高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法 測定滄州金絲小棗中多酚類物質(zhì)

劉憲軍，王曉明，來創(chuàng)業(yè)，劉本發(fā)，王 猛

（滄州市食品藥品檢驗(yàn)所，河北滄州 061001）

植物多酚又被稱作植物單寧，是由復(fù)雜的酚類在植物體內(nèi)經(jīng)過次生代謝所產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，是存在于糧食類食品（大麥粒、高粱米、大豆等）、水果蔬菜類食品（茶葉、大蔥、橘子等）或中草藥植物（陳皮、石榴皮等）中的一種酚類物質(zhì)，在植物體內(nèi)的含量較高[1-3]。目前，食品中多酚類化合物的測定方法有多種，高錳酸鉀滴定法、酒石酸亞鐵分光光度法、化學(xué)發(fā)光法、原子吸收光譜法及高效液相色譜法[4-9]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

8030 Triple Quad液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司；ACQUITY BEH C18液相色譜柱（2.1 mm× 50 mm，1.7 μm），美國沃特世公司；高效液相色譜儀Waterse2695（二極管陣列檢測器），美國沃特世公司；電子分析天平，瑞士梅特勒公司；真空干燥箱，北京科偉永興儀器有限公司；恒溫水浴振蕩器，常州國華儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國IKA公司；超純制水機(jī)，美國默克密理博公司；酸度計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；冷凍離心機(jī)，湖南湘智離心機(jī)儀器有限公司；甲醇、乙醇（色譜純），美國賽默飛世爾科技有限公司；鄰苯二酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度均大于98%），美國默克公司；間苯三酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度均大于98%），美國默克公司；其他試驗(yàn)檢測用試劑均為分析純，天津科密歐有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

將滄州金絲小棗用水清洗后，去核、切片，在真空干燥箱中真空干燥（70 ℃，95 kPa），粉碎機(jī)粉碎，過60目篩。

準(zhǔn)確稱取經(jīng)粉碎后的棗粉約2.0 g（精確至1 mg）樣品放于250 mL的帶塞錐形瓶中，用量筒加入40%乙醇溶液40 mL，在恒溫水浴振蕩器中60 ℃恒溫水浴振搖60 min，反復(fù)振蕩浸提兩次，合并兩次的提取液，在60 ℃溫度下水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至少于5 mL，再用10 mL水溶解殘?jiān)?。冷卻至室溫，倒入離心管中，然后放入離心機(jī)內(nèi)，在離心溫度為4 ℃的條件下，10 000 r/min離心5 min，然后用針管取上清液，將上清液過0.2 μm水系微孔濾膜，得試樣液，待凈化。

1.2.2 聚酰胺粉凈化

將1.2.1得到的試樣液在聚酰胺柱上樣，控制流速不超過2 mL/min，用75%乙醇溶液淋洗，收集洗脫液。洗脫液60 ℃水浴下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至10 mL。冷卻至室溫，然后于離心機(jī)上4 ℃下10 000 r/min離心 5 min，并將上清液過0.2 μm水系微孔濾膜，進(jìn)行液相色譜和液相色譜-質(zhì)譜法分析。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：ACQUITY BEH C18（2.1 mm×50 mm， 1.7 μm）；樣品的進(jìn)樣量：5 μL；柱溫箱溫度設(shè)定： 30 ℃；二極管陣列檢測器設(shè)置：檢測波長278 nm；流動(dòng)相的設(shè)定：甲醇+含0.1%甲酸的10 mmol乙酸銨水溶液（10∶90，V/V）；柱流速設(shè)定：0.3 mL/min。

1.2.4 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；電離模式：負(fù)離子模式；干燥氣流速：N2，12 L/min；錐孔電壓：40 V；碰撞能量：30eV。

1.2.5 標(biāo)液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：稱取100 mg標(biāo)準(zhǔn)品，用20% 乙醇溶液定容至100 mL。標(biāo)準(zhǔn)使用液：用20%乙醇溶液稀釋至1.0 mg/L、2.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、50.0 mg/L、100.0 mg/L及200.0 mg/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 滄州金絲小棗中多酚類物質(zhì)聚酰胺層析條件的優(yōu)化

對不同濃度甲醇淋洗液（35%、55%、70%、90%）洗脫得到的多酚提取液進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果分別為0.21 mg/g、1.25 mg/g、14.6 mg/g和0.79 mg/g，多酚的得率在70%甲醇淋洗條件下最高，均可達(dá)到80%以上。因此，70%甲醇為聚酰胺柱層析的最佳淋洗條件。

2.2 高效液相色譜條件的選擇及優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

本試驗(yàn)采用在樣品中加標(biāo)的方式來選擇不同規(guī)格的液相色譜柱（苯基液相色譜柱、BEH C18液相色譜柱、C8液相色譜柱），分別做3次平行試驗(yàn)。結(jié)果表明，苯基液相色譜柱對2種化合物不能完全分離，C8液相色譜柱峰型不好，BEH C18液相色譜柱柱則可達(dá)到基線全部分離，分離度明顯優(yōu)于其他兩種色譜柱（見圖1、圖2、圖3），本研究最終選擇BEH C18柱為分 析柱。

圖1 苯基液相色譜柱分離效果色譜圖

圖2 C8液相色譜柱分離效果色譜圖

圖3 BEH C18液相色譜柱分離效果色譜圖

2.2.2 流動(dòng)相的選擇

經(jīng)比較，考察了流動(dòng)相中甲醇濃度（5%、10%）對提取物中多酚類物質(zhì)的保留值和分離度的影響。由圖4、圖5可知，流動(dòng)相在10%的甲醇濃度的條件下，使保留時(shí)間較短，峰形更尖銳對稱，分離 較好。

圖4 流動(dòng)相為10%甲醇濃度條件的色譜圖

圖5 流動(dòng)相為5%甲醇濃度條件的色譜圖

2.2.3 進(jìn)樣量的選擇

本試驗(yàn)分別對儀器（1 μL、2 μL、3 μL、4 μL及5 μL）不同的進(jìn)樣體積進(jìn)行了考察。試驗(yàn)的結(jié)果顯示隨著儀器的進(jìn)樣體積的增加，檢出限會(huì)降低，響應(yīng)值也會(huì)相應(yīng)的增加，但是過大的進(jìn)樣體積也會(huì)對色譜柱有影響，有可能會(huì)超過色譜柱的柱容量，特別是會(huì)加快色譜柱的老化報(bào)廢，綜合以上原因選擇 2 μL的進(jìn)樣體積，滿足檢出限要求的同時(shí)也能有效地保護(hù)色譜柱。

2.2.4 柱溫的比較優(yōu)化

在相同的試驗(yàn)條件下，對不同的柱溫（20 ℃、 30 ℃、40 ℃及50 ℃）進(jìn)行考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同柱溫箱溫度（20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃）各種條件下能滿足峰分離，本著節(jié)能環(huán)保的理念，選擇較常溫相近的溫度30 ℃作為柱溫箱溫度。

2.2.5 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

配制濃度為1.0 μg/mL的鄰二苯酚、間苯三酚的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行母離子掃描，確定電離方式和分子離子峰，在分別獲得分子離子峰后，自動(dòng)優(yōu)化錐孔電壓。經(jīng)試驗(yàn)在負(fù)離子模式下鄰苯二酚母離子為m/z109，[C6H6O2-H]-豐度最高，間苯三酚掃描的母離子為m/z125，[C6H6O3-H-H2O]-豐度最高，具體內(nèi)容如表1所示。

表1 鄰苯二酚和間苯三酚優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)

2.2.6 回歸方程及檢出限

用標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制鄰苯二酚、間苯三酚濃度 分別為1.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、20.0 mg/L、 50.0 mg/L、100.0 mg/L及200.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在已確定的色譜條件下進(jìn)行測定，峰面積（Y）對濃度（X）進(jìn)行線性回歸，由表2可知，在1.0～200.0 mg/L的濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r也均大于0.998，以3倍信噪比（S/N）計(jì)算方法的檢出限為 2.0 mg/kg。

表2 方法學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.7 方法的回收率和精密度

通過向樣品加標(biāo)的方式做回收率和精密度試驗(yàn)，分別向樣品中添加濃度50.0 mg/kg和200.0 mg/kg兩個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液后，按上述的方法進(jìn)行前處理和上機(jī)測定，進(jìn)行7次平行試驗(yàn)。在表3中可見，加標(biāo)回收率在83.4%～99.1%，RSD在2.87%～4.27%，說明選定的方法滿足檢測要求。

表3 樣品添加回收率和精密度試驗(yàn)

3 結(jié)論

采用聚酰胺層析柱凈化，經(jīng)C18柱分離后，在278 nm下對鄰苯二酚及間苯三酚進(jìn)行測定，同時(shí)串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行確證。方法線性相關(guān)系數(shù)r＞0.998， 檢出限為2.0 mg/kg，在50.0 mg/kg、200.0 mg/kg濃度 添加水平下，回收率在83.4%～99.1%，RSD在2.87%～ 4.27%。該方法靈敏度高、重現(xiàn)性好、定性定量準(zhǔn)確，適用滄州金絲小棗中鄰苯二酚及間苯二酚的液相色譜法定量，質(zhì)譜法輔助定性。