SGLT2i 對腎病綜合征模型大鼠骨代謝的影響

洪文娟，鄒久林，余卓銳，成家茂，何敏華*

（1.大理大學臨床醫(yī)學院，云南大理 671000；2.大理大學第一附屬醫(yī)院，云南大理 671000；3.大理大學基礎醫(yī)學院，云南大理 671000）

鈉-葡萄糖協同轉運蛋白2 抑制劑（sodium glucose cotransporter 2 inhibitor，SGLT2i）是一種新型口服降糖藥物，通過抑制近曲小管中葡萄糖共轉運體的活性，誘導糖尿、滲透性利尿，并降低葡萄糖的再吸收〔1〕。最近研究發(fā)現，SGLT2i 不僅可以降血糖，還有降低血肌酐、減少蛋白尿以及由腎臟疾病引起死亡的作用〔2-3〕。隨著SGLT2i 在腎臟病領域的臨床應用越來越廣泛，其不良反應也日益受到重視。研究表明SGLT2i 卡格列凈可以提高骨轉移率，降低髖部的骨礦物質密度，并增加骨折風險〔4〕。糖皮 質 激 素（glucocorticoid，GC） 是 腎 病 綜 合 征（nephrotic syndrome，NS）的首選用藥，但包括NS在內的慢性腎臟病可引起鈣磷代謝紊亂，使用GC會加重鈣磷代謝異常，甚至引起骨質疏松。目前，不同劑量SGLT2i 對鈣磷代謝的影響以及SGLT2i 聯用GC 是否加重骨質疏松等問題尚無定論。本研究旨在考察不同劑量卡格列凈及聯用GC 對阿霉素腎?。╝driamycin nephropathy，AN）大鼠的治療效果以及對大鼠骨代謝的影響，為NS 的臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要藥物卡格列凈片（西安楊森制藥有限公司，批號：H20170375）；阿霉素（深圳萬樂藥業(yè)有限公司，批號：H44024359）；潑尼松片（華中藥業(yè)股份有限公司，批號：H42021526）。

1.2 實驗動物造模及分組SPF 級雄性SD 大鼠42 只，8 周，體質量250～300 g，購自成都達碩實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（川）2020-030。飼養(yǎng)在大理大學基礎醫(yī)學院動物實驗室，自由攝食水。隨機選取6 只為對照（NG）組，其余36 只大鼠經尾靜脈一次性注射阿霉素6 mg/kg，建立AN 大鼠模型〔5〕，NG 組注射等量0.9%氯化鈉溶液。7 d 后取大鼠眼內眥靜脈血，造模大鼠出現低蛋白血癥（白蛋白ALB（18.34±1.65）g/L）、高脂血癥（甘油三酯（2.86±0.29）mmol/L，膽固醇（4.02±0.55）mmol/L）；檢測24 h 尿蛋白定量（24 h-UTP），大于100 mg 表示造模成功〔6〕。造模大鼠隨機分為6 組，每組6 只：模型（MG）組、潑尼松（PG）組、低劑量卡格列凈（LCG）組、高劑量卡格列凈（HCG）組、低劑量卡格列凈+潑尼松（LPCG） 組和高劑量卡格列凈+潑尼松（HPCG）組。

1.3 藥物干擾按常規(guī)用藥劑量：低劑量卡格列凈100 mg/d，高劑量卡格列凈300 mg/d，潑尼松1 mg/（kg·d），依據人與大鼠用藥量換算方法，PG 組予潑尼松6.3 mg/kg，LCG 組予卡格列凈10.5 mg/kg，HCG 組予卡格列凈31.5 mg/kg，LPCG 組予潑尼松6.3 mg/kg+卡格列凈10.5 mg/kg，HPCG 組予潑尼松6.3 mg/kg+卡格列凈31.5 mg/kg。藥片搗碎后，每天按大鼠空腹體質量計算藥物劑量，用0.9%氯化鈉溶液配制成溶液，NG、MG 組予等量0.9%氯化鈉溶液，每天清晨8 時空腹灌胃，灌胃量1 mL/100 g，療程6 周。

1.4 一般情況觀察每天灌胃前觀察記錄大鼠的一般情況，包括精神、活動、進食、飲水、體毛、大小便、體質量等。

1.5 尿液指標檢測治療結束，將大鼠單獨放置于代謝籠，禁食不禁水，用清潔干燥的容器收集每只大鼠24 h 尿液并記錄總尿量。尿液標本立即送大理大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，用全自動生化分析儀（7000120+ISE+ID 型）檢測24 h-UTP、尿鈣、尿磷。

1.6 骨密度及相關指標檢測藥物治療6 周后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，采用仰臥位固定，送放射科用雙能X 射線骨密度儀（SIEMENS YS10 Max）檢測在體全身及區(qū)域骨密度、全身骨鹽量、全身脂肪量、全身肌肉量。

1.7 血液指標檢測骨密度檢測后，全部大鼠在第2 天清晨空腹狀態(tài)下，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，開腹后下腔靜脈取血4 mL，3 000 r/min 離心10 min，提取上清液，檢測血鈣、血磷、ALB、堿性磷酸酶（ALP）。

1.8 統計分析用SPSS 20.0 軟件進行統計分析，計量資料以（±s）表示。方差齊者采用方差分析并進行兩兩比較；方差不齊者，采用秩和檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 各組大鼠尿液指標的比較灌胃治療6 周后檢測尿液指標并進行比較。與NG 組比較，MG 組的24 h-UTP 水平明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；與MG 組比較，各用藥組24 h-UTP 水平均顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.01）；各用藥組間比較差異均無統計學意義，說明各種藥物治療對降低24 h-UTP 水平均有效，2 種藥聯用與單獨使用相比，24 h-UTP 水平略有下降，但差異無統計學意義。與NG 組比較，各組尿鈣水平均有所上升，其中HCG、LPCG、HPCG 組尿鈣水平明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與MG 組比較，LPCG、HPCG 組尿鈣水平升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與PG組比較，HPCG 組尿鈣水平升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。結果表明高劑量卡格列凈或卡格列凈與潑尼松聯用可能會導致尿鈣排泄增加。與NG 組比較，MG組尿磷水平明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；其余各組尿磷水平雖有所升高，但差異無統計學意義。結果顯示NS 本身可導致尿磷排泄增加，而卡格列凈或潑尼松對尿磷排泄影響不明顯。見表1。

表1 6 周后各組大鼠尿液相關指標的比較（±s，n=6）

表1 6 周后各組大鼠尿液相關指標的比較（±s，n=6）

注：與NG 組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與MG 組比較△P＜0.05，△△P＜0.01；與PG 組比較#P＜0.05。

組別 24 h-UTP/mg 尿鈣/（mmol/L） 尿磷/（mmol/L）NG 組 9.33±2.67 1.47±0.46 15.97±2.43 MG 組 319.46±41.26** 2.52±1.91 43.20±2.88**PG 組 69.79±36.52△△ 2.78±1.15 37.80±9.14 LCG 組 38.07±24.56△△ 3.51±1.17 36.98±2.59 HCG 組 42.14±30.18△△ 4.60±1.84* 37.08±12.94 LPCG 組 32.51±32.62△△ 5.16±3.18**△ 38.92±7.36 HPCG 組 33.17±36.97△△ 5.77±3.11**△# 33.77±8.21 F 41.127 3.697 20.862 P 0.000 0.006 0.002

2.2 各組大鼠血液生化指標的比較灌胃治療6周后檢測血液指標并進行比較。與NG 組比較，MG組的ALB 水平明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.01）；與MG 組比較，PG、LCG、HCG、LPCG、HPCG組的ALB 水平升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。說明各種藥物治療后均可有效升高血清ALB 水平。與NG 組比較，除MG 組外，其余各組血鈣水平均有所升高，但差異無統計學差異。與NG 組比較，PG、HCG 組的血磷水平升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與MG 組比較，PG 組的血磷水平升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；與PG 組比較，LCG、HCG、LPCG、HPCG 組的血磷水平下降，其中LCG、LPCG組與PG 組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。結果表明與正常組比較，潑尼松、高劑量卡格列凈可導致血磷水平明顯升高。各用藥組ALP 水平均升高，其中NG 組與MG、PG、HCG、HPCG 組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；與MG 組比較，其余各組ALP水平均下降，其中LCG 組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。實驗結果表明，疾病本身、潑尼松、高劑量卡格列凈或上述2 種藥聯用可導致ALP 水平明顯升高，均可能與骨質疏松相關。見表2。

表2 6 周后各組大鼠血液相關指標的比較（±s，n=6）

表2 6 周后各組大鼠血液相關指標的比較（±s，n=6）

注：與NG 組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與MG 組比較△P＜0.05，△△P＜0.01；與PG 組比較#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 血磷/（mmol/L） ALP/（mmol/L）NG 組 1.67±0.47 120.38±51.85 MG 組 1.78±0.09 251.70±65.67**PG 組 2.27±0.37**△△ 209.41±88.20*LCG 組 1.84±0.19# 165.63±37.59△HCG 組 2.05±0.20* 213.79±65.08*LPCG 組 1.77±0.10## 190.81±29.99 HPCG 組 1.96±0.23 214.89±49.22*F 2.855 2.608 P 0.027 0.039 ALB/（g/L）26.52±3.62 16.75±1.46**21.60±2.87△△21.55±1.38△20.74±1.58△△23.20±1.19△△22.85±2.01△5.027 0.001血鈣/（mmol/L）2.05±0.22 2.01±0.07 2.35±0.09 2.19±0.10 2.27±0.23 2.24±0.01 2.28±0.11 2.243 0.068

2.3 大鼠骨密度及相關指標的比較

2.3.1 在體全身骨密度及相關指標各組大鼠在體全身骨密度、肌肉及脂肪量經統計分析，差異均無統計學意義。與NG 組相比，PG、HPCG組全身骨鹽量下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；與MG 組比較，PG 組全身骨鹽量下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。結果表明與正常組比較，潑尼松或潑尼松與高劑量卡格列凈聯用，可導致全身骨鹽量下降，是骨質疏松的相關因素之一。見表3。

表3 6 周后各組大鼠全身骨密度及相關指標的比較（±s，n=6）

表3 6 周后各組大鼠全身骨密度及相關指標的比較（±s，n=6）

注：與NG 組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與MG 組比較△P＜0.05。

組別 全身肌肉量/g 全身脂肪量/g NG 組 694.00±36.15 260.00±76.68 MG 組 644.00±115.02 220.50±72.85 PG 組 580.50±153.91 224.50±62.99 LCG 組 620.00±148.98 241.00±67.92 HCG 組 645.17±171.43 234.00±58.16 LPCG 組 604.00±109.54 234.00±71.20 HPCG 組 590.00±131.55 255.67±70.25 F 4.001 0.279 P 0.677 0.943全身骨密度/（g/cm2）0.20±0.06 0.16±0.03 0.13±0.02 0.18±0.06 0.17±0.06 0.15±0.03 0.16±0.05 10.119 0.120全身骨鹽量/g 19.35±1.37 16.90±0.11 11.85±0.27**△16.55±2.25 17.05±4.16 15.03±1.53 13.40±0.22*27.763 0.000

2.3.2 在體區(qū)域骨密度大鼠頭、上肢、大腿、脊柱的在體區(qū)域骨密度經統計分析，差異均無統計學意義。與NG 組比較，PG、HPCG 組的軀干、肋骨骨密度數值下降，差異有統計學意義（P＜0.05），PG、LCG、HCG、LPCG、HPCG 組的骨盆骨密度數值均下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；與MG 組比較，PG、HPCG 組肋骨骨密度數值下降，差異有統計學意義（P＜0.01）。結果顯示，造模未引起在體區(qū)域骨密度明顯變化，與正常組比較。潑尼松和卡格列凈會引起區(qū)域骨密度下降，其中以骨盆骨密度下降最為明顯；而潑尼松或潑尼松與高劑量卡格列凈聯用，可導致軀干、肋骨骨密度下降，增加了骨質疏松及骨折的風險。見表4。

表4 6 周后各組大鼠在體區(qū)域骨密度的比較（±s，n=6）

表4 6 周后各組大鼠在體區(qū)域骨密度的比較（±s，n=6）

注：與NG 組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與MG 組比較△△P＜0.01。

骨密度/（g/cm2）組別 脊柱NG 組 0.15±0.01 MG 組 0.17±0.06 PG 組 0.12±0.02 LCG 組 0.15±0.03 HCG 組 0.14±0.02 LPCG 組 0.12±0.03頭0.38±0.21 0.34±0.00 0.20±0.06 0.57±0.43 0.39±0.24 0.28±0.13上肢0.51±0.47 0.49±0.12 0.11±0.05 0.26±0.20 0.34±0.22 0.11±0.03大腿0.14±0.01 0.13±0.02 0.12±0.02 0.12±0.02 0.13±0.03 0.13±0.01軀干0.13±0.00 0.12±0.01 0.10±0.01*0.11±0.00 0.11±0.01 0.12±0.01肋骨 骨盆0.11±0.00 0.13±0.00 0.12±0.01 0.12±0.01 0.08±0.00*△△ 0.10±0.01*0.09±0.01 0.10±0.00**0.10±0.03 0.11±0.00*0.11±0.01 0.10±0.02*HPCG 組 0.17±0.04 0.60±0.43 0.12±0.01 F 0.44±0.19 0.10±0.02* 0.08±0.00*△△ 0.11±0.00*8.192 11.904 11.353 22.690 22.944 20.350 11.600 P 0.224 0.064 0.078 0.001 0.001 0.002 0.072

3 討論

越來越多的研究發(fā)現，SGLT2i 除降血糖之外有獨立的腎臟保護作用。在SGLT2i 治療包括NS 在內的慢性腎病過程中，主要作用體現在降低尿蛋白，其機制是通過對鈉-葡萄糖協同轉運蛋白2 的抑制，阻斷了近端小管對Na+的攝取，導致輸送至致密斑的Na+增加，刺激轉化生長因子介導的管球反饋，引起入球小動脈收縮，從而降低腎小球內高血壓〔1，7-8〕。GC 作為NS 的治療基石，同時是導致骨質疏松和骨折的一個危險因素，臨床指南建議在開始GC 治療時應考慮使用抗骨質疏松藥物進行預防性治療〔9〕。同時SGLT2i 的副作用也不容小覷，如酮癥酸中毒、泌尿生殖系統感染、骨折、下肢截肢風險和腫瘤等〔10〕。研究認為，SGLT2i 可影響腎小管對鈣、磷酸鹽的吸收和排泄，對骨代謝產生一定影響。在臨床試驗中，與使用安慰劑相比，SGLT2i 引起的下肢截肢風險增加了大約2 倍〔11〕，可能機制或影響因素包括血清磷酸鹽升高、維生素D 水平降低、體質量減少、相對高劑量、低血壓、糖尿病并發(fā)癥等。但Perkovic 等研究表明，卡格列凈與安慰劑組在下肢截肢風險方面沒有顯著性差異〔12〕。因此，SGLT2i 的不良事件仍需大樣本、多中心的臨床實驗和相關基礎實驗進一步予以驗證。

本實驗通過對阿霉素誘導的AN 大鼠模型給予潑尼松、不同劑量卡格列凈或兩者聯合用藥，結果發(fā)現2 種藥物均可有效降低尿蛋白、升高ALB，可用于NS 的治療，但治療過程中均會引起骨盆骨密度的下降。其中潑尼松、高劑量卡格列凈或二者聯用還會引起鈣磷代謝異常、ALP 升高、全身骨鹽量降低及骨密度下降范圍擴大，增加了骨質疏松的風險。目前GC 對骨損傷的作用機制已被充分認識，但SGLT2i 作為一種新型降糖藥，其副作用易被忽視。結合本實驗結果分析，卡格列凈影響腎小管對鈣、磷酸鹽的吸收和排泄，可能打破了成骨細胞和破骨細胞的平衡，使血清ALP 水平增高，骨代謝增加，并表現為骨鹽量減少和骨密度降低。因此，本研究認為SGLT2i 是導致骨質疏松的一個危險因素，且與用藥劑量呈正相關，但其用藥時間以及聯合用藥對骨代謝的影響仍需要更多的實驗予以證實。盡管SGLT2i 致骨折的風險仍有待明確，但在骨質疏松、骨折高風險人群中仍應謹慎使用。NS 患者在使用卡格列凈、潑尼松或二者聯合治療時，建議早期即積極使用抗骨質疏松藥物進行預防性治療，并定期復查血鈣、血磷、ALP、骨密度、甲狀旁腺激素等骨代謝相關指標，積極防治骨質疏松。