bacillus、Lichtheimia和Saccharomyces。清香型大曲的細(xì)菌群落組成較為均勻，其優(yōu)勢(shì)菌屬的相對(duì)豐度差異較小，主要由Lactobacillus、Leuconostoc、Weissella、Streptomyces和Staphylococcus等產(chǎn)酸細(xì)菌屬組成，且是其標(biāo)記微生物，而其真菌群落則主要由Pichia和Lichtheimia組成，其中Pichia是清香型大曲的標(biāo)記真菌屬。

2.3 三種香型大曲微生物群落功能差異分析

基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)3種大曲的基因進(jìn)行功能注釋，由圖3-a所示的二級(jí)代謝通路信息可知，3種大曲中參與Carbohydrate metabolism(碳水化合物代謝)與Amino acid metabolism(氨基酸代謝)的功能基因最多，在所有的代謝通路中所占比例最高，說(shuō)明在大曲發(fā)酵過(guò)程中微生物對(duì)碳水化合物與氨基酸等物質(zhì)的代謝活動(dòng)較為旺盛。大曲原料富含淀粉與蛋白質(zhì)，微生物在該類大分子原料的代謝降解中發(fā)揮了巨大的作用，其代謝產(chǎn)物如還原糖與氨基酸在滿足微生物自身生長(zhǎng)代謝的同時(shí)，還可生成風(fēng)味物質(zhì)及其前體。在還原糖被微生物利用與轉(zhuǎn)化過(guò)程中伴生多種酸、醇和醛類物質(zhì)，而氨基酸決定了酒的風(fēng)味，在酒的香型及口感形成中起著重要作用[13]。同時(shí)還原糖與氨基酸在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)發(fā)生美拉德反應(yīng)從而形成風(fēng)味物質(zhì)，曲溫越高，該反應(yīng)越易發(fā)生。3種大曲Carbohydrate metabolism(碳水化合物代謝)、Amino acid metabolism(氨基酸代謝)、Nucleotide metabolism(核苷酸代謝)、Metabolism of cofactors and vitamins(輔因子與氨基酸代謝)和Metabolism of other amino acids(其他氨基酸代謝)等與原料利用相關(guān)的代謝通路的比例均存在顯著的差異 (P<0.05)，其中清香型大曲微生物在碳水化合物代謝的比例顯著高于其他兩種大曲，醬香型大曲微生物在氨基酸代謝的比例相對(duì)最高。對(duì)代謝通路進(jìn)一步分析，如圖3-b所示為豐度前30的三級(jí)代謝通路，如ABC transporters(ABC 轉(zhuǎn)運(yùn))、Biosynthesis of amino acids(氨基酸生物合成)和Carbon metabolism(碳代謝)等。通過(guò)單因素方差分析可知，3種大曲微生物在碳水化合物代謝中的Pyruvate metabolism(丙酮酸代謝)、Amino sugar and nucleotide sugar metabolism(氨基糖和核糖代謝)、Glycolysis/Gluconeogenesis(糖酵解/糖異生)、Starch and sucrose metabolism(淀粉和蔗糖代謝)、Citrate cycle(三羧酸循環(huán))和Butanoate metabolism(丁酸鹽代謝)通路都存在顯著的差異，并且在清香型大曲中所占的比例高于其他2種大曲。3種大曲在氨基酸代謝中的Alanine, aspartate and glutamate metabolism(丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝)和Glycine, serine and threonine metabolism(甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝)通路上同樣存在顯著差異，前者在清香型大曲中所占比例高于其他2種大曲，后者在醬香型大曲中所占比例最高。

a-優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬；b-細(xì)菌屬LEfSe分析；c-優(yōu)勢(shì)真菌屬；d-真菌屬LEfSe分析圖2 三種香型大曲優(yōu)勢(shì)微生物與標(biāo)記微生物Fig.2 Dominant and marker microorganisms of three types of Daqu

2.4 三種香型大曲揮發(fā)性代謝物質(zhì)組成分析

從三種大曲中總共檢測(cè)出60種揮發(fā)性化合物，由圖4-a可知，醬香型大曲、濃香型大曲和清香型大曲中分別檢測(cè)到32、50和39種物質(zhì)，其中3種大曲共有的物質(zhì)有21種，濃香型特有的風(fēng)味最多有10種。所有化合物主要分為六大類，包括5種酸類物質(zhì)、5種酮類物質(zhì)、7種醛類物質(zhì)、11種吡嗪類物質(zhì)、21種酯類物質(zhì)和11種醇類物質(zhì)(圖4-c)。如圖4-b所示，酯類物質(zhì)、吡嗪類物質(zhì)和醇類物質(zhì)在大曲揮發(fā)性物質(zhì)組成中均占主導(dǎo)地位，其中清香型大曲中的酯含量最高，濃香型大曲次之，醬香型大曲則相對(duì)最少。之前的報(bào)告中也發(fā)現(xiàn)清香型白酒的酯含量較高[14]。濃香型大曲中的吡嗪類物質(zhì)濃度總和高于醬香型大曲和清香型大曲(圖4-b)，從已有報(bào)道中，同樣發(fā)現(xiàn)了濃香型大曲中含有豐富的吡嗪類物質(zhì)[15]。白酒中的四甲基吡嗪主要由Bacillus生成的乙偶姻與銨鹽經(jīng)化學(xué)反應(yīng)而成[16]，在2.2中也發(fā)現(xiàn)濃香型大曲中Bacillus的含量高于另外2種大曲。根據(jù)半定量得到的風(fēng)味物質(zhì)濃度繪制了熱圖，發(fā)現(xiàn)醬香型大曲優(yōu)勢(shì)風(fēng)味物質(zhì)種類數(shù)量最少，主要集中在酸、醇和吡嗪，這與之前在研究醬香型白酒風(fēng)味時(shí)發(fā)現(xiàn)其有機(jī)酸總量明顯高于濃香型及清香型白酒是一致的[17]。清香型大曲優(yōu)勢(shì)風(fēng)味物質(zhì)主要集中在酯類和醇類，并且只在清香型大曲中發(fā)現(xiàn)了乳酸乙酯，這與之前報(bào)道的乳酸乙酯是清香型白酒的特征風(fēng)味相符合[18]。乳酸乙酯的關(guān)鍵前體是乳酸[19]，乳酸是乳酸菌的重要產(chǎn)物，乳酸菌在大曲較為常見(jiàn)，因此推測(cè)清香型大曲中乳酸菌對(duì)乳酸乙酯的生成與積累具有一定的正向作用。并且，乳酸自身也可以減少白酒的刺激性氣味，使白酒具有回甜感，增加白酒的風(fēng)味[20]。濃香型大曲的優(yōu)勢(shì)風(fēng)味數(shù)量最多，主要集中在吡嗪和酯類，且濃香型大曲含有的酯類和吡嗪類的種類是最為豐富的。

a-3種大曲優(yōu)勢(shì)二級(jí)代謝通路；b-3種大曲優(yōu)勢(shì)三級(jí)代謝通路圖3 三種香型大曲基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的二級(jí)和三級(jí)代謝功能分析Fig.3 KEGG analysis of gene expression on first and second level of three types of Daqu

a-3種大曲代謝物VENN圖；b-3種大曲各類物質(zhì)含量；c-3種大曲主要代謝物質(zhì)熱圖分析圖4 三種香型大曲揮發(fā)性物質(zhì)組成Fig.4 The flavor composition of the three types of Daqu

2.5 三種香型大曲典型風(fēng)味物質(zhì)解析

利用PLS-DA解析3種香型大曲代謝組成差異。PLS-DA得分圖(圖5-a，Q2>0.95)顯示，9個(gè)樣品根據(jù)其香型各自聚為3類，表明不同香型大曲之間的代謝物組成具有顯著差異。由VIP圖可知共有11種代謝物對(duì)該模型的代謝組成差異做出了重要貢獻(xiàn)(圖5-c，VIP值>1)，結(jié)果表明四甲基吡嗪、乙酸乙酯、三甲基吡嗪和2，3-丁二醇是濃香型大曲區(qū)別于其他2種香型大曲代謝組成的典型風(fēng)味物質(zhì)。己酸乙酯、十七酸乙酯、辛酸乙酯、庚醇和庚酸乙酯是清香型區(qū)別于其他2種香型大曲代謝組成的典型風(fēng)味物質(zhì)。在前面的KEGG注釋中，也發(fā)現(xiàn)清香型大曲丁酸鹽代謝通路顯著高于另外2種大曲，丁酸作為己酸的前體，丁酸的積累也為己酸乙酯的合成提供了基礎(chǔ)。盡管醬香型大曲中沒(méi)有顯著的代謝物，但在其中鑒定到8種特有物質(zhì)，包括2-甲基丙酸、戊醇、癸醇和十三醇等風(fēng)味物質(zhì)。

a-PLS-DA的得分圖；b-PLS-DA的載荷圖；c-重要代謝物的VIP圖圖5 三種香型大曲代謝物差異分析Fig.5 Difference analysis of metabolites of three types of Daqu

2.6 微生物和風(fēng)味物質(zhì)關(guān)聯(lián)分析

在分析了3種香型大曲優(yōu)勢(shì)、差異微生物和差異風(fēng)味的基礎(chǔ)上，利用Spearman相關(guān)系數(shù)分析3種香型大曲優(yōu)勢(shì)差異菌屬間與特征風(fēng)味物質(zhì)間的互作關(guān)系。若相關(guān)系數(shù)>0.6且P<0.05，則定義為具有顯著相關(guān)性。由圖6-a可知，己酸乙酯與庚酸乙酯等酯類物質(zhì)主要與細(xì)菌屬存在關(guān)聯(lián)，如Lactobacillus、Weissella和Leuconostoc等細(xì)菌屬，除此之外，酯類物質(zhì)普遍與真菌屬Pichia存在顯著的強(qiáng)正相關(guān)，同時(shí)Pichia與上述細(xì)菌屬均具有顯著的正相關(guān)性(圖6-b)。該結(jié)果表明，Pichia與Lactobacillus、Weissella和Leuconostoc為大曲中的產(chǎn)酯功能菌群。已有研究發(fā)現(xiàn)酯類主要合成途徑是酸和醇在酯化酶作用下的合成的[21]，兩者都需要微生物的參與，且發(fā)生在白酒發(fā)酵過(guò)程中。根據(jù)之前的報(bào)道，Lactobacillus、Weissella和Leuconostoc具有產(chǎn)酸能力，同時(shí)Pichia具有較強(qiáng)的產(chǎn)酯能力[22]，前者可通過(guò)代謝產(chǎn)酸為后者提供產(chǎn)酯前體物質(zhì)。在2.2和2.4的研究中，發(fā)現(xiàn)上述產(chǎn)酯功能菌群是清香型大曲的優(yōu)勢(shì)標(biāo)記微生物，且清香型大曲的酯類含量顯著高于其他2種香型大曲(圖4-b)，進(jìn)一步證明了該菌群具有產(chǎn)酯能力。由6-a圖可知，在大曲發(fā)酵過(guò)程中，Bacillus與2,3-丁二醇呈顯著正相關(guān)，這與之前Bacillus具有產(chǎn)2,3-丁二醇能力的報(bào)道一致[23]。在2.2和2.4的研究中也發(fā)現(xiàn)，濃香型大曲中Bacillus在菌群結(jié)構(gòu)中占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，且2,3-丁二醇在濃香型白酒中含量顯著高于其他2種香型大曲。

a-微生物與重要風(fēng)味物關(guān)聯(lián)分析；b-微生物間的關(guān)聯(lián)分析(紅線為正相關(guān)，黑線為負(fù)相關(guān))圖6 微生物和風(fēng)味成分的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 Correlation network between microbial genera and flavor compounds

3 結(jié)論與討論

本研究基于宏基因組學(xué)技術(shù)與代謝組學(xué)技術(shù)探究3種不同香型大曲間微生物與揮發(fā)性代謝物質(zhì)間的組成差異，并通過(guò)關(guān)聯(lián)性分析解析造成3種大曲特征風(fēng)味差異的內(nèi)在原因。從微生物層面來(lái)看，3種大曲的微生物群落結(jié)構(gòu)具有顯著差異。3種大曲的發(fā)酵溫度以清香、濃香到醬香呈遞增趨勢(shì)，因而大曲中的優(yōu)勢(shì)菌屬隨著該趨勢(shì)慢慢演替至由耐高溫菌屬組成的優(yōu)勢(shì)菌群，清香型大曲的優(yōu)勢(shì)菌屬主要為L(zhǎng)actobacillus、Leuconostoc、Weissella、Streptomyces和Staphylococcus以及Pichia等產(chǎn)酸產(chǎn)酯菌屬，醬香型大曲的優(yōu)勢(shì)菌屬主要為Saccharopolyspora和Bacillus等耐高溫菌屬[24]，而濃香型大曲菌群結(jié)構(gòu)則介于2種大曲之間，兼具清香與醬香2種大曲優(yōu)勢(shì)菌群的特色，既有耐高溫的優(yōu)勢(shì)菌屬Bacillus，又存在Pichia等優(yōu)勢(shì)產(chǎn)酯菌屬[22]。該結(jié)論同樣可以從圖1 觀察到，濃香大曲微生物PCoA1軸上，介于清香與醬香大曲之間。從宏基因組功能分析可知，3種香型大曲微生物在發(fā)酵過(guò)程中對(duì)淀粉及蛋白質(zhì)等原料利用與轉(zhuǎn)化的代謝活動(dòng)最為強(qiáng)烈，而其相關(guān)功能基因的比例存在顯著的差異，其中清香型大曲微生物在淀粉代謝、三羧酸循環(huán)、丙酮酸代謝和糖酵解等碳水化合物代謝活動(dòng)的強(qiáng)烈程度均高于醬香型大曲與濃香型大曲，而醬香型大曲在總體氨基酸代謝的強(qiáng)烈程度則顯著高于其他2種大曲。從代謝物質(zhì)層面來(lái)看，Pichia與Lactobacillus、Weissella和Leuconostoc作為清香型大曲標(biāo)記微生物，是其產(chǎn)酯互作菌群。濃香型大曲中富含Bacillus，可代謝生成2,3-丁二醇和吡嗪，使其在濃香型白酒中含量顯著高于其他2種香型大曲。

本研究探究了3種香型大曲的標(biāo)記微生物與典型風(fēng)味物質(zhì)，并通過(guò)關(guān)聯(lián)性分析揭示了其內(nèi)在聯(lián)系，這對(duì)于尋找大曲中關(guān)鍵的產(chǎn)香微生物來(lái)強(qiáng)化不同香型白酒主體風(fēng)味以及為后續(xù)的白酒釀造提供高質(zhì)量大曲提供了理論基礎(chǔ)。后期工作可以基于該分析方法確定功能微生物，并對(duì)其進(jìn)行篩選培養(yǎng)以及功能驗(yàn)證，開(kāi)發(fā)出功能型強(qiáng)化大曲，并將其應(yīng)用于不同類型的白酒釀造中，在保證不同香型白酒特征風(fēng)味的同時(shí)提高白酒整體品質(zhì)。