損傷程度對甘薯黑斑病侵染特性的影響

龐林江,陸國權(quán),李 云,李曉慧,成紀(jì)予,路興花

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)食品與健康學(xué)院，浙江杭州311300；2.貴州省生物技術(shù)研究所，貴州貴陽550006；3.貴州省園藝研究所,貴州貴陽550006）

甘薯富含維生素、鉀、鐵、鈣、膳食纖維等營養(yǎng)物質(zhì)［1］，具有保健功效和較強(qiáng)的抗氧化特性，是人們喜愛的食物之一。但若貯藏方式不當(dāng)或貯藏環(huán)境不適宜，易受到病原菌侵染，導(dǎo)致甘薯發(fā)生腐爛變質(zhì)，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失［2］。甘薯黑斑病是影響甘薯生產(chǎn)的主要病害之一，在甘薯的栽培和貯藏期間均會發(fā)生，對薯苗與薯塊均有危害。我國每年由該病害導(dǎo)致的甘薯產(chǎn)量損失達(dá)5%～10%，嚴(yán)重時甚至高達(dá)20%～50%［3］。黑斑病會造成甘薯表皮形成黑色斑塊，味苦，有毒。被牛、豬、犬等家畜誤食，會引發(fā)氣喘、中毒，嚴(yán)重時會導(dǎo)致死亡［4］。黑斑病產(chǎn)生的毒素主要有甘薯酮、甘薯醇、甘薯寧和4-薯醇等，這些毒素耐高溫，甘薯蒸煮烤或制酒發(fā)酵等處理，都不易破壞毒素［5］。目前學(xué)者關(guān)注較多的是甘薯黑斑病的防治方向［6］，對其傳播特性的研究鮮有報道。已有研究表明煙薯25對黑斑病具有高抗性［7］，但心香品種具有高感性。以心香、煙薯25 為試驗(yàn)材料，研究兩個甘薯品種在黑斑病菌侵染后病斑的生長情況和侵染特性，以期為甘薯生產(chǎn)和貯藏過程中的黑斑病防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

甘薯品種：心香和煙薯25，于2019年7月采集自浙江杭州甘薯試驗(yàn)場。黑斑病病菌：由江蘇省徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供，需置于4℃冰箱保存。

試劑：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）為生化試劑，購于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

儀器設(shè)備：SW-CJ-1CU 潔凈工作臺（蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司），LDZX-50KBS立式高壓蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠），DRP-9162 型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），智能低溫冷藏箱（寧波普朗特儀器有限公司），XSZ-H 生物顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌株的活化 將4℃保存的黑斑病菌置于28℃恒溫培養(yǎng)箱復(fù)溫24 h，然后在無菌環(huán)境中轉(zhuǎn)接到新的PDA 平板上，用封口膜封口，置于28℃培養(yǎng)基恒溫培養(yǎng)7 d［8］，備用。

1.2.2 孢子懸浮液的制備 參照張婕等［9］的方法在黑斑病菌培養(yǎng)7 d 后向PDA 平板中加入少量無菌水，并用無菌接種環(huán)輕刮后，采用4 層擦鏡紙過濾，并用血球計數(shù)板計數(shù)，無菌水稀釋，配制成1×106CFU/mL 的孢子懸浮液，備用。

1.2.3 接種 分別挑選顏色大小一致、無損傷、無病蟲害的心香和煙薯25 兩個品種的甘薯，用自來水洗凈，自然晾干。用75%的乙醇溶液擦拭［10］，放入無菌操作臺。將每個品種甘薯分為3組，分別做無損傷、表皮損傷、薯肉損傷處理，心香無損傷、表皮損傷、薯肉損傷處理分別為A0、A1、A2，煙薯25 無損傷、表皮損傷、薯肉損傷處理分別為B0、B1、B2。兩個品種的無損傷處理均在甘薯中間部位等距離處畫2 個直徑5mm 的圓。表皮損傷處理均在甘薯中間部位等距離處取2 個直徑5mm 的圓，并剝?nèi)テ浔砥?。薯肉損傷處理均用滅菌打孔器在甘薯中間部位等距離處取2 個直徑為5 mm，深度為5 mm 的圓柱孔［11］。用一次性注射器取25 μL 的黑斑病菌孢子懸浮液涂抹于圓內(nèi)或注入孔洞，晾干，置于溫度為28℃、相對濕度為90%的環(huán)境中貯藏。每隔3 d測定相關(guān)指標(biāo)。

1.3 考察指標(biāo)的測定

1.3.1 病斑表面直徑 在甘薯表面病斑處采用十字交叉法進(jìn)行測量［12］，每個處理重復(fù)6次。

1.3.2 病斑內(nèi)部直徑 將甘薯接種處橫向切開，測量病斑橫截面1/2 處的直徑，每個處理重復(fù)6次。

1.3.3 病斑深度 將甘薯接種處橫向切開，測量病斑深度，每個處理重復(fù)6次。

1.3.4 病斑面積 取橫截面的面積。計算方法：

病斑面積=病斑內(nèi)部直徑×病斑深度—孔洞面積

1.3.5 腐爛指數(shù) 采用腐爛指數(shù)法［13］，依甘薯腐爛的面積劃分為0～5 級：0 級（無腐爛）、1 級（腐爛的面積≤10%）、2 級（腐爛的面積介于10%～30%）、3 級（腐爛的面積介于30%～50%）、4 級（腐爛的面積介于50%～70%）、5 級（腐爛的面積≥70%）。計算方法：

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用origin 2018軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖，并用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行Tukey 法組間顯著性分析，P＜0.05 表示具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘薯浸染黑斑病后的癥狀

從圖1 可知，隨貯藏時間的延長，黑斑病病斑的傳播范圍也越廣，不同損傷程度的侵染嚴(yán)重程度依次為薯肉損傷＞表皮損傷＞無損傷。經(jīng)15 d 貯藏后，A0和B0處理均無黑斑產(chǎn)生，A1和B1處理的病變程度相近，A2病變程度明顯比B2處理深，這與辛國勝等［7］得出的煙薯25是抗黑斑品種的結(jié)論一致。

圖1 不同損傷程度的甘薯貯藏15 d后黑斑病浸染癥狀

2.2 甘薯感染黑斑病后病斑表面直徑的變化

由圖2可知，不同損傷程度的甘薯在接種黑斑病病原菌貯藏15 d 后，不同品種的無損傷甘薯均未產(chǎn)生病斑，受損傷的甘薯均產(chǎn)生不同程度的黑斑病病斑，且薯肉損傷甘薯的黑斑病病斑的表面直徑均大于表皮損傷的甘薯，且病斑的表面直徑隨貯藏時間的增加均呈上升趨勢。在貯藏期間，B2和B1處理的表面直徑均分別高于A2和A1處理，表明病原菌會刺激煙薯25表面病斑向周圍表皮蔓延的速度。貯藏到第15 天兩個品種薯肉損傷的表面直徑大小接近，均在15 mm 以上，而表皮損傷的煙薯25 達(dá)到了21.67 mm，較相同處理的心香增加了39.46%。

圖2 不同損傷程度甘薯感染黑斑病后病斑的表面直徑

2.3 甘薯感染黑斑病后病斑內(nèi)部直徑的變化

由圖3 可知，在病原菌脅迫下，受到損傷的甘薯病斑內(nèi)部直徑均隨著貯藏時間的延長呈現(xiàn)上升趨勢，均從5 mm 增加到13 mm 以上，且貯藏6～12 d，薯肉損傷的煙薯25 的病斑生長迅速，在第12 天時比相同處理的心香高23.29%。而貯藏12～15 天是薯肉損傷的心香病斑的加速生長期，在第15 天時其內(nèi)部直徑超越了煙薯25，達(dá)10.75 mm，較煙薯25增加20.93%，且顯著高于其他處理，而未損傷的甘薯未形成病斑。

圖3 不同損傷程度的甘薯黑斑病病斑的內(nèi)部直徑

2.4 甘薯浸染黑斑病后病斑深度的變化

由圖4 可知，在黑斑病病原菌脅迫下，受到損傷的心香和煙薯25黑斑病病斑深度均隨著貯藏時間的延長呈上升趨勢。薯肉損傷的甘薯病斑深度始終高于表皮損傷的甘薯，心香品種表現(xiàn)尤其明顯，而未損傷的甘薯則未被病原菌侵染。貯藏前6 d，病原菌的侵染速度較為緩慢，而在7～15 d 時甘薯的病斑深度急劇增大。貯藏到第15天薯肉損傷的心香病菌侵染程度最嚴(yán)重，病斑深度較薯肉損傷的煙薯25增加48%。

圖4 不同損傷程度甘薯黑斑病的病斑深度

2.5 甘薯浸染黑斑病后病斑面積的變化

由圖5 可知，在病原菌脅迫下，受到損傷的甘薯病斑面積隨著貯藏時間的延長呈上升趨勢，而未損傷的甘薯沒有被病原菌侵染。貯藏到第15 天，心香薯肉損傷處理的病斑面積急速增長，達(dá)215.75 mm2，分別比煙薯25薯肉損傷處理、心香表皮損傷處理、煙薯25表皮損傷處理顯著增加58.05%、86.17%、87.41%（P＜0.05）。薯肉損傷的甘薯病斑面積始終遠(yuǎn)高于表皮損傷的甘薯處理，表明甘薯損傷程度越嚴(yán)重，越容易被病原菌侵染產(chǎn)生黑色病斑且迅速生長。相對心香品種，煙薯25 表現(xiàn)出較好的抗性，這與煙薯25 本身具有的抗黑斑病性質(zhì)一致。

圖5 不同損傷程度甘薯黑斑病病斑面積

2.6 甘薯不同損傷程度對腐爛指數(shù)的影響

由表1 可知，隨著貯藏時間的延長，未損傷的甘薯不易被黑斑病病原菌侵染，而有傷口的甘薯均會被侵染，出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象。薯肉損傷的心香腐爛指數(shù)在貯藏期間顯著高于其他處理（P＜0.05），在貯藏第15 天時，心香薯肉損傷處理的腐爛指數(shù)高達(dá)86.67%，煙薯25 薯肉損傷處理的腐爛指數(shù)為60%，均大于50%，而表皮損傷的甘薯腐爛指數(shù)均小于30%?？梢?，薯肉部位損傷的甘薯更易感染黑斑病。貯藏到第15 天，心香薯肉損傷和表皮損傷處理的腐爛指數(shù)顯著高于煙薯25（P＜0.05）。

表1 不同損傷程度甘薯黑斑的腐爛指數(shù) %

3 結(jié)論

研究表明，心香和煙薯25 品種的表皮損傷和薯肉損傷均會受到黑斑病病原菌的侵染而產(chǎn)生病斑，且病斑表面直徑和內(nèi)部直徑均會隨著貯藏時間的延長而增長，病斑深度和病斑面積也會增加，腐爛指數(shù)不斷上漲；而無損傷的甘薯能抵抗病原菌的侵染，不會發(fā)生病變。因此，損傷是甘薯抵抗病原菌侵染的最主要因素，傷口是病原菌侵染的主要途徑，與采后蘋果青霉菌［14］的擴(kuò)展入侵方式一致。研究發(fā)現(xiàn)，病斑在前6 天傳播速度較為緩慢，7～15 d病斑呈快速增長趨勢。

隨著貯藏時間的延長，薯肉損傷的甘薯比表皮損傷甘薯的侵染傳播速度更快，病斑深度、面積、腐爛指數(shù)遠(yuǎn)高于表皮損傷，表明薯肉部位比表皮部位更易遭受病原菌的侵染，表皮對甘薯抵抗侵染有一定保護(hù)作用。貯藏到第15 天，兩種甘薯表皮損傷的病變程度相當(dāng)，而薯肉損傷的心香除表面直徑略小于煙薯25外，內(nèi)部直徑、深度、面積、腐爛指數(shù)均高于煙薯25。這是因?yàn)椴煌剐云贩N的甘薯對黑斑病病原菌具有不同的抗性，其侵染變化特性也不同，黑斑病抗性較弱的心香品種更易受到病原菌的侵染，病斑以縱深傳播為主，且傳播速度快，受到的侵染程度嚴(yán)重。黑斑病抗性品種煙薯25的黑斑病病斑以表面橫向傳播為主，與心香品種的縱深傳播不同，這可能與甘薯內(nèi)部的酶代謝等有關(guān)。