基于葉綠素?zé)晒鈪?shù)評估蝴蝶蘭的組織培養(yǎng)潛力

朱珈葉　李丹丹　 陳倩　印麗萍　郭水良

摘? 要： 以蝴蝶蘭（ RcHb.F.）的“大辣椒”品種為對象，研究了不同高溫脅迫處理時間下的蝴蝶蘭形態(tài)、葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化，并對處理過的蝴蝶蘭材料進行了組織培養(yǎng).結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)蝴蝶蘭“大辣椒”品種莖段的PSⅡ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量（/）低于0.35時，其無法作為外植體進行組織培養(yǎng).與蝴蝶蘭葉片相比，莖段的/更能夠指示蝴蝶蘭組織培養(yǎng)的成功概率.

關(guān)鍵詞： 蝴蝶蘭; 莖段; 葉片; PSⅡ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量（/）; 組織培養(yǎng)

中圖分類號： Q 945??? 文獻標(biāo)志碼： A??? 文章編號： 1000-5137（2022）02-0251-06

Potential evaluation of tissue culture for by using chlorophyll fluorescence parameters

ZHU JiayeLI DandanCHEN QianYIN LipingGUO Shuiliang

（1.College of Life Sciences， Shanghai Normal University， Shanghai 200234， China;2.Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Shanghai 200315， China）

“Dalajiao” is a common variety of The individuals of the variety were cultured at a high temperature of 35 ℃， 14 h light/d with different durations. Throughout the treatment， their morphological changes were observed and the chlorophyll fluorescence parameters including the maximum quantum efficiency of photosystem II （PSⅡ） photochemistry（/）， electron transfer rate under different light intensities were determined. Their corresponding explants were cultured to evaluate the potential for successful reproduction . We found that there existed a positive correlation between / of the stems and the successful rate of tissue culture with corresponding stems. When / of stems was less than or equal to 0.35， the stems were unable to be cultured because of lacking vitality. The / of the stems is better than that of the leaves in indicating their potential as explants for tissue culture.

; stem; leaf; photosystem Ⅱ （PSⅡ） photochemistry（/）; tissue culture

蝴蝶蘭（ RcHb.F.）是蘭科附生單莖性植物.由于其形態(tài)和結(jié)構(gòu)上均與眾不同，且外形具有娥蝶般的美麗，故以蝴蝶蘭來命名.蝴蝶蘭為多年生常綠草本，是熱帶/亞熱帶氣生蘭.中國云南南部、西藏南部、廣東南部、海南及臺灣為該屬植物的自然分布的北界.蝴蝶蘭在國內(nèi)外鮮花市場上深受歡迎，具有很高的觀賞價值和經(jīng)濟價值.

隨著蘭花種植業(yè)的發(fā)展，蝴蝶蘭的組織培養(yǎng)發(fā)展迅速.早在1949年，人們利用蝴蝶蘭花梗腋芽成功地進行了組織培養(yǎng)，正式提出了一種蝴蝶蘭屬植物營養(yǎng)繁殖的方法，實現(xiàn)了蝴蝶蘭試管繁殖.蝴蝶蘭的莖尖、莖段和幼葉、花梗腋芽、花梗節(jié)間、根尖等部位都可做離體組織培養(yǎng)的外植體.但是葉片的誘導(dǎo)成功率很低.蝴蝶蘭不同外植體的成活率有差異，其中花梗側(cè)芽的成活率最高，達75.0%，其次為花梗，成活率為62.5%，葉片和根尖最差，分別為12.5%和7.5%.

蝴蝶蘭組培的基本培養(yǎng)基包括Murashige and Skoog （MS）培養(yǎng)基，1/2 MS培養(yǎng)基，Vacin and Went （VW）蘭科植物培養(yǎng)基，Gamborg’s B-5培養(yǎng)基，Knudson C （KC）培養(yǎng)基，Kyoto so1ution花肥培養(yǎng)基，花寶及其改良型等.但不同品種的蝴蝶蘭以及取用不同部位的外植體，最適培養(yǎng)基的選擇也有所不同.1/2MS或改良MS較MS效果好，減少MS中大量元素和部分微量元素及有機成分，適當(dāng)增加少量的葉酸，有利于原球莖的增殖生長.植物組織培養(yǎng)中常添加一些天然有機物.如椰子汁、馬鈴薯汁和香蕉汁可提高蝴蝶蘭原球莖的增殖率.蝴蝶蘭組培中常用的細胞分裂素為6-BA，質(zhì)量濃度較高（1～8 mg?L）的6-BA能促進蝴蝶蘭原球莖增殖，質(zhì)量濃度較低（0.1～0.5 mg?L）的6-BA能促進原球莖分化.

蝴蝶蘭在生長發(fā)育期對高溫敏感，在高溫脅迫下極易受到抑制和危害.其最適宜生長的溫度是18～28 ℃.溫度過高會導(dǎo)致蝴蝶蘭細胞內(nèi)活性氧（ROS）大量積累，使其代謝紊亂，從而導(dǎo)致植株生長緩慢甚至死亡.恒溫30 ℃處理24 h能顯著提高蝴蝶蘭抗氧化酶活性，然而40 ℃處理會破壞抗氧化酶系統(tǒng).關(guān)于蝴蝶蘭高溫脅迫方面的研究，主要集中在赤霉素、細胞分裂素與成花的關(guān)系，高溫脅迫下蝴蝶蘭的防御機制和傷害機理，蝴蝶蘭的高溫脫毒，以及耐熱性的誘導(dǎo)及抗熱害栽培等方面.

隨著中國對外交流的擴大，園藝植物進出口頻繁.目前國內(nèi)外對蝴蝶蘭的研究主要集中在組織快速繁殖體系的建立、滅菌方法、降低褐化，及對脅迫的生理響應(yīng)等方面，但很少有關(guān)于環(huán)境脅迫對蝴蝶蘭可組培性影響的研究.蝴蝶蘭作為蘭科珍貴的園藝種源，為防止其種源流失，同時也為利用境外蝴蝶蘭種源，建立對蝴蝶蘭植株活力的快速檢測方法，具有實際應(yīng)用價值.本研究分別以蝴蝶蘭無菌試管苗為材料，研究了高溫脅迫條件下蝴蝶蘭的葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化，及其與蝴蝶蘭生長繁殖潛力之間的關(guān)系，旨在建立蝴蝶蘭植株活力的快速檢測方法.

1? 材料與方法

培養(yǎng)材料為蝴蝶蘭“大辣椒”品種3個月組培苗，購自濰坊市濰城區(qū)南關(guān)花卉市場.

選取株齡、株高、生勢、葉色基本一致的3個月齡的蝴蝶蘭“大辣椒”組培苗植株，放置在無菌瓶中，每瓶一株，于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng).培養(yǎng)條件為：溫度35 ℃，光照12 h·d，空氣相對濕度70% RH，光照強度2 000 lx.對照的溫度為（25±2）℃，光照12 h·d.

每隔2 d取出高溫處理的蝴蝶蘭幼苗植株，暗適應(yīng)20 min后，采用便攜式調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨xPAM，分別測定蝴蝶蘭兩個品種莖段和第二片葉的PSⅡ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量（/）.每個處理重復(fù)3次.同樣每隔2 d取出高溫處理的蝴蝶蘭幼苗植株進行可組培性研究，切去根部和葉子，保留莖段部位進行組培.

接種培養(yǎng)基為：花寶1號（質(zhì)量濃度3 g?L）+6-BA（質(zhì)量濃度5.0 mg?L）+NAA（質(zhì)量濃度0.5 mg?L）+蔗糖（質(zhì)量濃度30 g?L）+椰汁（體積分?jǐn)?shù)200 mL?L）+瓊脂（質(zhì)量濃度6 g?L）+活性炭（質(zhì)量濃度1 g?L）+pH值6.0.接種后的莖段放置在無菌培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為（25±2）℃，光源為普通熒光燈，光照度約1 500～2 000 lx，光照時間為12 h?d.每個處理設(shè)5次重復(fù).培養(yǎng)75 d后觀測蝴蝶蘭成苗情況，以形成葉片、叢生芽為組培成功標(biāo)準(zhǔn).

2? 結(jié)果與分析

高溫脅迫下蝴蝶蘭“大辣椒”品種的形態(tài)變化

對照處理的蝴蝶蘭植株，在實驗期間均保持良好生長狀態(tài).高溫處理下，“大辣椒”品種在第10天開始變黃，第22天大部分發(fā)黃枯萎（圖1）.

高溫脅迫下蝴蝶蘭“大辣椒”品種葉片和莖段/值

高溫脅迫下，隨著處理時間的延長，蝴蝶蘭的葉片/值不斷下降，第21天后，該指標(biāo)急劇下降，到第24天時為0.與葉片相比，莖段的/值下降的相對平緩，到第24天時/值為0.35.

高溫脅迫處理下，隨著處理時間的延長，蝴蝶蘭莖段/值整體呈不斷下降的趨勢，處理20 d后，/值為0.35，仍有一定活力.高溫脅迫下，莖段的最大量子產(chǎn)量下降程度弱于葉片（圖2）.

測定不同波長的光合有效輻射（PAR）下蝴蝶蘭的光合電子傳遞速率（ETR），得到快速光響應(yīng)曲線.發(fā)現(xiàn)在高溫脅迫處理下，隨著處理時間的延長，快速光響應(yīng)曲線整體呈不斷下降的趨勢，第22天時光響應(yīng)曲線降到最低，但是仍然有一定活性，整體趨勢與高溫脅迫下“大辣椒”莖段/值的變化趨勢一致（圖3）.

高溫脅迫下兩種蝴蝶品種葉片/值與可組培相關(guān)性

蝴蝶蘭“大辣椒”品種在高溫脅迫環(huán)境下14 d后，外植體組培成功率都為100%;第16天時，組培成功率降到了67%;第22天時為33%;第24天以后為0.與“黃花紅心”品種相比，“大辣椒”品種在高溫脅迫下不管是/值變化，還是外植體的組培可繁育能力，相應(yīng)指標(biāo)下降的速率都更為緩慢.

高溫脅迫環(huán)境下蝴蝶蘭幼苗的可組培性與其葉片的/值正相關(guān).由于測量/值的部位為葉片，進行可組培性探究的部位為莖段，莖段可組培性與其葉片的F/值對應(yīng)性不是很強.

在高溫處理12 d后，“大辣椒”品種莖段的/值大于0.5，組培成功率都在80%以上;/值低于0.5以后，可組培成功率依次遞減;當(dāng)/值小于0.35時，組培成功率均為0.由于組培部分用的是切掉根部和葉子的蝴蝶蘭莖段作外植體，高溫脅迫下蝴蝶蘭莖段的_v/值與可組培相關(guān)性更為直接.蝴蝶蘭莖段是組培性探究的實驗材料，直接測量莖段的葉綠素?zé)晒鈪?shù)，特別是/值，能夠很好地指示蝴蝶蘭的可組織培養(yǎng)成功率（表1）.

3? 討論

高溫脅迫下，蝴蝶蘭幼苗PSⅡ反應(yīng)中心出現(xiàn)了可逆或不可逆失活，降低了原初光能轉(zhuǎn)換效率，對光合機構(gòu)和光合色素產(chǎn)生光氧化破壞.不同的蝴蝶蘭品種對高溫脅迫處理的耐受性不同，由于“大辣椒”品種的葉片比較肥厚，蘊藏水分比較多，在高溫脅迫下的耐受力比其他品種更強.今后將在更多的蝴蝶蘭品種中開展實驗研究，以評估不同品種對高溫脅迫的耐受力.

隨著高溫脅迫處理時間的延長，蝴蝶蘭莖段/值整體也呈不斷下降的趨勢，與高溫處理蝴蝶蘭葉片相比，莖段的/值變化較緩，而且其與蝴蝶蘭的組培成功率之間的相關(guān)性更加緊密和直接.高溫處理20 d后，蝴蝶蘭“大辣椒”莖段的/值下降為0.35，此種情況下莖段已經(jīng)失去進行擴繁的活力.因此，蝴蝶蘭莖段/值0.35可以作為一個判別莖段是否能夠成為外植體進行組培擴繁的閾值.研究蝴蝶蘭幼苗在高溫脅迫環(huán)境下的葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化與其可組培性的關(guān)系，不僅可以為蝴蝶蘭規(guī)?；a(chǎn)提供實質(zhì)性的參考建議，更能為海關(guān)檢驗檢疫局管控蝴蝶蘭出入境情況提供幫助.

參考文獻：

[1]? MCWILLIAMS E L. Comparative rates of dark CO uptake and acidification in the Bromeliaceae， Orchidaceae， and Euphorbiaceae [J]. Botanical Gazette，1970，131（4）：285-290.

[2]? CHRISTENSON E A. ： A Monograph [M]. Portland， Oregon （U.S.A.）： Timber Press，2001.

[3]? WANG L M， WANG S Q， YANG Y F. Germ plasm resources and breeding of orchids [J]. Journal of Anyang Institute of Technology，2005，2：4-10.

[4]? LI Z H， JIA Y. Rapid Reproduction and Conservation of Rare Orchids [M]. Shanghai： Shanghai Publisher of Science and Technology，2006：3-5.

[5]? ROTOR G J. A method of vegetative propagation of species and hybrids [J]. Proceedings American Society for Horticultural Science，1950，55：434.

[6]? INTUWONG O， SAGAWA Y. Clonal propagation of by shoot tip culture [J]. American Orchid Society Bulletin，1974，93：893-895.

[7]? TAN W C， DAI C G. Tissue Culture Methods for Ornamental Plants [M]. Beijing： China Forestry Publishing House，1991.

[8]? PENG L X， WANG S， MENG G Y. Study on tissue culture and rapid propagation of [J]. Tianjin Agricultural Sciences，1999，5（2）：27-29.

[9]? LI J， HUANG M R， WANG M X. Plantlets regeneration from leaf explants of [J]. Journal of Nanjing Forestry University （Natural Sciences Edition），2005，29（3）：28-32.

[10] TANAKA M， SAKANISHI Y. Clonal propagation of by leaf tissue culture [J]. American Orchid Society Bulletin，1977，46：73-737.

[11] LU X H， GUO W J， XU L H， et al. The preliminary research on the rapid propagation of by using the joint-points of flower-stems as explants [J]. Acta Horticulturae Sinica，2002，29（5）：491-492.

[12] LI J J， LIAO J J， KE W L. Tissue culture using root segment for [J]. Plant Physiology Communications，2000，36（1）：209.

[13] GU W M， CAO C Y， DING S M， et al. On tissue culture and rapid propagation for [J]. Journal of Shandong Forestry Science and Technology，2004（5）： 47-48.

[14] LI C H. Study on micropropagation of species [D]. Yangzhou： Yangzhou University，2004.

[15] REN Q P. New technology of tissue culture and rapid propagation for [J]. Practical Forestry Technology，2007（12）：9-13.

[16] PAN X F， WANG A S， LI H Z. A review on the progress of rapid propagation through tissue culture [J]. Tropical Forestry，2005，33（1）：45-47.

[17] LI J M. Tutorials in Plant Tissue Culture [M]. Beijing： China Agricultural University Press，2002：4-5.

[18] ZHU Z Q. Plant Cell Engineering [M]. Beijing： Chemical Industry Press，2003.

[19] CHEN Z L， YE X L， LIANG C Y. culture of the inflorescence of [J]. Acta Horticulturae Sinica，2003，30（2）：242-244.

[20] SUN L. Demonstration and application of rapid propagation technique in tissue culture of Orchidaceae [D]. Yangzhou： Yangzhou University，2009.

[21] LIU X Y， XIANG Q Y， LIU L L， et al. The effect of basic culture media and additional compounds on the propagation of PLB [J]. Seed，2005，24（6）：18-20.

[22] HE S L， WANG X， LU L， et al. The effect of culture media and organic compounds on the differentiation of PLB [J]. Journal of Central South Forestry University，2003，23（5）：11-13.

[23] CHEN Y， LIN K X， WANG J H. Studies on rapid propagation and large-scale planting of hybrids [J]. Journal of Zhejiang University （Sciences Edition），2004，31（1）：84-88.

[24] WANG L， CHEN F D， CHEN F， et al. Effects of different media and additions on proliferation and growth of pedicel buds for [J]. Jiangsu Agricultural Sciences，2013，41（1）：56-57，103.

[25] BHATTARCHARJEE S.Effect of growth regulating substance on seed germination of hybrid [J]. Indian Agriculturist，1999，43（1/2）：79-83.

[26] YANG H G， YAN S L， CHEN H J， et al. Effect of exogenous methyl jasmonate， calcium and salicylic acid on the heat tolerance in seedlings under high temperature stress [J]. Chinese Agricultural Science Bulletin，2011，27（28）：150-157.

[27] YANG H G， YANG Y M， LIAO H N， et al. The inducing effect of chitosan on heat resistance of seedlings [J]. Chinese Journal of Ecology，2015，34（12）：3430-3437.

[28] ZHOU L L. Establishment of rapid propagation system for tissue cultures [D]. Hangzhou： Zhejiang Agriculture and Forestry University，2007.

[29] LIU L F， WANG J X. Study on rapid reproduction technology in hybrid species [J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences，2013，41（29）：11601-11603.

[30] ZENG D H， YU P Y， CHEN W Y， et al. Study on rapid propagation of Red Sky tissue culture [J]. Tropical Forestry，2014，42（1）：32，46-49.

[31] CHEN L， PAN R Z， CHEN R M. Effects of media， growth regulators and dividing on the growth of protocorms cultured [J]. Journal of Tropical and Subtropical Botany，1999，7（1）： 59-64.

[32] HUANG S Q， LI Y T， LV C T， et al. Changes in carbohydrates distribution in leaves and axillary buds during floral induction [J]. Acta Horticulturae Sinica，2007，34（6）：1515-1519.

[33] HE J， WANG G D， WU Z. Effects of heat stress on morphological and antioxidant characteristics of seedlings [J]. Jiangsu Agricultural Sciences，2011（1）：192-196.

[34] YANG H G. Effect of high temperature stress on chlorophyll and its fluorescence parameters in seedlings [J]. Chinese Agricultural Science Bulletin，2012，28（19）：177-183.

（責(zé)任編輯：顧浩然）