液相色譜-紫外檢測(cè)法測(cè)定肥料中多種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑

朱海榮，張 娟，劉 爽，于燕萍，于曉菲，孟 強(qiáng)

（山東省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，濟(jì)南 250100）

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（Plant growth regulates，PGRs）是一類可調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的外源性非營(yíng)養(yǎng)性化學(xué)合成物［1］。近年來(lái)應(yīng)用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑已成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)改善作物品質(zhì)、提高作物產(chǎn)量及作物抗逆抗病能力的重要措施［2-6］。隨著應(yīng)用情況不斷增多，在保障作物增產(chǎn)高效的同時(shí)，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑也對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全、生態(tài)環(huán)境和人體健康造成了一定程度的隱患。因肥料中隱性添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，導(dǎo)致作物減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，同時(shí)帶來(lái)了土壤及水源污染問(wèn)題［7，8］。因此，建立一套科學(xué)、合理的檢測(cè)技術(shù)體系，加強(qiáng)肥料中非法添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的監(jiān)控工作，具有重要意義。

如何建立快速高效的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑檢測(cè)技術(shù)一直以來(lái)都是農(nóng)業(yè)科學(xué)領(lǐng)域研究熱點(diǎn)之一，利用色譜法或色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等測(cè)定蔬菜、水果及糧谷等作物中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的殘留報(bào)道較多［9-16］，近年來(lái)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在肥料產(chǎn)品中的定量技術(shù)也逐漸出現(xiàn)，但利用液相色譜儀或氣相色譜儀，一種檢測(cè)方法同時(shí)檢測(cè) 1～4 種目標(biāo)物的報(bào)道居多［17-23］，且檢測(cè)方法靈敏度普遍不高。本研究針對(duì)肥料中可能添加的8 種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，優(yōu)化了色譜條件，考察了色譜提取溶劑、分離柱、流動(dòng)相等影響因素，選擇添加0.1%甲酸的甲醇作為提取溶劑，樣品經(jīng)過(guò)超聲提取并凈化，利用液相色譜儀測(cè)定后采用標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法定量。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證后證明，該技術(shù)穩(wěn)定、快捷、高效，滿足肥料產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)需求，可為肥料產(chǎn)品施用及行業(yè)技術(shù)規(guī)范制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260 型 Infinity 液相色譜儀（配 PDA），美國(guó)安捷倫公司；KQ-700DB 型超聲波清洗器，中國(guó)江蘇昆山超聲儀器有限公司；H-1650 型臺(tái)式高速離心機(jī)，上海凌儀生物科技有限公司；VORTEX-KB3型漩渦混合器，海門其林貝爾儀器制造有限公司；BSA224S 型電子分析天平，德國(guó)Sartorius 公司。

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞97.0%），德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司；甲酸（色譜純），美國(guó)霍尼韋爾公司；甲醇（色譜純），中國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；市售娃哈哈純凈水。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制

1）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液配制。分別精確稱取6-芐氨基嘌呤、吲哚乙酸、脫落酸、吲哚丁酸、萘乙酸、氯吡脲、烯效唑、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）標(biāo)準(zhǔn)品20.0 mg（精度0.1 mg），用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成2 000 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，貯存于-18 ℃條件下，有效期3 個(gè)月。

2）系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。以甲醇為溶劑，采用逐級(jí)稀釋的方式，配制質(zhì)量濃度分別為1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 mg/L 的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2 樣品前處理

1）樣品制備。固體樣品：粉碎后，過(guò)0.5 mm 試驗(yàn)篩待用；液體樣品：混勻后稱取。

2）提取、凈化。稱取 0.5～1.0 g（精度0.1 mg）肥料樣品，準(zhǔn)確加入10 mL 含0.1%甲酸的甲醇溶液于具塞離心管中，渦旋振蕩1 min，室溫超聲提取20 min，以6 000 r/min 高速離心5 min，取上清液1 mL，過(guò)0.22 μm 有機(jī)相微孔濾膜，供液相色譜儀測(cè)定。提取溶劑超聲時(shí)若產(chǎn)生溶劑揮發(fā)損失，應(yīng)進(jìn)行補(bǔ)液。

1.2.3 液相色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C1（8250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積10 μL；流速：0.8 mL/min；流動(dòng)相A 為甲酸水溶液（甲酸體積分?jǐn)?shù)為0.1%），B 為甲醇。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑

甲醇和乙腈對(duì)多種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑均有較好的溶解性，適用于極性范圍較寬的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑同時(shí)提取。吳愛(ài)娟等［18］選擇提取劑磷酸水溶液和乙腈，測(cè)定了水溶性肥料中的赤霉素、噻苯隆、氯吡脲和多效唑，張瀘文等［12］提取果蔬中26 種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑時(shí)發(fā)現(xiàn)，乙腈的提取物干擾少于甲醇。選擇氨基酸水溶性肥料進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，依據(jù)目標(biāo)化合物的溶解性能，結(jié)合已報(bào)道文獻(xiàn)［10-13］，試驗(yàn)考察了甲醇、0.1%甲酸-甲醇、乙腈、0.1%甲酸-乙腈對(duì)目標(biāo)物的提取效果（圖1）。結(jié)果顯示，6-芐氨基嘌呤在甲醇體系中的提取效果優(yōu)于乙腈；在甲醇中加入0.1%甲酸后，脫落酸、萘乙酸、2，4-D 的回收率明顯上升；0.1%甲酸-甲醇體系綜合提取效果最佳，各目標(biāo)化合物加標(biāo)回收率均在78%以上。甲酸的加入提高了脫落酸、萘乙酸、2，4-D 的提取效果，原因是酸性環(huán)境抑制了目標(biāo)物的電離，增強(qiáng)了其在甲醇中的溶解性能。因此，確定添加0.1%甲酸的甲醇作為提取溶劑。

圖1 提取溶劑對(duì)目標(biāo)物回收率的影響

2.2 色譜柱

色譜柱的篩選是方法開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，根據(jù)化合物的極性大小、分子大小及pKa值，查閱色譜柱選擇對(duì)照表后，試驗(yàn)選擇Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）和 Waters Symmetry Shield RP18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜分離柱，并進(jìn)行了梯度洗脫條件優(yōu)化（圖2），發(fā)現(xiàn)2 種色譜柱均可實(shí)現(xiàn)8種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的有效分離，但以Waters Symmetry Shield RP18色譜柱為分析柱時(shí)，吲哚乙酸與6-芐氨基嘌呤、氯吡脲與2，4-D 2 組目標(biāo)物保留時(shí)間相差較短，樣品中出現(xiàn)高濃度目標(biāo)物時(shí)，易產(chǎn)生分析干擾。因此，選擇ZORBAX SB-C18柱作為分析柱。

圖2 50.0 mg/L 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜

2.3 流動(dòng)相

液相色譜法分離多種目標(biāo)物，選擇流動(dòng)相時(shí)，需要兼顧各目標(biāo)化合物的響應(yīng)強(qiáng)度、峰形及分離性能。試驗(yàn)最初采用乙腈和水組成的二元梯度洗脫體系，難以實(shí)現(xiàn)8 種目標(biāo)物的有效分離，且目標(biāo)物總體出峰時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；優(yōu)化二元梯度洗脫體系，強(qiáng)洗脫溶劑選擇甲醇或乙腈，弱洗脫溶劑選擇水、0.1%甲酸水或5 mmol/L 乙酸銨，并對(duì)其不同搭配進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，甲醇作為強(qiáng)洗脫溶劑時(shí)，各目標(biāo)化合物響應(yīng)良好，且分離性能優(yōu)于乙腈；另外，甲酸的加入可促進(jìn)目標(biāo)化合物的分離，并能顯著改善2，4-D、萘乙酸、脫落酸等酸性化合物的峰形。因此，選擇甲醇和0.1%的甲酸溶液作為流動(dòng)相。在優(yōu)化的儀器工作條件下，各目標(biāo)物的分離度R大于1.5，27 min 內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)8 種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的分析，顯著提高了檢測(cè)效率。

2.4 檢測(cè)波長(zhǎng)

以三維（3D）檢測(cè)模式，對(duì)目標(biāo)物的單標(biāo)溶液在波長(zhǎng)200～500 nm 下進(jìn)行紫外光譜掃描，確定氯吡脲、烯效唑、脫落酸3 種目標(biāo)物最佳檢測(cè)波長(zhǎng)為258 nm，6-芐氨基嘌呤最佳檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm，萘乙酸、吲哚乙酸、吲哚丁酸、2，4-D 的最佳檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。兼顧檢測(cè)靈敏度和檢測(cè)效率，試驗(yàn)選擇波長(zhǎng)280 nm 對(duì)8 種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑進(jìn)行測(cè)定，此波長(zhǎng)下基線平穩(wěn)且各目標(biāo)物響應(yīng)良好。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限 在選定的最佳儀器條件下對(duì)8 種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。從表2 可以看出，在1.0～100.0 mg/L 范圍內(nèi)8 種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的質(zhì)量濃度與峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999 8。將標(biāo)準(zhǔn)系列溶液最低點(diǎn)經(jīng)過(guò)多級(jí)稀釋，利用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液與空白樣品的測(cè)量信號(hào)進(jìn)行比較，確定信噪比，以3倍的信噪比確定方法檢出限為0.5～10.0 mg/kg。

表2 線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限測(cè)試結(jié)果

2.5.2 精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取5 份同一批次肥料樣品，其中4 份分別添加4 個(gè)濃度水平的目標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（涵蓋高、中、低濃度），每個(gè)水平按照“1.2.3”的色譜條件進(jìn)行6 次重復(fù)測(cè)定，驗(yàn)證樣品的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。結(jié)果表明，肥料樣品中8 種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的平均回收率為78.2%～109.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在6.0%以下，證明該方法的準(zhǔn)確度和精密度良好，滿足同時(shí)檢測(cè)肥料中8 種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的測(cè)量要求?？瞻追柿蠘悠返募訕?biāo)色譜見(jiàn)圖3。

表3 加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）測(cè)試結(jié)果（n=6）

2.6 檢測(cè)方法的實(shí)際應(yīng)用

按試驗(yàn)方法對(duì)不同基質(zhì)的30 批次市售肥料樣品進(jìn)行分析。檢測(cè)結(jié)果（圖3）顯示，肥料樣品中基質(zhì)未對(duì)分析目標(biāo)物產(chǎn)生干擾，共5 批次樣品檢出植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，檢出率為16.7%；其中3 批次肥料檢出萘乙酸，含量為0.5%～0.9%，2 批次肥料檢出烯效唑，含量分別為1.1%和3.6%，證明肥料產(chǎn)品中存在隱性添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的現(xiàn)象，應(yīng)引起重視。

圖3 空白肥料樣品的加標(biāo)色譜

3 小結(jié)

本研究通過(guò)提取溶劑、分離色譜柱及檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇、梯度洗脫條件的優(yōu)化，建立了一種利用液相色譜同時(shí)測(cè)定肥料中6-芐氨基嘌呤、吲哚乙酸、脫落酸、吲哚丁酸、萘乙酸、氯吡脲、2，4-D、烯效唑8 種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的方法。該方法前處理簡(jiǎn)便快捷，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度高；利用液相色譜為分離手段，通用性強(qiáng)；在實(shí)驗(yàn)室大批量樣品檢測(cè)時(shí)，將快速提高檢測(cè)效率，可為肥料產(chǎn)品中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供技術(shù)支撐。