大鼠纖維化肝組織中SHP1表達與肝星狀細胞活化及增殖的關系*

郝禮森，陳盼盼，靳麗敏，展宗媛，楊小師，季景秀，蔣美鈺，莫艷波

(華北理工大學附屬醫(yī)院消化內科，河北 唐山 063000)

肝纖維化是各種慢性肝病演變?yōu)楦斡不牟±磉^程，而肝星狀細胞 (hepatic stellate cells,HSC) 則是參與此病理過程的最重要細胞，其活化、增殖是肝纖維化形成與發(fā)展的重要環(huán)節(jié)[1-3]。含SH2結構域的蛋白酪氨酸磷酸酶1(SH2 domain-containing protein tyrosine phosphatase 1,SHP1)是一種非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶，最初的研究發(fā)現其主要表達于造血細胞，是造血系統(tǒng)的抑癌因子，但進一步的研究發(fā)現SHP1在一些非造血細胞如上皮細胞、肝細胞中也有表達，其表達缺失或低表達不僅在造血系統(tǒng)腫瘤的形成及發(fā)展中發(fā)揮重要作用，也參與一些實體腫瘤及某些非腫瘤性疾病的病理過程[4-6]。在SHP1與肝臟疾病的研究中發(fā)現[6,7]，SHP1不僅表達于肝細胞，也表達于HSC，其過表達可通過下調血小板衍生生長因子β信號轉導而抑制體外活化肝星狀細胞增殖。另有研究顯示[8]，SHP1的活性增強可通過負性調控其下游的信號轉導子和轉錄激活子3而促進體外活化肝星狀細胞凋亡。但肝纖維病理過程中，SHP1在肝組織及在體HSC的表達與在體肝星狀細胞活化及增殖的關系仍不清楚。因此，本研究采用腹腔注射四氯化碳法建立大鼠肝纖維化模型，檢測纖維化肝組織及在體HSC的SHP1表達，并探討其表達變化與在體肝星狀細胞活化及增殖的關系，以期為深化探討肝纖維化發(fā)病機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試劑

小鼠抗a-平滑肌肌動蛋白 (alpha-smooth muscle actin,α-SMA)單克隆抗體購于臺灣arigo公司，兔抗 SHP1單克隆抗體購于美國BioWorld公司；四甲基異硫氰酸羅丹明標記的山羊抗小鼠IgG及異硫氰酸熒光素標記的山羊抗兔IgG 購于美國KPL公司；Masson染色試劑盒購于北京雷根生物有限公司；SP試劑購于北京中山金橋生物有限公司。

1.2 大鼠肝纖維化模型的構建

50只清潔級健康雄性 SD大鼠(350～400 g)由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。實驗過程由華北理工大學實驗動物倫理委員會負責審核。所有動物均在實驗室按清潔級大鼠要求飼養(yǎng)，自由進食水。采用腹腔注射四氯化碳法構建大鼠肝纖維化模型[9]，50只大鼠被隨機分為：對照組(10只)、模型組(40只)。模型組大鼠腹腔注射50%的四氯化碳橄欖油混合液，劑量為1 ml/kg，每周2 次，共8周；對照組大鼠腹腔注射生理鹽水，劑量同模型組，每周2 次。在造模后 2周、4周、6周、8周分別取10只模型組大鼠，給予10%的水合氯醛腹腔注射麻醉，無菌條件下切開大鼠腹腔，切取適量大鼠肝組織，用4%多聚甲醛固定后用于免疫組織化學及HE、Masson三色染色。對照組大鼠肝組織標本同8周模型組大鼠一同留取。

1.3 肝組織病理學及 SHP1和α-SMA免疫組織化學染色檢查

大鼠肝組織以4%多聚甲醛溶液固定，石蠟常規(guī)包埋并做成5 μm的連續(xù)切片，進行HE及Masson三色染色，觀察肝組織病理學變化。應用SP法進行SHP1及α-SMA免疫組織化學染色，操作步驟按試劑說明書進行。用PBS代替一抗進行陰性對照染色，染色結果判定為棕褐色代表陽性表達。SHP1及α-SMA免疫組化染色圖像應用Image Pro Plus 6.0軟件進行分析，平均光密度值 (mean optical density,MOD) 被用于表示SHP1及α-SMA陽性表達水平。

1.4 SHP1與α-SMA免疫熒光雙標記檢測在體HSC的SHP1表達

常規(guī)脫蠟及水化的大鼠肝組織切片經抗原修復、血清封閉，加入兔抗SHP1單克隆抗體(1∶100稀釋)及小鼠抗α-SMA 單克隆抗體(1∶100稀釋)的一抗，于4℃冰箱中過夜，PBS清洗3次，每次5 min；滴加異硫氰酸熒光素標記的山羊抗兔IgG(1∶100稀釋)二抗，37℃恒溫箱中孵育30 min，PBS清洗3次，每次5 min；滴加四甲基異硫氰酸羅丹明標記的山羊抗小鼠IgG(1∶200稀釋)三抗，37℃恒溫箱中內孵育30 min，PBS 清洗3次，每次5 min；滴加DAPI避光孵育10 min染核。陰性對照用PBS代替一抗，其余步驟同上。用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察經上述處理的肝組織切片，綠色熒光斑點為SHP1陽性表達，紅色熒光斑點為α-SMA陽性表達，黃色熒光斑點為SHP1與α-SMA共表達。由于α-SMA是活化HSC的標志[10]，肝組織中除血管壁平滑肌細胞表達少許α-SMA外只有活化HSC表達α-SMA，故肝組織中表達α-SMA的細胞即可認為是在體活化HSC，SHP1與α-SMA共表達可看做是在體活化HSC的SHP1表達。

1.5統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 大鼠肝組織的病理組織學變化

HE及Masson三色染色顯示，在造模過程中，隨著造模時間延長，大鼠肝組織的纖維化逐漸加重，造模不同時間均可見不同程度的肝細胞變性壞死而導致正常肝細胞逐漸減少(圖1，圖2)。該結果表明，四氯化碳誘導的大鼠肝纖維化模型構建成功。

Fig. 1 HE staining showed pathological histological changes of rats liver tissues (×200)

Fig. 2 Masson trichrome staining showed histopathological changes of rats liver tissues (×200)

2.2 在體HSC的活化與增殖

α-SMA是HSC活化的標志，肝組織中除活化HSC表達α-SMA外，僅有血管壁平滑肌細胞表達少許α-SMA，故肝組織的α-SMA表達水平可間接反應在體HSC的活化及增殖。大鼠肝組織α-SMA免疫組織化學染色檢測結果顯示，在對照組大鼠肝組織僅有血管壁平滑肌細胞表達α-SMA，與對照組大鼠肝組織α-SMA陽性表達MOD比較，造模不同時間(2周、4周、6周、8周)大鼠纖維化肝組織的α-SMA陽性表達MOD均明顯增加(P<0.05)，且隨著造模時間的延長逐漸升高(P<0.05)。上述結果顯示，隨著大鼠肝纖維化的加重，在體HSC的活化及增殖逐漸加快 (圖3，表1)。

Fig. 3 The expressions of α-SMA in rats liver tissues were analyzed through immunohistochemical staining (×400)

Tab. 1 The positive expression MOD levels of α-SMA and SHP1 in liver tissues of rats in each group n=10)

2.3 大鼠纖維化肝組織的SHP1表達

大鼠肝組織SHP1免疫組織化學染色檢測顯示，SHP1主要表達于細胞漿，與對照組大鼠肝組織的SHP1陽性表達MOD比較，造模不同時間(2周、4周、6周及8周)大鼠纖維化肝組織中SHP1陽性表達MOD均明顯增加(P<0.05)，且隨著造模時間的延長逐漸升高(P<0.05，圖4，表1)。上述結果顯示，大鼠肝纖維化病理過程中其肝組織的SHP1表達變化與肝纖維化程度一致，即隨著肝纖維化程度的加重而逐漸升高。

Fig. 4 The expressions of SHP1 in rats liver tissues were analyzed through immunohistochemical staining (×400)

2.4 在體HSC的SHP1表達

SHP1與α-SMA免疫熒光雙標記檢測顯示，綠色熒光斑點為SHP1陽性表達，紅色熒光斑點為α-SMA陽性表達，黃色熒光斑點為SHP1與α-SMA共表達(肝組織中在體活化HSC的SHP1表達)。對熒光圖像進行分析顯示，大鼠肝纖維化過程中，伴隨肝纖維化的加重，造模不同時間(2周、4周、6周、8周)的大鼠肝組織中表達SHP1的活化HSC占總的活化HSC的百分比(26.49%±3.44%、37.14%±4.57%、44.90%±2.94%、58.09%±5.33%)逐漸升高(P<0.05，圖5)。

2.5 SHP1表達與在體HSC活化及增殖的相關性分析

Pearson’s相關性分析顯示，不僅大鼠纖維化肝組織的SHP1免疫組織化學染色檢測結果與大鼠肝組織的α-SMA免疫組織化學染色檢測結果呈顯著正相關(r值為0.926,P<0.05)，而且大鼠纖維化肝組織中表達SHP1的活化HSC占總的活化HSC的百分比也與大鼠肝組織的α-SMA免疫組織化學染色檢測結果呈顯著正相關(r值為0.984,P<0.05)。如上所述，α-SMA是HSC活化的標志，肝組織的α-SMA表達水平可反映在體HSC的活化及增殖。故上述分析結果表明，在四氯化碳誘導的大鼠肝纖維化病理過程中，纖維化肝組織及在體HSC的SHP1表達變化均與在體HSC的活化及增殖呈顯著正相關。

Fig. 5 SHP1 expressions of activated HSC in rats liver tissues was analyzed through Immunofluorescence double-labeling of SHP1 and α-SMA (×400)

3 討論

SHP1是蛋白酪氨酸磷酸酶家族中的重要成員，表達于造血細胞以及上皮細胞、肝細胞等非造血細胞，是造血系統(tǒng)腫瘤及一些實體腫瘤的抑癌因子[4]。在肝組織中，SHP1不僅在肝細胞中表達并參與肝臟炎癥反應的調節(jié)[6]，而且也表達于在肝纖維化病理過程中發(fā)揮重要作用的肝星狀細胞[7]。研究發(fā)現SHP1過表達可通過負性調控血小板衍生生長因子β信號轉導而抑制體外活化肝星狀細胞的增殖[7]；另有研究發(fā)現[8,11]，體外活化HSC的SHP1活性增強可通過下調其下游的信號轉導子和轉錄激活子3，從而顯著抑制體外活化HSC的增殖，并誘導體外活化HSC凋亡。本研究顯示，在大鼠肝纖維化病理過程中肝組織的SHP1表達變化與肝纖維程度一致，即隨著肝纖維化的加重而逐漸升高。眾所周知，肝臟的主要細胞是肝細胞，而本研究顯示在大鼠肝纖維化病理過程中，隨著造模時間延長肝纖維化逐漸加重，其肝細胞不斷變性壞死而逐漸減少，這與SHP1表達逐漸升高相矛盾。為探討導致上述結果的原因，本課題組進一步檢測大鼠肝纖維化過程中在體活化HSC的SHP1表達變化。由于正常肝臟中的HSC處于靜止狀態(tài)、不表達α-SMA，在肝臟受到損傷時HSC活化為肌成纖維細胞，其表型發(fā)生改變，具有較強的增殖能力并表達α-SMA，因此α-SMA被視為活化HSC的標志[3,10,12,13]。本研究應用SHP1與α-SMA免疫熒光雙標記檢測大鼠纖維化肝組織中在體活化HSC的SHP1表達，結果顯示隨著肝纖維化程度的逐漸加重大鼠纖維化肝組織中表達SHP1的活化HSC占總的活化HSC的百分比逐漸升高。這提示大鼠肝纖維化病理過程中肝組織的SHP1表達逐漸升高可能與表達SHP1的活化HSC逐漸增多有關。但已有研究發(fā)現肝細胞的SHP1參與肝臟炎癥反應的調節(jié)[6]，而肝纖維化過程中肝臟一直存在炎癥反應，纖維化肝組織中SHP1表達升高是否為肝臟炎癥反應所致尚需進一步研究。

α-SMA被視為HSC活化的標志，故本研究應用免疫組織化學染色檢測大鼠肝組織的α-SMA表達以間接檢測在體HSC的活化及增殖。結果顯示，隨著大鼠肝纖維化的加重纖維化肝組織的α-SMA表達逐漸升高，表明大鼠纖維化肝組織中在體HSC的活化及增殖隨著肝纖維化程度的加重而逐漸加快。為探討大鼠肝纖維化病理過程中SHP1在肝組織及在體肝星狀細胞的表達變化與在體肝星狀細胞活化和增殖的相關性，本研究分別對大鼠纖維化肝組織的SHP1免疫組織化學染色檢測結果和肝組織中表達SHP1的活化HSC占總的活化HSC的百分比與反映在體HSC活化及增殖的肝組織α-SMA免疫組織化學染色檢測結果進行Pearson's相關性分析，結果顯示無論是大鼠纖維化肝組織還是在體肝星狀細胞的SHP1表達均與在體肝星狀細胞活化及增殖呈顯著正相關。但已有體外研究證實[7]，作為蛋白酪氨酸磷酸酶的SHP1，其過表達可抑制體外活化肝星狀細胞的增殖。依此推斷大鼠肝纖維化過程中，伴隨在體HSC的活化及增殖加快，SHP1在肝組織及在體HSC的表達應逐漸下降而不是逐漸升高。為什么出現上述結果？可能與SHP1的分子構象有關。研究發(fā)現[14,15]，SHP1磷酸酶活性的發(fā)揮受其分子構象的調控，在無配體結合時SHP1處于自我抑制狀態(tài)，當酪氨酸磷酸化多肽與其結合后，其構象發(fā)生改變、解除抑制狀態(tài)而活化。且有研究發(fā)現SHP1的激動劑如索拉非尼和索拉非尼的衍生物SC-43不僅可通過增強 SHP1的活性抑制體外活化HSC的增殖，并且可通過增強 SHP1的活性減輕膽總管結扎及四氯化碳誘導的小鼠肝纖維[11]。故我們推測，本研究所示大鼠肝纖維過程中肝組織及在體HSC的SHP1表達雖然升高，但其磷酸酶活性并未升高甚至下降，盡管這需要進一步的研究證實。

綜上所述，本研究表明大鼠肝纖維化病理過程中其肝組織及在體肝星狀細胞的SHP1表達發(fā)生了變化，其表達變化不僅與肝纖維化程度一致，而且與在體HSC的活化及增殖呈顯著正相關。結合以往相關文獻，本研究提示SHP1的上述變化可能通過影響HSC的活化及增殖參與肝纖維化病程，盡管其相關機制尚需進一步研究。