MitoQ對(duì)犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞線粒體功能及抗氧化能力的影響

鐘麗君，鄧嘉強(qiáng)，古叢偉，沈留紅，曹隨忠，余樹民

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells， BMSCs)是一類具有自我更新和分化潛能的多能干細(xì)胞，已成為再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一種極具潛力的治療材料。然而，由于體內(nèi)外生存環(huán)境差異，在體外長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)過程中細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species， ROS)大量蓄積，導(dǎo)致BMSCs線粒體功能障礙與氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡，最終引起B(yǎng)MSCs生物學(xué)功能受損甚至丟失，嚴(yán)重限制了BMSCs治療效率。

近年來(lái)，抗氧化劑預(yù)處理是維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)和改善BMSCs生物學(xué)功能的有效策略。但是大多數(shù)抗氧化劑無(wú)法穿透線粒體的雙層膜結(jié)構(gòu)到達(dá)線粒體內(nèi)部發(fā)揮作用。線粒體靶向抗氧化劑Mitoquinone(MitoQ)是一種泛醌衍生物，由輔酶Q10(CoQ10)和三苯基磷(TPP)組成。研究發(fā)現(xiàn)，MitoQ不僅可以輕松穿透線粒體膜并大量積累在線粒體中，還可以在線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅱ的作用下，連續(xù)還原為具有抗氧化作用的泛醇形式，被廣泛用于膿毒癥和睪丸氧化損傷等氧化應(yīng)激模型。然而，應(yīng)用MitoQ來(lái)改善BMSCs生物學(xué)功能的研究仍未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在體外培養(yǎng)時(shí)添加MitoQ預(yù)處理，評(píng)價(jià)犬BMSCs的線粒體功能以及抗氧化基因的表達(dá)水平，為進(jìn)一步提高犬BMSCs的臨床應(yīng)用效率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

6～12月齡健康中華田園犬，購(gòu)于四川省雅安市。

胎牛血清FBS(TransGen Biotech，北京)；LG-DMEM干粉培養(yǎng)基(GIBICO，美國(guó))；胰蛋白酶干粉(Sigma，美國(guó))；油紅O染色試劑盒、茜素紅染色試劑盒、EDTA、肝素鈉(Solarbio，北京)；成脂分化誘導(dǎo)液、成骨分化誘導(dǎo)液(Cyagen，美國(guó))；4%多聚甲醛、谷氨酰胺、Trizol試劑(生工生物，上海)；總RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒與SYBRPremix ExTM Ⅱ(Takara，大連)；MitoQ(MCE，上海)；CD31、CD90、CD105抗體(博奧森，北京)；ATP含量測(cè)定試劑盒(南京建成，南京)；青鏈霉素混合液100×、線粒體膜電位試劑盒(碧云天，上海)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 BMSCs分離與培養(yǎng)

對(duì)犬進(jìn)行股骨穿刺，抽取適量骨髓與肝素鈉混合。再加入PBS混勻，2 000 r·min8 min離心兩次。棄上清，加入完全培養(yǎng)液。計(jì)數(shù)后按10mL密度接種于培養(yǎng)皿中，于37 ℃，5% CO的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底后，消化離心，加入完全培養(yǎng)液，按1.5×10mL的密度傳代。

1.2.2 BMSCs鑒定

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的P3代BMSCs以3×10mL的密度接種于24孔板中培養(yǎng)，用于分化鑒定與表面標(biāo)志鑒定。采用免疫熒光鑒定BMSCs表面標(biāo)志，BMSCs經(jīng)PBS清洗后，加入4%的多聚甲醛固定30 min，再加PBS清洗3次。于室溫加入羊血清，封閉30 min后吸出血清，分別加入CD105(1∶50)、CD90(1∶50)、CD31(1∶100)，4 ℃孵育過夜，PBS洗滌，加入二抗-FITC(1∶500)于37 ℃避光孵育1 h，觀察顯色情況。為了誘導(dǎo)分化，用成骨分化誘導(dǎo)液和成脂分化誘導(dǎo)液培養(yǎng)BMSCs，每3 d更換一次誘導(dǎo)液，培養(yǎng)21 d和14 d后，分別用茜素紅和油紅O對(duì)BMSCs進(jìn)行染色。

1.2.3 MitoQ處理

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第三代(P3)BMSCs進(jìn)行接種培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后更換新鮮的培養(yǎng)液；將同批次生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第六代(P6)BMSCs進(jìn)行接種培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后更換含有MitoQ終濃度為0.1、0.5和1 μmol·L的完全培養(yǎng)液。均以同批次的未作處理的第六代(P6)BMSCs作為對(duì)照，每組3個(gè)重復(fù)，在37 ℃，5%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4 BMSCs抗氧化基因與線粒體功能相關(guān)基因mRNA水平的檢測(cè)

BMSCs以2×10mL的密度接種于12孔板中培養(yǎng)。按1.2.3節(jié)處理BMSCs后，加入Trizol試劑，提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，由上海生工公司合成引物(引物序列及參數(shù)見表1)，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)反應(yīng)。用CFX96 RT-PCR Detection System檢測(cè)C值，采用2-ΔΔC法計(jì)算在各組細(xì)胞中目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物參數(shù)

1.2.5 BMSCs線粒體膜電位的檢測(cè)

BMSCs以2×10mL的密度接種于6孔板中培養(yǎng)。按1.2.3節(jié)處理BMSCs后，離心收集細(xì)胞，加入0.5 mL細(xì)胞培養(yǎng)液與JC-1染色工作液混勻孵育20 min后，用JC-1染色緩沖液(1×)洗滌2次。離心收集沉淀，重懸于JC-1染色緩沖液(1×)中，在熒光顯微鏡下觀察，并用熒光酶標(biāo)儀在激發(fā)波長(zhǎng)490 nm，最佳發(fā)射波長(zhǎng)530 nm以及激發(fā)波長(zhǎng)525 nm，發(fā)射波長(zhǎng)590 nm分別檢測(cè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，用紅綠熒光的相對(duì)比例計(jì)算線粒體膜電位水平。

1.2.6 BMSCsATP含量的檢測(cè)

BMSCs以1×10mL的密度接種于6孔板中培養(yǎng)。按1.2.3節(jié)處理BMSCs后，根據(jù)ATP含量測(cè)試盒說(shuō)明書提取樣品，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)ATP含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)與檢驗(yàn)分析組間差異，<0.05表示有顯著差異。采用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 BMSCs的形態(tài)及培養(yǎng)特征

P1代、P3代BMSCs呈現(xiàn)細(xì)長(zhǎng)梭形，輪廓清晰，折光性強(qiáng)，增殖速度較快。而P6代BMSCs呈現(xiàn)增大和扁平化的衰老形態(tài)，折光性下降，顆粒物質(zhì)增多，增殖速度減慢(圖1)。

A-C 分別為P1、P3和P6代BMSCs的形態(tài)(比例尺=100 μm)。

2.2 BMSCs的鑒定

免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，BMSCs陽(yáng)性表面標(biāo)志物CD105和CD90高表達(dá)，陰性表面標(biāo)志物CD31弱表達(dá)(圖2-A-D)；細(xì)胞成骨和成脂分化誘導(dǎo)后，分別出現(xiàn)紅色的鈣化結(jié)節(jié)與橘紅色的脂肪顆粒(圖2-E、F)，表明該細(xì)胞可分化為成骨細(xì)胞與脂肪細(xì)胞。以上結(jié)果證實(shí)了我們從骨髓中分離和培養(yǎng)的細(xì)胞是BMSCs。

A-F 分別為細(xì)胞表面標(biāo)志物CD105、CD90、CD31、陰性對(duì)照的免疫熒光檢測(cè)結(jié)果(比例尺=200 μm)；BMSCs成骨分化誘導(dǎo)和成脂分化誘導(dǎo)后的染色結(jié)果(比例尺=100 μm)。

2.3 體外傳代對(duì)BMSCs抗氧化基因表達(dá)與線粒體功能的影響

qRT-PCR數(shù)據(jù)顯示，與P3代相比，P6代BMSCs抗氧化基因2與-相對(duì)表達(dá)量極顯著下調(diào)(<0.01)，1與顯著下調(diào)(<0.05)(圖3-A)；線粒體融合基因2顯著上調(diào)(<0.05)，1和1基因沒有顯著性差異(>0.05)(圖3-C)；線粒體分裂基因1極顯著下調(diào)(<0.01)，1顯著下調(diào)(<0.05)(圖3-D)；線粒體生物合成相關(guān)基因-1極顯著下調(diào)(P<0.01)(圖3-B)；線粒體膜電位水平以及ATP含量均極顯著下降(<0.01)(圖3-E、F)。結(jié)果表明，隨著體外傳代次數(shù)增加，BMSCs抗氧化能力減弱，線粒體融合略有增強(qiáng)，線粒體分裂明顯減弱，且線粒體合成功能受損。

A-F分別為BMSCs的SOD1、SOD2、CAT、GSH-Px；PGC-1α；Opa1、Mfn1、Mfn2、Fis1和Drp1基因的相對(duì)表達(dá)量；線粒體膜電位水平(比例尺=100 μm)和ATP含量。*和**分別表示在P<0.05和P<0.01水平上差異顯著。ns,不顯著。下同。

2.4 MitoQ對(duì)BMSCs抗氧化基因與線粒體功能相關(guān)基因表達(dá)的影響

與P6代對(duì)照組相比，MitoQ處理組(1μmol·L)1、、2和-基因，以及MitoQ處理組(0.5 μmol·L)1、2和-基因的相對(duì)表達(dá)量均極顯著上調(diào)(<0.01)，且MitoQ處理組(0.5 μmol·L)的基因相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)(<0.05)(圖4-A)。此外，所有MitoQ處理組2相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)(<0.05)，而1只在MitoQ處理組(0.5 μmol·L)中顯著上調(diào)(<0.05)；MitoQ處理組(0.5 μmol·L和1 μmol·L)1的相對(duì)表達(dá)量均極顯著上調(diào)(<0. 01)；且MitoQ處理組(0.5 μmol·L)的-1基因相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)(<0.05)(圖4-B)。以上結(jié)果表明，MitoQ(0.5 μmol·L和1 μmol·L)添加后，BMSCs線粒體融合略有增強(qiáng)，線粒體分裂、線粒體生物合成以及抗氧化能力均顯著增強(qiáng)。

圖4 MitoQ對(duì)BMSCs抗氧化基因與線粒體功能相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.5 MitoQ對(duì)BMSCs線粒體膜電位與ATP含量的影響

與P6代對(duì)照組相比，所有MitoQ處理組線粒體膜電位水平均極顯著增高(<0.01)，(圖5-A)；MitoQ處理組(0.5 μmol·L和1 μmol·L)ATP含量均極顯著增高(<0. 01)(圖5-B)，且均以0.5 μmol·L作用濃度最佳。以上結(jié)果表明，MitoQ(0.5 μmol·L和1 μmol·L)能顯著增加線粒體膜電位與ATP的含量，改善BMSCs線粒體功能。

A、B分別為MitoQ處理后BMSCs的線粒體膜電位水平(比例尺=100 μm)與ATP含量。

3 討論

將MSCs用于臨床治療通常需要對(duì)MSCs進(jìn)行大量的體外擴(kuò)增培養(yǎng)，但是長(zhǎng)期的體外擴(kuò)增培養(yǎng)大多伴隨氧化應(yīng)激水平升高，從而誘導(dǎo)MSCs衰老，表現(xiàn)為細(xì)胞增殖和多系分化潛能降低，制約了MSCs的臨床應(yīng)用。大量研究發(fā)現(xiàn)，線粒體功能變化與MSCs體外擴(kuò)增時(shí)的衰老存在緊密的聯(lián)系，Stab等發(fā)現(xiàn)脂肪來(lái)源的MSCs(ADSCs)體外長(zhǎng)期擴(kuò)增培養(yǎng)后，細(xì)胞內(nèi)的ROS水平增加，線粒體分裂融合失衡，線粒體膜電位降低，并且表現(xiàn)出衰老特征； Seok等發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期培養(yǎng)會(huì)導(dǎo)致人胎盤來(lái)源的MSC(PD-MSC)中線粒體功能障礙，且衰老標(biāo)志物如SA-β-gal和p21增加，增殖、分化潛能降低；Li等發(fā)現(xiàn)，隨著傳代次數(shù)的增加，人BMSCs線粒體動(dòng)力學(xué)失衡，ROS大量蓄積，最終導(dǎo)致BMSCs復(fù)制性衰老。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，與P3代相比，P6代BMSCs抗氧化基因表達(dá)下調(diào)；線粒體融合明顯增強(qiáng)，線粒體分裂與線粒體生物合成能力顯著減弱；線粒體膜電位極顯著降低且ATP合成能力削弱，表明隨著體外傳代次數(shù)增加，犬BMSCs線粒體功能明顯受損。

維持線粒體功能的穩(wěn)定是緩解BMSCs氧化應(yīng)激從而提高其臨床應(yīng)用效率的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素，黃芪多糖、?；撬崦撗跄懰岷虲oQ10等抗氧化劑能調(diào)節(jié)線粒體融合分裂，穩(wěn)定線粒體膜電位，增強(qiáng)超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化酶的活性來(lái)清除過量的ROS，從而緩解MSCs的衰老。作為CoQ10的衍生物，MitoQ可維持線粒體形態(tài)，提高細(xì)胞線粒體膜電位與ATP水平，增強(qiáng)SOD和GSH-Px的活性，減少氧化應(yīng)激條件下線粒體ROS的蓄積，在高血糖、血小板減少癥和椎間盤退變等多種疾病中發(fā)揮有益作用。本研究同樣發(fā)現(xiàn)在P6代BMSCs中添加MitoQ預(yù)處理，能極顯著促進(jìn)線粒體分裂，穩(wěn)定線粒體膜電位，同時(shí)促進(jìn)線粒體ATP合成。但是MitoQ處理后線粒體融合基因2同樣略有增強(qiáng)，這可能是由于BMSCs抗氧化能力削弱，線粒體可以通過融合減少ROS的生成，保護(hù)細(xì)胞免受凋亡。此外，與Zhou等的發(fā)現(xiàn)相似，MitoQ還能顯著上調(diào)BMSCs抗氧化基因1、2、和-的mRNA表達(dá)，增強(qiáng)BMSCs抗氧化能力。

綜上所述，MitoQ不僅能顯著提高BMSCs線粒體分裂能力，穩(wěn)定線粒體膜電位，促進(jìn)線粒體合成ATP，還能顯著上調(diào)抗氧化基因1、2、和-的表達(dá)，增強(qiáng)BMSCs抗氧化能力，本試驗(yàn)為進(jìn)一步提高犬BMSCs的應(yīng)用效率打下了理論基礎(chǔ)。