復方苓桂顆粒薄層色譜鑒別研究

劉柳毅　劉麗君　紀秋鳳　李瑞明

【摘 要】 目的：建立復方苓桂顆粒的薄層色譜（TLC）鑒別方法。方法：采用薄層色譜法分別對復方苓桂顆粒中的桂枝、茯苓、大黃在自制板與預制板上進行定性鑒別，并進行低濕（RH32%），常濕（RH65%），高濕（RH88%）的耐用性實驗。結果：桂枝、茯苓、大黃供試品溶液色譜與相應對照藥材色譜在相同位置上顯相同顏色斑點，且預制板和自制板上都顯示清晰，各濕度條件下的色譜都有明顯的斑點。結論：本方法簡便，專屬性強，耐用性良好，陰性無干擾，可作為復方苓桂顆粒的薄層鑒別方法。

【關鍵詞】 復方苓桂顆粒;薄層色譜法;質量標準

【中圖分類號】R284.1【文獻標志碼】 A? 【文章編號】1007-8517（2022）05-0052-06

基金項目：深圳市光明區(qū)衛(wèi)生健康局中醫(yī)藥科研項目（GM2019020026）。

作者簡介：劉柳毅（1992-），女，漢族，碩士，主管藥師，研究方向為醫(yī)院制劑開發(fā)研究。E-mail：liuly56@mail.sysu.edu.cn

通信作者：李瑞明（1974-），男，漢族，碩士，副主任藥師，研究方向為醫(yī)院制劑開發(fā)研究。E-mail：liruiming321@163.com

Study on the Ldentification of Fufang Linggui Granules By Thin-layer Chromatography

LIU Liuyi LIU Lijun JI Qiufeng LI Ruiming*

The Seventh Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University，Shenzhen 518107，China

Abstract：Objective

To establish the Thin-layer chromatography（TLC） identification method of Fufang Linggui Granules.

Methods Thin-layer chromatography（TLC） method was used to qualitatively identify Cinnamomi Ramulus， Poria cocos and Rhubarb in the prescription of Fufang Linggui granules on self-made plates and prefabricated plates， and carried out low-humidity（RH32%）， regular humidity（RH65%）， high humidity（RH88%） durability test.Results The chromatograms of the test solutions of Cinnamomi Ramulus， Poria cocos and Rhubarb showed the same color spots on the same position in the chromatogram of the corresponding medicinal materials. The results were clear on the prefabricated plate and the self-made plate， and the chromatograms under various humidity conditions have obvious spots. Conclusion The method is simple， with good specificity， strong durability and no interference， and can be used as the thin-layer chromatography method of Fufang Linggui Granules.

Key words：Fufang Linggui Granules; Thin-layer Chromatography（TLC）; Quality Control

自改革開放以來，隨著我國人民的生活水平不斷提高，越來越多的人患有與營養(yǎng)相關的代謝綜合征（高血壓、糖尿病、肥胖等）。中山大學附屬第七醫(yī)院秦鑒教授倡導服用加味苓桂術甘湯聯(lián)合短期禁食治療代謝綜合征，對于高血脂、高血壓、肥胖以及糖尿病，目前已有大量的臨床病例證明有肯定療效^[1-3]。加味苓桂術甘湯以溫陽化飲第一方的經(jīng)典名方“苓桂術甘湯”進行加減，由茯苓、桂枝、大黃等7味中藥組成。本方重用茯苓為君藥，茯苓既善滲濕健脾，又可利水扶正，桂枝溫脾陽，暢營血，助運水，與茯苓合用化濕利水，具有溫陽化飲，健脾祛濕的功效。為便于患者攜帶以及服用，我院正在將加味苓桂術甘湯自主研發(fā)成醫(yī)院制劑——復方苓桂顆粒。在國內外研究報道中，僅查到黃曉紅于2002年發(fā)表的碩士學位論文對苓桂術甘湯開展了質量標準研究^[4]，其薄層色譜鑒別試驗主要參照《中國藥典》2000年版實施，此后《中國藥典》已有多版更新，且未查到國內外有類似組方的顆粒劑型的質量標準研究。為完善復方苓桂顆粒的質量標準，保證臨床用藥安全有效，本研究對制劑中的桂枝、茯苓、大黃進行薄層色譜鑒別研究，為復方苓桂顆粒質量標準的完善提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 EL204電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）;WFH-203B 暗箱式三用紫外分析儀（上海米青科實業(yè)有限公司）;P-1薄層色譜展開缸（上海信誼儀器廠有限公司）;SHD-III循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）;KQ5200DE型臺式數(shù)控超聲波清洗器（東莞市科橋超聲波設備有限公司）;HH-4電子恒溫水浴鍋（蘇州威爾實驗用品有限公司）;DHG-9076A型電熱恒溫鼓風干燥箱臺（上海精宏實驗設備有限公司）。5AFB8854-D19B-4566-8745-6DE536630E59

1.2 材料 復方苓桂顆粒（批號：20190316，實驗室自制）;桂枝對照藥材（批號：121191-201605）、茯苓對照藥材（批號：121117-201509）、大黃對照藥材（批號：120902-201311），以上對照藥材均購自中國食品藥品檢定研究院;去桂枝顆粒樣品、去茯苓顆粒樣品、去大黃顆粒樣品（批號均為20190318，藥劑實驗室自制）、乙醇、無水乙醇、甲醇、二氯甲烷、石油醚（60～90℃）、乙醚、乙酸乙酯、環(huán)己烷、甲酸均為分析純;薄層層析硅膠G（批號：0130328，青島海洋化工有限公司）、薄層層析硅膠板（批號：HC39961356，默克化工技術（上海）有限公司）。

2 方法與結果

2.1 桂枝的薄層色譜鑒別

2.1.1 溶液制備 取復方苓桂顆粒10 g，研細，加入乙醇50 mL，超聲處理30 min，靜止10 min，濾過，濾液置恒溫水浴鍋上蒸干，殘渣加入5 mL乙醇使其溶解，作為供試品溶液。取桂枝對照藥材5 g，與供試品溶液相同的方法進行制備對照藥材溶液。取去桂枝顆粒樣品10 g，按同法制備得桂枝陰性對照溶液。

2.1.2 鑒別 自制板常濕（RH65%）條件下，照薄層色譜法（《中國藥典》2015版四部通則0502^[5]）進行試驗，吸取供試品溶液、對照藥材溶液、陰性對照溶液各10 μL，分別點于同一自制硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（17∶3）為展開劑，展開，取出，晾干，置三用紫外分析儀（365 nm）下檢視。供試品薄層色譜在對應位置上，與桂枝對照藥材顯示相同的淺藍色斑點，且桂枝陰性對照無此斑點。結果如圖1所示。

2.1.3 耐用性考察

2.1.3.1 不同相對濕度的比較 以“2.1.1”項下方法制備溶液為樣品，取點樣后的自制薄層板，分別在不同濕度的層析缸中展開，按“2.1.2”項下方法試驗。低濕（RH32%）和高濕（RH88%）條件下，供試品薄層色譜在對應位置上，與桂枝對照藥材顯示相同的淺藍色斑點，且桂枝陰性對照無此斑點，結果分別如圖2、圖3所示。

2.1.3.2 不同薄層層析硅膠板的比較 以“2.1.1”項下方法制備溶液為樣品，取默克化工技術（上海）有限公司生產(chǎn)的薄層層析硅膠板，按照“2.1.2”項下方法在常濕（RH65%）條件試驗，供試品薄層色譜在對應位置上，與桂枝對照藥材顯示相同的淺藍色斑點，且桂枝陰性對照無此斑點。結果如圖4所示。

2.2 茯苓的薄層色譜鑒別

2.2.1 溶液制備 取復方苓桂顆粒18 g，研細，加入甲醇30 mL，超聲處理30 min，靜置10 min，濾過，濾液置恒溫水浴鍋上蒸干，殘渣加入二氯甲烷5 mL溶解，再濾過，取濾液濃縮至1 mL，作為供試品溶液。取茯苓對照藥材5 g，以供試品相同的方法制備對照藥材溶液。取去茯苓顆粒樣品，同法制備茯苓陰性對照溶液。

2.2.2 鑒別 自制板常濕（RH65%）條件下，照薄層色譜法（《中國藥典》2015版四部通則0502^[5]）進行試驗，吸取上述3種溶液各6 μL，分別點于同一自制硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-乙醚（9∶6）為展開劑，展開，取出，晾干，置三用紫外分析儀（365 nm）下檢視。供試品薄層色譜在對應位置上，與茯苓對照藥材顯示相同顏色的斑點，且茯苓陰性對照沒有此斑點。結果如圖5所示。

2.2.3 耐用性考察

2.2.3.1 不同相對濕度的比較 以“2.2.1”項下方法制備溶液為樣品，取點樣后的自制薄層板，分別在不同濕度的層析缸中展開，按“2.2.2” 項下方法試驗。低濕（RH32%）和高濕（RH88%）條件下，供試品薄層色譜在對應位置上，與茯苓對照藥材顯示相同的淺藍色斑點，且茯苓陰性對照無此斑點。結果分別如圖6、圖7所示。

2.2.3.2 不同薄層層析硅膠板的比較 以“2.2.1”項下方法制備溶液為樣品，取默克化工技術（上海）有限公司生產(chǎn)的薄層層析硅膠板，按照“2.2.2” 項下方法在常濕（RH65%）條件試驗，供試品薄層色譜在對應位置上，與茯苓對照藥材顯示相同的淺藍色斑點，且茯苓陰性對照無此斑點。結果如圖8所示。

2.3 大黃的薄層色譜鑒別

2.3.1 溶液制備 取復方苓桂顆粒10 g，研細后加入無水乙醇20 mL，超聲處理30 min，靜置10 min，濾過，濾液置恒溫水浴鍋上濃縮至1 mL，制成供試品溶液。取大黃對照藥材1 g加甲醇5 mL，超聲處理5 min，靜置5 min，取上清液即為對照藥材溶液。取去大黃顆粒樣品10 g，按供試品方法制備得大黃陰性對照溶液。

2.3.2 鑒別 自制板常濕（RH65%）條件下，照薄層色譜法（《中國藥典》2015版四部通則0502^[5]）進行試驗，吸取供試品溶液6 μL，對照藥材溶液2 μL，大黃陰性對照溶液6μL，分別點于同一自制硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸（12∶3∶0.1）為展開劑，展開，取出，晾干，置三用紫外分析儀（254 nm）下檢視。供試品薄層色譜在對應位置上，與大黃對照藥材顯示相同的黃色斑點，且大黃陰性對照沒有此斑點。結果如圖9所示。

2.3.3 耐用性考察

2.3.3.1 不同相對濕度的比較 以“2.3.1”項下方法制備溶液為樣品，取點樣后的自制薄層板，分別在不同濕度的層析缸中展開，按“2.3.2” 項下方法試驗。低濕（RH32%）和高濕（RH88%）條件下，供試品薄層色譜在對應位置上，與大黃對照藥材顯示相同的淺藍色斑點，且茯苓陰性對照無此斑點。結果分別如圖10、圖11所示。

2.3.3.2 不同薄層層析硅膠板的比較 以“2.3.1”項下方法制備溶液為樣品，取默克化工技術（上海）有限公司生產(chǎn)的薄層層析硅膠板，按照“2.3.2” 項下方法在常濕（RH65%）條件試驗，供試品薄層色譜在對應位置上，與大黃對照藥材顯示相同的淺藍色斑點，且大黃陰性對照無此斑點。結果如圖12所示。5AFB8854-D19B-4566-8745-6DE536630E59

3 分析與討論

復方苓桂顆粒成分較為復雜，各個成分之間極易產(chǎn)生干擾。薄層色譜法雖然操作簡單便捷，但容易受到樣品預處理方式，展開劑等相關條件影響^[6]。因此，薄層色譜鑒別的條件應根據(jù)藥物組方來進行多次調整預實驗，才能確定鑒別的各個條件，保證鑒別的結果。

3.1 桂枝薄層鑒別條件的選擇 桂枝薄層色譜研究先參照《中國藥典》2015版（一部）桂枝^[7]的方法進行鑒別。用乙醚來預處理樣品，以香草醛硫酸試液為顯色劑。但進行多次試驗后發(fā)現(xiàn)，分離效果不理想，雜質較多，考慮到乙醚的毒性以及蒸干乙醚的危險性，改用其他方法。參照藥典另一方法，以乙醇來對樣品進行預處理，顯色劑用二硝基苯肼乙醇試液，噴顯色劑后，雖有相同顏色的斑點，但較弱，顯色不明顯。經(jīng)過多次預實驗，參考文獻^[8-9]方法，用乙醇預處理樣品，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（17∶3）為展開劑，在紫外光燈365 nm下檢視，斑點清晰明顯，陰性無干擾。與其他方法相比，無需使用乙醚，同時也不用配置顯色劑，就能取得較好的結果。

3.2 茯苓薄層鑒別條件的選擇 在茯苓的薄層色譜研究中，先參照《中國藥典》2015版一部茯苓以及文獻^[10]方法，對樣品乙醚超聲處理然后蒸干溶于正己烷中，但斑點分離效果不理想，參考文獻^[11]預處理方法，加乙醚水浴回流，薄層色譜中分離效果仍不理想，且乙醚毒害性較大。采用文獻^[12]中的處理方法，加乙酸乙酯超聲處理樣品，濾過蒸干后用甲醇溶解，紫外光燈365 nm下觀察拖尾嚴重，噴香草醛硫酸溶液后顯色不明顯。最后參考曲婷麗等^[13]的參苓白術顆粒的薄層色譜鑒別方法后，先加甲醇超聲處理樣品，濾過濾液蒸干后，用二氯乙烷溶解，展開后置紫外光365 nm下檢視，斑點分離較好，陰性無干擾。和其他方法相比，該方法無需使用乙醚，安全性更好，也無需水浴回流，節(jié)省能耗。

3.3 大黃薄層鑒別條件的選擇 對于大黃的薄層鑒別，首先用甲醇超聲處理，再加水和鹽酸回流，然后用乙醚提取，揮干后，殘渣加入三氯甲烷即得到供試品溶液，但分離效果不理想且拖尾現(xiàn)象嚴重。進一步參考王暢等^[14]對榛苓顆粒的薄層色譜方法，將展開劑調整為石油醚（30～60 ℃）：甲酸∶酸乙酯（15∶1∶5），效果仍不理想，有較多雜質干擾。經(jīng)過多次預實驗，改進供試品的制備方法：樣品加無水乙醇超聲處理，濾過后水浴濃縮得到供試品溶液。展開劑選用環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸（12∶3∶0.1）。在紫外光365 nm檢視下，斑點分離完好，清晰，陰性無干擾。與藥典記載方法以及其他文獻方法相比，此方法預處理只需使用無水乙醇，且操作便捷，無需多次過濾和加熱回流。另外文獻中使用了三氯甲烷，三氯甲烷對人體危害性大，而本試驗采用的無水乙醇增加了安全性，同時也達到了良好的效果。

3.4 薄層板的選擇 不同薄層板對藥材的承載量不同，分離效果可能會有差異。根據(jù)實驗結果，三味藥材在自制板和預制板上，都能顯示清晰的斑點，分離較好，陰性都無干擾，但預制板的斑點更加清晰、圓整，分離度較高，載樣量較小，預制板的分離度較低，載樣量較大，加大點樣量可得到滿意的結果。薄層板的耐用性實驗提示本方法兩者都適用，而預制板效果更好。

3.5 不同相對濕度的影響 比較桂枝在3個不同濕度條件的薄層色譜圖，常濕條件下斑點圓整、清晰，而低濕條件下，對應位置的色譜斑點更加清晰可見，因此該方法在低濕條件下也適用，并且效果更好。而高濕條件下，與常濕條件相比，對應位置的色譜斑點較為模糊，但斑點仍能分離完好可見，提示本方法也可適用于高濕條件下。

比較茯苓、大黃在3個不同濕度條件的薄層色譜圖，與常濕色譜圖相比，低濕和高濕的色譜圖在對應位置上的斑點雖可見，斑點仍分離完好，但都較為模糊。說明本方法雖然可適用于低濕和高濕條件下，但效果不如常濕條件。在對照藥材色譜圖相應的位置上，各個濕度環(huán)境下的各供試品色譜均顯示相同顏色斑點，并且陰性對照色譜上無，提示本實驗方法耐用性良好。

4 結論

通過本實驗項目的優(yōu)化與驗證，本文建立的復方苓桂顆粒的桂枝、茯苓、大黃的薄層鑒別項色譜斑點清晰，專屬性強，陰性對照無干擾。實際操作簡便，耐用性好，可作為復方苓桂顆粒的定性鑒別。

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（收稿日期：2021-07-02 編輯：陶希睿）5AFB8854-D19B-4566-8745-6DE536630E59