青花菜SKIP基因的克隆與表達(dá)分析

韋海忠，潘麗芹，湯紫依，田盛野，何海葉，尹龍飛，鄭德偉，張慧娟，蔣 明，*

(1.臺州科技職業(yè)學(xué)院，浙江 臺州 318020； 2.臺州學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 臺州 318000)

青花菜(var.)又名西蘭花、綠花菜和木立花椰菜等，為十字花科(Cruciferae)蕓薹屬一、二年生蔬菜作物，它是甘藍(lán)的一個變種，以花莖和花蕾群為主要食用部位，可用于生吃或熟食，味道鮮美、營養(yǎng)豐富，加之具有一定的抗癌作用，深受消費者的歡迎。青花菜于19世紀(jì)80年代引入浙江、云南、福建等省，雖然在我國的栽培歷史較短，但栽培面積增加迅速，目前已成為世界青花菜的主產(chǎn)國之一，預(yù)計2025—2035年我國的青花菜栽植面積將達(dá)到16.7～20.0萬hm。隨著栽培范圍的不斷擴(kuò)大，青花菜病害發(fā)生也有逐漸加重的趨勢，霜霉病和黑腐病是十字花科蔬菜栽培過程中的常見病害，它們分別由寄生霜霉菌()和野油菜黃單胞菌(pv.)引起。寄生霜霉菌與野油菜黃單胞菌分別為活體寄生菌(biotroph)和半活體寄生菌(hemibiotroph)，它們的寄主范圍廣，危害作物種類多，對十字花科蔬菜生產(chǎn)的影響尤為嚴(yán)重。通過多年的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，霜霉病和黑腐病在青花菜的整個生育期均可發(fā)生，侵染子葉、葉片和花蕾等，影響植株的生長發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)。

除生物脅迫外，非生物脅迫對蔬菜生產(chǎn)的影響也十分巨大，干旱和鹽害是兩種較為常見的非生物逆境，它們也是青花菜的重要產(chǎn)量限制因子；青花菜雖然有一定的耐鹽性，但土壤鹽度過高，也會造成植株生長不良，并最終影響花球產(chǎn)量和品質(zhì)。我國不是青花菜的原產(chǎn)地，種質(zhì)資源稀缺，抗逆種質(zhì)更為匱乏，通過挖掘功能基因進(jìn)行分子育種是培育抗逆新材料的重要途徑。SKIP(SKI-interacting protein)是一種十分保守的蛋白質(zhì)，存在于酵母、真菌、動物和植物等真核生物中，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控和RNA剪接。在酵母中，SKIP參與細(xì)胞生長和分裂，在動物中則與器官發(fā)生、神經(jīng)發(fā)育和胚胎生長相關(guān)。SKIP在植物中的功能較多，涉及生長、發(fā)育和逆境防御等過程。擬南芥()SKIP參與脫落酸(abscisic acid，ABA)信號途徑，與植物鹽脅迫和滲透壓脅迫的耐受性相關(guān)；它與剪接因子(splicing factor)互作，參與生物鐘的調(diào)控；SKIP還與成花轉(zhuǎn)變(floral transition)和開花時間的調(diào)控有關(guān)。最近，有研究表明，SKIP參與番茄()的抗病反應(yīng)。植物SKIP的文獻(xiàn)不多，而在青花菜中的研究未見報道。本研究以青花菜為材料，在克隆基因的基礎(chǔ)上，明確其在生物脅迫和非生物脅迫下的表達(dá)模式，為研究該基因在逆境響應(yīng)中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

青花菜株系Bo0202栽植于人工氣候箱，四葉一心期用噴霧法接種病原菌。寄生霜霉菌的孢子濃度為1×10mL，野油菜黃單胞菌的孢子濃度為1×10mL，對照噴灑等量的無菌水。收集噴霧0、24、48、72、96 h的葉片，用于RNA和DNA的提取。四葉一心期的植株用于鹽脅迫和干旱脅迫，鹽脅迫采用150 mmol·L的NaCl，PEG6000用于干旱模擬，工作濃度為20%。采集脅迫處理0、12、24、48、72 h的葉片，用于RNA的提取。

從NCBI下載BoiSKIP的同源蛋白質(zhì)序列，它們分別來自甘藍(lán)型油菜(，登錄號：XP_013688403)、蘿卜(，登錄號：XP_018456548)、(登錄號：CAA7013451)、(登錄號：KAF2606023)、擬南芥(， 登錄號：OAP19162)、蕪菁(，登錄號：RID56290)、薺菜(，登錄號：XP_006301006)、山崳菜(，登錄號：XP_006390116)、亞麻薺(，登錄號：XP_010471904)、甘藍(lán)(var.，登錄號：XP_013591577)、琴葉擬南芥(subsp.，登錄號：XP_020890221)和黃瓜(，登錄號：XP_031736674)等，其中的黃瓜SKIP作為系統(tǒng)發(fā)育樹的外類群。

1.2 DNA、RNA提取和cDNA的合成

基因組DNA的提取采用試劑盒法，新型植物基因組DNA快速提取試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司(鼎國公司)，實驗按照其提供的說明書進(jìn)行；RNA的提取采用TRIzol法，試劑購自Invitrogen，操作根據(jù)說明書進(jìn)行；cDNA合成試劑盒購自TaKaRa公司，按說明書進(jìn)行實驗操作。DNA和RNA經(jīng)電泳檢測與濃度測定，置于-80 ℃冰箱備用。

1.3 BoiSKIP基因的克隆

用于克隆基因的上游、下游引物分別為SKIP1：5′-ATGGCGTCTCTTAAGGACCGTCTA-3′和SKIP2：5′-TTAACGATCACCACGTTCGAAATTG-3′。PCR反應(yīng)在伯樂S1000上進(jìn)行，分別加入2 μL 10×PCR緩沖液、0.5 U的DNA聚合酶(北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司)、0.6 μL 10 mmol·L的dNTPs[生工生物工程(上海)股份有限公司]、上游和下游引物各0.3 μL(20 μmol·L)、25 ng模板DNA或cDNA，加ddHO至20 μL。PCR反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，56.3 ℃退火45 s，72 ℃延伸120 s，共32個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，利用DNA凝膠回收試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)回收膠塊上的目的基因。連接采用pGEM-T easy載體(Promega)，在4 ℃反應(yīng)過夜，42 ℃熱激90 s將連接產(chǎn)物導(dǎo)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)涂布、挑取單菌落和菌液PCR檢測，各挑3份陽性菌液用于測序。

1.4 生物信息學(xué)分析

采用ProtParam在線工具(http://web.expasy.org/protparam)預(yù)測蛋白質(zhì)的分子量、等電點、原子組成、不穩(wěn)定系數(shù)和平均親水性系數(shù)等；利用ProtScale(http://web.expasy.org/protscale)繪制親疏水性圖譜；借助SMART在線工具(http://smart.embl-heidelberg.de)預(yù)測BoiSKIP的結(jié)構(gòu)域；Mega 3.1用于生成系統(tǒng)發(fā)育樹，建樹方法為鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)，bootstrap值設(shè)為1 000。

1.5 基因表達(dá)分析

根據(jù)測序結(jié)果，設(shè)計1對引物用于表達(dá)分析，引物名稱和序列分別為SKIP3：5′-GGCGGCGAAGTTATGTACGAT-3′和SKIP4：5′-GTGCTGTGAACAAGCCTTTGTC-3′。內(nèi)標(biāo)為肌動蛋白基因，上游和下游引物的名稱與序列分別為ACTUP：5′-TCTCGATGGAAGAGCTGGTT-3′和ACTDN：5′-GATCCTTACCGAGGGAGGTT-3′。PCR反應(yīng)在LightCycler96實時定量PCR儀上進(jìn)行，依次加入10 μL 2×Master Mix、上游/下游引物各0.2 μL(20 μmol·L)、25 ng cDNA，最后加ddHO至20 μL；反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。實驗重復(fù)3次，用2法計算基因的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 BoiSKIP基因的特征

利用PCR方法克隆了基因的DNA和cDNA序列，測序結(jié)果表明，該基因的全長為1 836 bp，沒有內(nèi)含子；編碼611個氨基酸；Smart在線工具預(yù)測結(jié)果表明，BoiSKIP具1個SNW/SKI結(jié)構(gòu)域，位于氨基酸序列的188-347處(圖1)；BoiSKIP的分子量為69.22 ku，理論等電點為9.15，平均親水性指數(shù)為-1.12，由于該值為負(fù)數(shù)，因此BoiSKIP為親水性蛋白(圖2)；蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)為45.89，大于40，所以BoiSKIP是一種不穩(wěn)定蛋白；BoiSKIP的原子總數(shù)為9 661，分子式為CHNOS。

高亮部分為SNW/SKI結(jié)構(gòu)域。

圖2 BoiSKIP的親水性/疏水性預(yù)測

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

從NCBI下載了12條SKIP同源蛋白序列，其中11條來自十字花科植物，另一條來自黃瓜。利用Mega軟件對蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多重比對，結(jié)果表明，SKIP序列之間的相似性較高，僅個別氨基酸殘基存在差異。13條SKIP序列之間的平均遺傳距離為0.100，擬南芥與黃瓜SKIP之間的遺傳距離最大，為0.255；青花菜BoiSKIP與甘藍(lán)SKIP之間的遺傳距離最小，僅為0.002。SNW/SKI序列的保守性更高，青花菜、甘藍(lán)型油菜和甘藍(lán)的SNW/SKI序列完全相同，與薺菜SNK/SKI結(jié)構(gòu)域僅有2個氨基酸殘基不同(圖3)。

XP_013688403，甘藍(lán)型油菜；XP_018456548，蘿卜；CAA7013451，Microthlaspi erraticum;KAF2606023，Brassica cretica；OAP19162，擬南芥；RID56290，蕪菁；XP_006301006，薺菜；XP_006390116，山崳菜；XP_010471904，亞麻薺；XP_013591577，甘藍(lán)；XP_020890221，琴葉擬南芥；XP_031736674，黃瓜。

系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，5種蕓薹屬植物的SKIP聚為一組，支持率達(dá)100%，其中BoSKIP與甘藍(lán)SKIP處于同一分支，而蕪菁和甘藍(lán)型油菜處于另一條分支。兩種擬南芥屬植物聚于組V，支持率達(dá)98%，而蘿卜、薺菜、亞麻薺、山崳菜和黃瓜等各自單獨成組(圖4)。

圖4 青花菜BoiSKIP及其同源序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 BoiSKIP基因在脅迫下的表達(dá)

利用實時熒光定量PCR研究基因在非生物脅迫下的表達(dá)，結(jié)果表明，NaCl和PEG6000均可誘導(dǎo)該基因的表達(dá)，隨著脅迫時間的延長，表達(dá)量的變化均先上升后下降(圖5)。在NaCl處理24 h的表達(dá)量最高，為對照的5.92倍，12 h和48 h的表達(dá)量顯著高于0 h，而72 h的表達(dá)量與0 h沒有顯著差異。經(jīng)PEG6000處理，基因在12 h達(dá)到最大值，為對照的4.2倍，24 h的表達(dá)量為對照的2.3倍，而48 h和72 h的表達(dá)量與0 h沒有顯著差異。

圖5 BoiSKIP基因在非生物脅迫下的表達(dá)

寄生霜霉菌和野油菜黃單胞菌均可誘導(dǎo)的表達(dá)，但表達(dá)模式存在差異。在2種病原菌的誘導(dǎo)下，基因的表達(dá)量均呈先上升后下降的規(guī)律。在寄生霜霉菌誘導(dǎo)下，24～96 h的表達(dá)量均顯著高于0 h，其中，24 h的表達(dá)量最高，為0 h的2.01倍，48 h的表達(dá)量次之，為0 h的1.29倍；用野油菜黃單胞菌處理，24～72 h的表達(dá)量顯著高于0 h，72 h的表達(dá)量最高，為0 h的2.43倍，而96 h的表達(dá)量與0 h沒有顯著差異(圖6)。

A，寄生霜霉菌處理；B，野油菜黃單胞菌處理。

3 討論

SKIP最早在黑腹果蠅()中發(fā)現(xiàn)，該蛋白被命名為BX42，它是泡狀(Puff)染色體特異蛋白，其編碼區(qū)全長為1 641 bp，編碼547個氨基酸，該基因在染色質(zhì)調(diào)控中起著重要作用。人()SKIP與BX42同源，由536個氨基酸組成，序列與BX42的相似性超過60%，后被證實SKIP為癌蛋白Ski的結(jié)合蛋白。擬南芥只有一個SKIP成員，該基因沒有內(nèi)含子，編碼區(qū)全長為1 842 bp，編碼613個氨基酸，分子量為67.5 ku。水稻()有2個SKIP成員，分別命名為和，它們與人SKIP的相似性分別為49%和46%，其中，編碼607個氨基酸，它的190-356位為SNW/SKI結(jié)構(gòu)域。玉米()SKIP基因的編碼區(qū)全長為1 830 bp，沒有檢測到內(nèi)含子，該基因編碼609個氨基酸，SNW/SKI結(jié)構(gòu)域位于188-347殘基處。本研究中，青花菜的編碼區(qū)全長為1 836 bp，序列長于玉米和水稻的，但短于擬南芥的；目前已知的基因均無內(nèi)含子，本研究克隆的中也沒有內(nèi)含子。SKIP是一個保守蛋白，BoiSKIP與十字花科SKIP同源蛋白質(zhì)的相似性較高，僅個別氨基酸殘基存在差異，而結(jié)構(gòu)域SNW/SKI序列的保守性更高，暗示這些蛋白質(zhì)可能具有類似的功能。

植物SKIP參與逆境脅迫的響應(yīng)，在抵御不良環(huán)境方面有著重要作用。擬南芥經(jīng)NaCl、脫落酸和甘露醇處理后，的表達(dá)量顯著提高，其過量表達(dá)提高了植物對這些逆境的抗性。水稻的抑制表達(dá)導(dǎo)致植株生長停滯和細(xì)胞活力下降，而過量表達(dá)則可顯著提高其對ABA、鹽、甘露醇和干旱的抗性。玉米的表達(dá)受干旱、ABA和NaCl的誘導(dǎo)，最大表達(dá)量分別為對照的7.0、3.6和8.6倍，該基因的過量表達(dá)可顯著增加煙草()對干旱、ABA和NaCl的耐受能力。本研究中，的表達(dá)受NaCl和PEG6000的誘導(dǎo)，推測該基因與青花菜耐鹽和抗旱相關(guān)?；蛟谏锩{迫中的功能也有研究，番茄1的表達(dá)受丁香假單胞菌番茄致病變種(pv.)DC3000和灰霉菌()的誘導(dǎo)，最高表達(dá)量分別為對照的6.3倍與7.1倍，而1的表達(dá)并不受這兩種病原菌的誘導(dǎo)，利用病毒誘導(dǎo)基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)抑制1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)番茄對DC3000和灰霉菌的抗性減弱。青花菜的表達(dá)受寄生霜霉菌和野油菜黃單胞菌的誘導(dǎo)，表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢，推測該基因可能與霜霉病和黑腐病抗性有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究以青花菜為材料，在克隆基因的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了序列分析、系統(tǒng)發(fā)育分析和表達(dá)分析?；虻娜L為1 836 bp，編碼611個氨基酸，具1個SNW/SKI結(jié)構(gòu)域；BoiSKIP的分子量與理論等電點分別為69.22 ku和9.15。蕓薹屬植物的SKIP在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚為一組，支持率達(dá)100%。的表達(dá)受NaCl和PEG6000的誘導(dǎo)，也受生物因素寄生霜霉菌和野油菜黃單胞菌的誘導(dǎo)。