泊沙康唑原料細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的建立

耿 雪，南紅燕，范治云，劉 娜，祝清芬，李 軍*

（1. 山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局仿制藥研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東省仿制藥一致性評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250101；2. 山東金城醫(yī)藥研究院有限公司，山東 淄博 255000）

泊沙康唑（posaconazole）是伊曲康唑的衍生物，商品名Noxafil，為第二代三唑類抗真菌藥物，與第一代相比具有更強(qiáng)、更廣的抗菌譜，適用于免疫系統(tǒng)嚴(yán)重受損的患者[1]。作用機(jī)制為抑制一種對(duì)真菌細(xì)胞色素P450具有依賴性的酶-羊毛甾醇14α-去甲基化酶，使麥角甾醇合成受阻從而導(dǎo)致真菌細(xì)胞膜上麥角甾醇缺失[2]。泊沙康唑原研廠家為原先靈葆雅公司，2005年11月其口服混懸液在歐洲首次上市，為了適用于需要靜脈給藥或不能口服用藥的患者，后又研制出不同劑型。美國(guó)FDA分別于2009年、2013年和2014年批準(zhǔn)了Merck公司生產(chǎn)的泊沙康唑口服混懸液（40 mg/ml）、緩釋片劑（100 mg/片）及泊沙康唑注射液（16.7 ml:300 mg）上市，此3種劑型也已獲得我國(guó)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局（NMPA）批準(zhǔn)進(jìn)口。我國(guó)目前已有注射液仿制藥產(chǎn)品上市。

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查為注射劑安全性檢查的重要項(xiàng)目。建立泊沙康唑注射液原料的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法也是對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行控制的重要一環(huán)。目前，各國(guó)藥典及原研產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)對(duì)泊沙康唑原料細(xì)菌內(nèi)毒素限度并無(wú)規(guī)定，國(guó)內(nèi)也尚無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，亟需研究建立一種泊沙康唑原料的細(xì)菌內(nèi)毒檢查方法。泊沙康唑的分子式為C37H42F2N8O4，相對(duì)分子質(zhì)量700.78，在水和酸性介質(zhì)中溶解度小[3]。建立細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的前提是樣品應(yīng)溶于水或合適的檢查溶劑中[4]，常規(guī)方法不能實(shí)現(xiàn)該原料的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，故采用合適的溶劑并進(jìn)行方法適用性考察是本研究的重點(diǎn)。本研究將為泊沙康唑原料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中制定細(xì)菌內(nèi)毒素檢查項(xiàng)提供依據(jù)，同時(shí)為其他三唑類抗菌產(chǎn)品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ZH-2型自動(dòng)漩渦混合器（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）；ET-96內(nèi)毒素凝膠法測(cè)定儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）；XSR-205DU電子天平（梅特勒-托利多公司）。

1.2 材料與試劑

鱟試劑1，批號(hào)：2010193，標(biāo)示靈敏度（λ）：0.25 EU/ml，湛江博康海洋生物有限公司；鱟試劑2，批號(hào)：2006281，λ：0.25 EU/ml，湛江安度斯生物有限公司； 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水），批號(hào)：2002180，規(guī)格：5 ml/支，湛江安度斯生物有限公司；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（WSE，批號(hào)：150601-202089，效價(jià)：90 EU/支，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；泊沙康唑（批號(hào)：S07002102001，S07002103001，S07002103002，山東金城昆侖藥業(yè)有限公司）；吐溫80（批號(hào)：20180420，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；四氫呋喃（批號(hào)：20200210，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 試劑靈敏度復(fù)核

按《中國(guó)藥典》2020年版四部通則1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法[5]項(xiàng)下鱟試劑靈敏度復(fù)核的要求，分別對(duì)兩批鱟試劑進(jìn)行靈敏度復(fù)核，結(jié)果2010193批鱟試劑靈敏度的測(cè)定值（λc）=0.177 EU/ml，2006281批鱟試劑λc=0.125 EU/ml，兩批鱟試劑λc均在0.5λ～2.0λ之間，兩批鱟試劑均可用于試驗(yàn)。

2.2 限值計(jì)算

根據(jù)泊沙康唑注射液說(shuō)明書(shū)，本品用法用量為：適用于18歲及以上人群，靜脈滴注，首日300 mg/次，一天兩次；維持劑量，300 mg/次，一天一次。按下式計(jì)算細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）。

式中，K為人每千克體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，注射劑K=5.0 EU/(kg·h)；M為人用每千克體重每小時(shí)的最大供試品劑量，人均體重按60 kg計(jì)算，得M=5 mg/(kg·h)，經(jīng)計(jì)算得泊沙康唑的內(nèi)毒素限值為1.0 EU/mg，從嚴(yán)制訂限值為0.5 EU/mg。

2.3 泊沙康唑溶解方法的確立

泊沙康唑不溶于水，可溶解于二甲基亞砜、無(wú)水乙醇等有機(jī)溶劑，但進(jìn)一步用水稀釋后會(huì)形成沉淀析出。本試驗(yàn)考慮采用有機(jī)溶劑加助溶劑吐溫80進(jìn)行配伍溶解供試品。分別將吐溫80和四氫呋喃按1:1，1:2，1:4，1:8體積配比配制成混合溶液，作為溶劑溶解供試品，肉眼觀察供試品的溶解情況。最終確定四氫呋喃-吐溫80（4:1）溶液作為溶劑，可制備成最大濃度為50 mg/ml的供試品溶液（完全溶解），進(jìn)一步用BET水稀釋至1 mg/ml后，形成白色混懸液，可用作細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

2.4 供試品干擾試驗(yàn)

2.4.1 干擾試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn) 目前市售鱟試劑靈敏度一般在0.5～0.015 EU/ml之間，本品細(xì)菌內(nèi)毒素限值為0.5 EU/mg。根據(jù)供試品的最小有效濃度（MVC）=鱟試劑的標(biāo)示靈敏度（λ）/L，計(jì)算得到相應(yīng)的供試品最小有效濃度分別為1，0.5，0.25，0.125，0.06，0.03 mg/ml。

取批號(hào)為S07002102001的供試品，批號(hào)為2010193的鱟試劑（λ為0.25 EU/ml）進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。取供試品，用四氫呋喃-吐溫80（4:1）溶液配制成濃度為50 mg/ml的供試品溶液，并進(jìn)一步用BET水稀釋成為濃度為1，0.5，0.25，0.125，0.062，0.031 mg/ml的供試品溶液（稀釋過(guò)程中溶液會(huì)變渾濁）；另分別取用BET水稀釋制備的濃度為2，1，0.5，0.25，0.125，0.062 mg/ml的供試品溶液，加入等體積的4.0λ內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液。每一濃度平行做2支供試品管，2支供試品陽(yáng)性對(duì)照管，另設(shè)2支陰性對(duì)照（BET水）管，2支陽(yáng)性對(duì)照（2.0λ內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液）管。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。經(jīng)預(yù)試，本品在1 mg/ml及以下濃度時(shí)對(duì)試驗(yàn)無(wú)干擾作用。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，采用兩個(gè)生產(chǎn)廠家的鱟試劑對(duì)供試品進(jìn)行正式干擾試驗(yàn)。

表1 細(xì)菌內(nèi)毒素干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

2.4.2 干擾試驗(yàn) 取供試品，用四氫呋喃-吐溫80（4:1）溶液配制成濃度為50 mg/ml的供試品溶液。用BET水將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶，并稀釋制成0.50，0.25，0.125，0.0625 EU/ml細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液；同時(shí)取1.0，0.50，0.25，0.125 EU/ml細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別加入等體積的2 mg/ml供試品溶液，制備含細(xì)菌內(nèi)毒素的供試品溶液。使用兩個(gè)生產(chǎn)廠家的鱟試劑（鱟試劑1、鱟試劑2）進(jìn)行試驗(yàn)，觀察供試品濃度為1 mg/ml時(shí)對(duì)試驗(yàn)的干擾情況。細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液每一濃度平行做2管，含細(xì)菌內(nèi)毒素的供試品溶液每一濃度平行做4管，同時(shí)另取BET水和1 mg/ml供試品溶液各做兩支對(duì)照管。3批同法操作。

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。分別計(jì)算內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（Es）和含細(xì)菌內(nèi)毒素的供試品溶液反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（Et），判斷供試品對(duì)試驗(yàn)有無(wú)干擾作用。結(jié)果表明，供試品溶液和陰性對(duì)照溶液（BET水）的所有平行管均為陰性，且系列濃度供試品溶液的結(jié)果符合鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)要求（Es均在0.5λ～2.0λ之間），該試驗(yàn)有效。所有批次含細(xì)菌內(nèi)毒素的1 mg/ml供試品溶液的結(jié)果符合鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)要求（Et均在0.5λ～2.0λ之間），認(rèn)為供試品濃度為1 mg/ml時(shí)對(duì)試驗(yàn)無(wú)干擾作用。

表2 細(xì)菌內(nèi)毒素干擾試驗(yàn)結(jié)果

2.5 供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

取供試品，按《中國(guó)藥典》2020年版四部通則1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，采用鱟試劑1對(duì)3批供試品進(jìn)行檢查。結(jié)果3批供試品內(nèi)毒素含量均小于0.5 EU/mg，符合規(guī)定。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 泊沙康唑細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果

3 討論

細(xì)菌內(nèi)毒素作為細(xì)菌死亡或解體后才釋放出來(lái)的一種具有生物活性的物質(zhì)，具有耐熱性強(qiáng)、可過(guò)濾的特點(diǎn)[6]，通過(guò)注射進(jìn)入血液會(huì)對(duì)人的健康甚至生命安全產(chǎn)生巨大影響?！端幤稧MP指南》要求，在注射劑（無(wú)菌制劑）生產(chǎn)的各個(gè)過(guò)程都應(yīng)對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素進(jìn)行控制[7]，雖然在各個(gè)環(huán)節(jié)都存在內(nèi)毒素被帶入藥物中的風(fēng)險(xiǎn)，但從源頭對(duì)泊沙康唑原料的細(xì)菌內(nèi)毒素含量進(jìn)行控制更為有效。

本研究建立了泊沙康唑原料的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法。因本品不溶于水、乙醇、DMSO等溶劑，采用四氫呋喃-吐溫80（4:1）溶液作為溶劑先溶解供試品后，進(jìn)一步用水稀釋進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒檢查。結(jié)果表明，泊沙康唑在1 mg/ml及以下濃度時(shí)對(duì)試驗(yàn)無(wú)干擾作用。泊沙康唑原料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建議制訂為：取本品，加四氫呋喃-吐溫80（4:1）溶液溶解制成每1 ml中含泊沙康唑50 mg的溶液，依法檢查（《中國(guó)藥典》2020年版四部通則1143），每1 mg泊沙康唑中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于0.5 EU（供注射用）。此外，對(duì)于不溶于水的原料建立細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法，應(yīng)充分考慮非水溶劑對(duì)供試品中內(nèi)毒素的干擾情況。本研究也為其他不溶于水的原料品種建立細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法提供了依據(jù)。