中華獼猴桃與軟棗獼猴桃種間雜交親本的篩選

杜 奎，王麗華，張 茜，謝 王月，李利軍，莊啟國，李嶠虹，李明章，王永志

（四川省自然資源科學(xué)研究院 中國—新西蘭獼猴桃“一帶一路”聯(lián)合實驗室、獼猴桃育種及利用四川省重點實驗室，四川 成都 610041）

0 引言

獼猴桃起源于中國，是我國重要的特色經(jīng)濟水果。獼猴桃隸屬于獼猴桃科（Actinidiaceae）獼猴桃屬（Actinidia Lindl.），營養(yǎng)豐富［1，2］，素有“水果之王”的美譽。獼猴桃屬分為54 個種，21 個變種，共75 個分類單元［3］，目前栽培利用的主要為中華獼猴桃（Actinidia chinensis Planch.var.chinensis）、美味獼猴桃（A.chinensis var.deliciosa A.Chevalier）和少量軟棗獼猴桃（A. argute（Sieb.＆ Zucc）Planch.ex Miq.）。中華獼猴桃果實大、口感好、較耐貯藏，適于鮮食，許多主栽品種均屬此類，如‘紅陽’、‘金實1 號’［4］、‘東紅’［5］、‘平原紅’［6］、‘貝木’［7］。但中華獼猴桃潰瘍病抗性和抗寒耐旱能力較差，主要種植于我國南方地區(qū)。美味獼猴桃產(chǎn)量高、抗病性強，大多數(shù)品種口感偏酸，適于加工和作砧木，在陜西、貴州、湖南等地廣泛栽培。軟棗獼猴桃因果面連皮食用，營養(yǎng)美味，成熟期早，抗寒性強且高抗?jié)儾。?，9］，極具市場發(fā)展?jié)摿?。目前，軟棗獼猴桃育種主要通過野生資源篩選。截至2017 年，世界軟棗獼猴桃品種已達(dá)到74個之多，僅我國就有11 個［10］，但是果實普遍較小、貯藏性能差（2—3 周），產(chǎn)業(yè)發(fā)展受限。

種間雜交可以打破種屬間的隔離，把親本有益特性重新組合，使之形成新類型或新種，這些新類型或新種可能具有種內(nèi)雜交所不能獲得的優(yōu)良特性［11］。由于種間雜交后代群體類型多樣，因此種間雜交是創(chuàng)造果樹新種質(zhì)常用和重要的途徑［12］。Wang 等［13］用普通枇杷與南亞枇杷雜交，獲得了具有春季開花習(xí)性的‘春花1 號’，該品種可以有效規(guī)避花期凍害，且果實內(nèi)在品質(zhì)優(yōu)于雙親；黃宏文［3］通過中華獼猴桃與毛花獼猴桃雜交，選育出了低糖低酸新品種‘金艷’。目前尚無中華獼猴桃與軟棗獼猴桃雜交獲得后代的報道。

利用中華獼猴桃與軟棗獼猴桃種間雜交可以綜合雙親的優(yōu)良性狀，從而培育果大質(zhì)優(yōu)、耐貯藏且抗?jié)儾〉墨J猴桃新品種。獼猴桃不但種質(zhì)資源豐富、個體差異巨大，而且是雌雄異株植物，父本具有不確定性，又存在雜交親和性的問題，增加了雜交親本選擇的難度。為了低成本、高效率地獲得理想的育種目標(biāo)，需要對雜交親本進(jìn)行慎重篩選。在獼猴桃親本篩選的眾多因素中，染色體倍性、物候期、果實品質(zhì)最為關(guān)鍵。獼猴桃染色體倍性存在廣泛的變異，中華獼猴桃（原變種）有二倍體、四倍體兩個倍性小種，軟棗獼猴桃有四倍體和六倍體兩個倍性小種。通常，相同倍性品種雜交，其親和力強，有利于形成雜交種子，且雜交種子發(fā)芽率高；而不同倍性品種雜交，種子常敗育，難以形成飽滿種子［14，15］。前人研究表明，多倍體獼猴桃通常比相同種類二倍體獼猴桃具有果實更大、耐貯藏、貨架期長、抗逆性強等優(yōu)良特性［16］，因此在選擇雜交親本時被優(yōu)先考慮。盡管相同倍性材料種間雜交親和力強而更容易獲得成功，但也有研究表明不同倍性的種類雜交可以獲得多種倍性小種，例如二倍體軟棗獼猴桃與六倍體美味獼猴桃雜交可以獲得二倍體、五倍體、六倍體3 種類型［17］?？梢姡梢愿鶕?jù)研究目的篩選不同倍性種類作為親本。此外，果樹的物候期是植物器官受一年內(nèi)季節(jié)氣候條件制約而發(fā)生相應(yīng)動態(tài)變化，與農(nóng)事管理、上市時間關(guān)系密切，而果實的外觀、內(nèi)在品質(zhì)和貯藏性是最重要的評價指標(biāo)。

本文以不同來源的42 份中華獼猴桃和14 份軟棗獼猴桃為材料，檢測兩種獼猴桃的染色體倍性，調(diào)查物候期，評價果實感官品質(zhì)、主要營養(yǎng)成分和耐藏性，為種間雜交親本材料的篩選提供參考依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1 材料

所選實驗材料均來源于四川省自然資源科學(xué)研究院什邡科研基地（四川省什邡市）3 年以上樹齡的健壯獼猴桃植株，實驗時間為2018—2020 年。

1.2 方法

染色體倍性檢測：取新鮮未展開幼嫩葉片0.5cm2置于培養(yǎng)皿中；取400μl CyStain UV Precise P 裂解液于植物葉片周圍，用刀片將葉片切碎，提取30s；將培養(yǎng)皿中的液體用30μm 濾網(wǎng)過濾至樣品管中；向樣品管中加入1600μl 的CyStain?UV Precise P 染液，染色30s，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測試。由樣本的熒光強度Mean- x 判斷倍性，4x 熒光強度=2x 熒光強度×2。以二倍體“紅陽”獼猴桃為對照（2n = 2x = 58），至少檢測2000 個細(xì)胞。

物候期調(diào)查：調(diào)查并記錄全部所選材料連續(xù)3年內(nèi)獼猴桃植株主要的物候期，即萌芽期、展葉期、花期、果實成熟期（雌株）和休眠期。基于親本選擇而非品種選育目的考慮，未細(xì)分每個物候期。

果實感官評價：在果實成熟期內(nèi)每個單株隨機取6 個果實，參考《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南 獼猴桃屬》（NY/T 2351 - 2013），記錄果形、果皮顏色、果肉顏色，測定單果重、可溶性固形物含量、干物質(zhì)含量等。軟棗獼猴桃單果重的測算以20 個果實為一組，取平均值。取果柄和花萼端果肉擠汁混合，用數(shù)顯糖度計檢測可溶性固形物含量。稱取15g鮮果肉，切薄片后置于恒溫干燥箱65℃烘24h后稱重，計算干物質(zhì)含量。干物質(zhì)含量（%）=干重/鮮重×100%，重復(fù)3 次。

果實主要營養(yǎng)成分測定：待軟棗獼猴桃‘寶貝星’、‘魁綠’、HN - AA - 03067 果實自然軟熟后，去除果皮，取中心果肉測定蛋白質(zhì)、維生素C、維生素B2、可溶性糖、總酸、K、Na、Ca、Mg、Zn、Fe、Se 等含量。利用凱氏定氮法（GB 5009.5 - 2016）測定蛋白質(zhì)含量，高效液相色譜法（GB/T 5009.86-2016）測定維生素C含量，高效液相色譜法（GB 5009.85 - 2016）測定維生素B2含量，3，5-二硝基水楊酸比色法（NY/T 2742-2015）測定可溶性糖含量，酸堿滴定法（GB/T 12456- 2008）測定總酸含量，電感耦合等離子體發(fā)射光譜法（ICP- OES）（GB 5009.268 -2016）測定K、Na、Ca、Mg、Zn、Fe元素含量，氫化物原子熒光光譜法（GB 5009.93-2017）測定Se含量。

果實耐貯性測試：每份材料隨機取成熟果實12個，置于果盤中，1 ± 0.5℃條件下存放91d 后，統(tǒng)計出現(xiàn)斑點或腐爛、失水的果數(shù)。取5 個果實測定壓力（硬度測試），取平均值，3 次重復(fù)。

數(shù)據(jù)分析：采用Origin 8 軟件中的Turkey 對部分指標(biāo)做差異顯著性檢驗，差異檢測水平為0.05。

2 實驗儀器與試劑

2.1 儀器

實驗所使用的主要儀器包括流式細(xì)胞儀、數(shù)顯糖度計、硬度計、自動凱氏定氮儀、定氮蒸餾裝置、高效液相色譜儀、電感耦合等離子體質(zhì)譜儀、微波消解儀、原子熒光光譜儀等。

2.2 試劑

實驗所使用的主要試劑包括：CyStain?UV Precise P裂解液、溴甲酚綠指示劑（C21H14Br4O5S）、亞甲基藍(lán)指示劑（C16H18ClN3S·3H2O）、偏磷酸（HPO3）n、磷酸三鈉（Na3PO4·12H2O）、L-半胱氨酸（C3H7NO2S）、十六烷基三甲基溴化銨（C19H42BrN）、L（+）-抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品、D（+）-抗壞血酸（異抗壞血酸）標(biāo)準(zhǔn)品、三水乙酸鈉（CH3COONa·3H2O）、木瓜蛋白酶、高峰淀粉酶、葡萄糖（C6H12O6）、維生素B2標(biāo)準(zhǔn)品（C17H20N4O6）、3，5 -二硝基水楊酸（DNS）、酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6·4H2O）、亞 鐵 氰 化 鉀［K4Fe（CN）6·3H2O］、乙 酸 鋅［（CH3COO）2Zn］、氬 氣（Ar）、氦 氣（He）、金元素（Au）溶液、硼氫化鈉（NaBH4）、鐵氰化鉀［K3Fe（CN）6］、硒標(biāo)準(zhǔn)溶液，等；試劑均為國產(chǎn)，分析純。

3 結(jié)果及分析

染色體倍性檢測：本文利用流式細(xì)胞儀對42 份中華獼猴桃、14 份軟棗獼猴桃材料進(jìn)行了染色體倍性測定。結(jié)果表明：14 份軟棗獼猴桃均為四倍體，包括綠肉品種‘魁綠’和紅肉品種‘寶貝星’；42 份中華獼猴桃雌雄株均含有二倍體、四倍體倍性小種，其中四倍體雌株4 份（JXFX - CK - 04186OP1、05D、11E、‘金 實 1 號’）、雄 株 6 份（JXQS - CK -04266OP1、JXQS- CK- 04249OP2、JXFX- CK- 04137-OP32、JXFX - CK - 04136OP6、JXFX - CK - 04198、SF- M0833）。不同獼猴桃資源的基礎(chǔ)信息及其染色體倍性如表1 所示。

表1 不同獼猴桃資源的基礎(chǔ)信息及其染色體倍性Table 1 Basic information and chromosome ploidy of Actinidia resources

（續(xù)表1）

獼猴桃物候期調(diào)查：從表2 可見，中華獼猴桃與軟棗獼猴桃的萌芽期、展葉期、花期接近。中華獼猴桃萌芽期集中分布于3 月上中旬，展葉期為3 月中旬至4 月中旬，花期大部分為4 月中下旬，最晚可達(dá)5月上旬（SF- F0811、05D）；軟棗獼猴桃萌芽期為2月下旬至3 月上旬，展葉期為3 月中下旬，花期除JXFX-AA - 04021 為5 月上旬外，其他均為4 月下旬。兩種獼猴桃果實成熟期和休眠期差別較大，中華獼猴桃成熟期跨度為9 月中旬至10 月下旬，軟棗獼猴桃集中為8 月上中旬；中華獼猴桃休眠期始于12 月，比軟棗獼猴桃晚1 個月左右。

表2 獼猴桃物候期調(diào)查Table 2 Phenological period of Actinidia resources

（續(xù)表2）

果實感官評價：果實的感官評價可以引導(dǎo)消費行為，是育種研究的一個重要參考。為了篩選合適的母本，從受試材料中抽取9 份中華獼猴桃和3 份軟棗獼猴桃果實進(jìn)行感官評價，將果形、顏色、果心硬度、單果重、可溶性固形物含量和干物質(zhì)含量作為評價指標(biāo)（圖1、表3）?？诟袦y試表明，兩種獼猴桃軟熟后果心都軟，不存在“硬心”現(xiàn)象，但其他感官指標(biāo)呈多樣性。中華獼猴桃單果重和可溶性固形物含量顯著高于軟棗獼猴桃（P ＜0.05）。中華獼猴桃果實為卵形或橢圓形，果皮偏褐色，果肉顏色多樣，果實大小變異較大。根據(jù)果實大小的顯著性差異，可將受試中華獼猴桃分為3 組。05D 最大（121.1g），顯著高于其他材料（P ＜0.05），其次為‘金實1 號’和11E，單果重80g 左右；‘紅陽’等其他材料單果重最小，約為40g（非商品果園）。但可溶性固形物含量，05D最低，僅為11.7%，顯著低于其他材料（P ＜0.05）；SF - F0814 最高，為18.3%。干物質(zhì)含量，05D為最低的14.7%，其他均在20%左右。軟棗獼猴桃果形為橢圓形至長橢圓形，表皮為綠色，單果重均在7g以下，差異不顯著（P ＞0.05）?？扇苄怨绦挝锖砍尸F(xiàn)顯著差異‘魁綠’最高，‘寶貝星’最低。干物質(zhì)含量方面，三者差別不明顯，均較高，在20%左右。

圖1 部分獼猴桃材料果實的果皮、果肉顏色Figure 1 Color of peel and pulp of some kiwifruit materials

表3 獼猴桃果實感官評價Table 3 Sensory evaluation of fruits

軟棗獼猴桃主要營養(yǎng)成分測定：為進(jìn)一步評估軟棗獼猴桃作為母本的潛力，測定了‘寶貝星’、‘魁綠’、HN- AA - 03067 主要營養(yǎng)成分。結(jié)果表明：3種材料的主要營養(yǎng)成分存在不同程度的差異?！畬氊愋恰牡鞍踪|(zhì)含量顯著低于‘魁綠’和HN - AA -03067（P ＜0.05）。HN - AA - 03067 的維生素C 含量高達(dá)162mg/100g，是‘寶貝星’的2.44 倍、‘魁綠’的4 倍。糖酸含量及其比例是最關(guān)鍵的營養(yǎng)指標(biāo)之一，也是影響口感的重要因素。三者相比，‘魁綠’的可溶性糖含量最高而總酸含量最低，7.77 的糖酸比是‘寶貝星’、HN - AA - 03067 的兩倍多。說明‘魁綠’口感優(yōu)于‘寶貝星’和HN - AA - 03067。3 種材料的微量元素含量不盡相同，寶貝星的鎂、硒含量較高，‘魁綠’的鈣含量較高，而HN- AA-03067 的鉀、 鈉、鐵含量較高（表4）。

表4 軟棗獼猴桃主要營養(yǎng)成分Table 4 Main nutrients of kiwiberries

果實耐藏性測試：超過貯藏期的獼猴桃果實，往往表現(xiàn)為斑點直至完全腐爛或失水干縮，失去商品性能。從表5 中的評價結(jié)果可見，經(jīng)過91d 的冷藏后，僅‘金實1 號’未出現(xiàn)斑點或腐爛，‘紅實2 號’、‘紅陽’和SF201024 顯著高于其他受試材料；幾種材料幾乎沒有失水；果實壓力反映果實的硬度，壓力越小，果實越軟。在7 個中華獼猴桃材料中，‘金實1號’最大，顯著高于其他材料（P ＜0.05）。綜上，耐藏能力排序依次為：‘金實1 號’＞SF - F0814、11E、Hort 16A ＞‘紅實2 號’、‘紅陽’、SF201024。

表5 果實耐貯性評價Table 5 Storability evaluation of kiwifruits

4 結(jié)論與討論

4.1 結(jié)論

本文對具有代表性的42 份中華獼猴桃材料與14份軟棗獼猴桃材料的物候期進(jìn)行了田間調(diào)查，測定分析了兩大類獼猴桃的染色體倍性和部分材料的果實感官品質(zhì)、主要營養(yǎng)成分及貯藏性。主要結(jié)論如下：①軟棗獼猴桃均為四倍體，而中華獼猴桃存在二倍體和四倍體兩個倍性小種；②兩類獼猴桃的萌芽期、展葉期、花期比較接近，但軟棗獼猴桃果實的成熟期和休眠期較中華獼猴桃早；③兩類獼猴桃果實在果形、果皮顏色、果肉顏色、單果重、可溶性固形物含量和干物質(zhì)含量等方面呈現(xiàn)不同程度的差異，中華獼猴桃單果重和可溶性固形物含量均顯著高于軟棗獼猴桃（P ＜0.05）；④在3 種軟棗獼猴桃材料中，HN- AA-03067 的VC含量最高，而‘魁綠’的可溶性糖和糖酸比最高；⑤在耐藏能力方面，‘金實1號’＞SF - F0814、11E、Hort 16A ＞‘紅實2 號’、‘紅陽’、SF201024。

4.2 討論

本文測定的42 份中華獼猴桃與14 份軟棗獼猴桃不僅有生產(chǎn)上的主栽品種，還有一些潛在利用價值高的種質(zhì)資源。本文首次公開報道了第二代紅肉獼猴桃‘紅實2 號’為二倍體，極耐貯藏黃肉品種‘金實1 號’和紅肉軟棗獼猴桃‘寶貝星’為四倍體，為今后開發(fā)利用這些獼猴桃優(yōu)良品種奠定了一定的遺傳基礎(chǔ)。本研究還表明，中華獼猴桃與軟棗獼猴桃存在著一定程度的物候期差異，意味著如果兩類獼猴桃雜交可以獲得采收期不同的后代。另外，本文較系統(tǒng)地比較了兩類獼猴桃的果實感官品質(zhì)，同時比較分析了3 份軟棗獼猴桃資源的營養(yǎng)成分差異，為中華獼猴桃與軟棗獼猴桃種間雜交親本的選擇提供了科學(xué)依據(jù)，也為同行開發(fā)利用受試品種提供了參考。

獼猴桃作為雌雄異株植物，母本評價相對容易，但由于雄株不結(jié)實，對雄株的評價難以全面及時。因此，優(yōu)良雄株父本還需要根據(jù)花粉活力測試、直感效應(yīng)及后代系統(tǒng)性評價等綜合確定。