上皮性卵巢癌患者血清miR-302b-3p、lncRNA SNHG16水平變化及其臨床意義

劉景云，楊斌 ，熊麗，周靜，王倩，張月

1 唐山市中醫(yī)醫(yī)院婦科內(nèi)分泌科，河北唐山 063000；2 東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院秦淮醫(yī)療區(qū)婦產(chǎn)科；3 唐山市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科

卵巢癌是病死率最高的婦科惡性腫瘤，據(jù)報道，全世界每年死亡病例超過15 萬例［1］。上皮性卵巢癌是卵巢癌最常見的病理類型，占所有卵巢癌的85%～90%［2］。近年來，上皮性卵巢癌的治療策略不斷改進，已從傳統(tǒng)的放化療轉(zhuǎn)向現(xiàn)在的新輔助放化療、靶向治療、免疫治療等綜合治療，但治療后復(fù)發(fā)仍不可避免，5 年生存率依然不高［3］。因此，早期診斷和治療仍然是提高上皮性卵巢癌患者生存期的關(guān)鍵。非編碼RNA 是一類不參與編碼蛋白質(zhì)的RNA，如微小RNA（miRNA）、長鏈非編碼RNA（lncRNA），但能夠在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達。miRNA是人體內(nèi)廣泛分布的內(nèi)源性非編碼RNA，能夠參與調(diào)控細胞的增殖、分化、凋亡等生物學行為，與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。miR-302b-3p是miRNA家族成員之一，能夠參與胃癌、非小細胞肺癌、宮頸癌等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［4］。lncRNA 是具有高度組織特異性的非編碼RNA，在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄后基因表達、基因結(jié)構(gòu)重塑、組蛋白修飾等過程中發(fā)揮重要作用［5］。SNHG16 是 lncRNA 家族成員之一，可通過miRNA 分子海綿作用調(diào)控細胞的增殖和分化，從而參與腫瘤進展及化療耐藥［6］。但miR-302b-3p、lncRNA SNHG16 與上皮性卵巢癌的關(guān)系鮮有報道。本研究探討了上皮性卵巢癌患者血清miR-302b-3p、lncRNA SNHG16 水平變化及其臨床意義?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇 2018 年 2 月—2021 年 1 月唐山市中醫(yī)醫(yī)院收治的上皮性卵巢癌患者83例（惡性組），均經(jīng)組織病理檢查確診。納入標準：①符合上皮性卵巢癌診斷標準；②年齡＞18 歲；③初診，入院前未接受任何抗腫瘤治療；④臨床病理資料完整。排除標準：①合并其他部位惡性腫瘤者；②合并自身免疫性疾病或感染性疾病者；③合并重要臟器嚴重疾病者；④合并急慢性感染者；⑤近1個月內(nèi)服用免疫抑制劑、激素類藥物治療者?；颊吣挲g42～65（58.12± 5.49）歲，孕次0～5（3.25± 0.79）次，產(chǎn)次0～4（2.12 ± 0.39）次；病理類型：漿液性癌68例，其他15 例；組織分化程度：中高分化31 例，低分化52例；FIGO 分期：Ⅰ、Ⅱ期21例，Ⅲ、Ⅳ期62例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例，有遠處轉(zhuǎn)移15例。同期選擇唐山市中醫(yī)醫(yī)院收治的良性卵巢腫瘤患者34例（良性組），均經(jīng)組織病理檢查證實?；颊吣挲g41～69（58.72 ±5.66）歲，孕次 0～5（3.15 ± 0.71）次，產(chǎn)次 0～3（2.01 ± 0.36）次；病理類型：卵巢黏液性囊腺瘤9例，卵巢子宮內(nèi)膜樣腫瘤8 例，輸卵管腺瘤樣瘤10例，輸卵管乳頭狀瘤7例。同期另選在唐山市中醫(yī)醫(yī)院體檢健康的女性志愿者29例（對照組），年齡40～67（58.79 ± 5.63）歲，孕次0～5（3.02 ± 0.85）次，產(chǎn)次0～3（2.05 ± 0.32）次。三組年齡、孕次、產(chǎn)次具有可比性。本研究經(jīng)唐山市中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（審批編號：20180451）。所有研究對象或其家屬知情同意并簽署書面知情同意書。

1.2 血清miR-302b-3p、lncRNA SNHG16 檢測 惡性組、良性組入院次日，對照組體檢當日，采集空腹肘靜脈血3 mL，置于干燥試管中，室溫靜置30 min，688×g離心5 min，留取上層血清。按mirVana?miRNA Isolation Kit說明提取血清總RNA，經(jīng)Agilent 2100生物分析儀鑒定，OD260/OD280為1.8～2.0。按M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶說明將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，按照SYBR Premix Ex Taq?Ⅱ試劑盒說明進行PCR 擴增。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計合成。miR-302b-3p 上游引物5'-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3'、下游引物 5′-TGCTTAAGTGCTTCCATGTT-3'，U6 上游引物 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'、下 游 引 物 5'-AACGCTTTCACGAATTTGCGT-3'。 lncRNA SNHG16 上 游 引 物 5'-GCAGAATGCCATGGTTTCCC-3'、下游引物 5'-GGACAGCTGGCAAGAGACTT-3'，GAPDH 上游引物 5'-GATATTGTTGCCATCAATGAC-3'、下游引物 5'-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3'。 PCR 反 應(yīng) 體 系 共20 μL：cDNA 模板 2 μL，上下游引物各 1 μL，Taq DNA 聚合酶 1 μL，dNTP 1.6 μL，10 × Buffer 2 μL，RNase-Free ddH2O 補足至 20 μL；反應(yīng)條件：95 ℃15 min，94 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s、70 ℃ 30 s 共 40 個循環(huán)。PCR 反應(yīng)在 Applied Biosystems?StepOne?實時熒光定量PCR 儀上完成。反應(yīng)結(jié)束，繪制熔解曲線，收集循環(huán)閾值（CT）數(shù)。以 U6 或 GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計算 miR-302b-3p、lncRNA SNHG16相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS25.00 統(tǒng)計軟件。計量資料經(jīng)Shapiro-Wilk 檢驗符合正態(tài)分布，以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；兩組比較采用獨立樣本t檢驗。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)分析法。預(yù)測效能分析采用受試者工作特征（ROC）曲線。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 三組血清 miR-302b-3p、lncRNA SNHG16 水平比較 見表1。

表1 三組血清miR-302b-3p、lncRNA SNHG16水平比較（）

表1 三組血清miR-302b-3p、lncRNA SNHG16水平比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與良性組比較，#P＜0.05。

組別對照組良性組惡性組n 29 34 83 F P lncRNA SNHG16 0.65±0.17 0.69±0.18 1.65±0.33*#226.976＜0.05 miR-302b-3p 2.01±0.35 1.98±0.31 1.02±0.27*#193.130＜0.05

2.2 上皮性卵巢癌患者血清miR-302b-3p、lncRNA SNHG16水平與臨床病理特征的關(guān)系 見表2。

表2 上皮性卵巢癌患者血清miR-302b-3p、lncRNA SNHG16水平與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 上皮性卵巢癌患者血清miR-302b-3p 水平與血清lncRNA SNHG16 水平的關(guān)系 Pearson 相關(guān)分析顯示，上皮性卵巢癌患者血清miR-302b-3p水平與血清lncRNA SNHG16水平呈負相關(guān)關(guān)系（r=-0.678，P＜0.05）。見圖1。

圖1 上皮性卵巢癌患者血清miR-302b-3p水平與血清lncRNA SNHG16水平關(guān)系的散點圖

2.4 血清 miR-302b-3p、lncRNA SNHG16 水平對上皮性卵巢癌的診斷效能分析 血清miR-302b-3p 水平診斷上皮性卵巢癌的曲線下面積（AUC）為0.664（95%CI：0.571～0.749），最佳截斷值為1.50，此時其診斷上皮性卵巢癌的靈敏度為72.29%、特異度為67.65%；血清lncRNA SNHG16 水平診斷上皮性卵巢癌的AUC為0.742（95%CI：0.653～0.818），最佳截斷值為1.17，此時其診斷上皮性卵巢癌的靈敏度為75.90%、特異度為73.53%；血清CA125水平診斷上皮性卵巢癌的AUC為 0.579（95%CI：0.485～0.670），最佳截斷值為200 U/mL，此時其診斷上皮性卵巢癌的靈敏度為61.45%、特異度為58.82%；血清miR-302b-3p、lncRNA SNHG16 水平聯(lián)合診斷上皮 性 卵 巢 癌 的AUC為 0.898（95%CI：0.829～0.947），其診斷上皮性卵巢癌的靈敏度為90.36%、特異度為88.24%。血清lncRNA SNHG16 水平診斷上皮性卵巢癌的AUC高于血清CA125 水平（Z=3.121，P＜0.05），血 清 miR-302b-3p 水 平 與血 清CA125水平診斷上皮性卵巢癌的AUC比較差異無統(tǒng)計學意義（Z=1.670，P＞0.05）；血清 miR-302b-3p、lncRNA SNHG16 水平聯(lián)合診斷上皮性卵巢癌的AUC明顯高于血清 miR-302b-3p、lncRNA SNHG16單獨（Z分別為4.245、3.447，P均＜0.05）。見圖2。

圖2 血清miR-302b-3p、lncRNA SNHG16水平單獨或聯(lián)合診斷上皮性卵巢癌的ROC曲線

3 討論

卵巢癌是婦科惡性腫瘤中病死率最高的腫瘤，其最常見的病理類型為上皮性卵巢癌。近年來，細胞減滅術(shù)及后續(xù)以鉑類/紫杉烷為基礎(chǔ)的化療雖然能夠在一定程度上延長上皮性卵巢癌患者生存期，但復(fù)發(fā)和獲得性化療耐藥始終無法避免［7］。目前，臨床主要依靠血清腫瘤標志物CA125 以及盆腔超聲、CT 或MRI 等檢查輔助診斷上皮性卵巢癌，但靈敏度和特異度較低，且不能滿足早期診斷要求。因此，探索更靈敏、特異的生物標志物對上皮性卵巢癌的早期診斷至關(guān)重要［8］。

miRNA 是人體內(nèi)廣泛分布的內(nèi)源性非編碼RNA，能夠在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)幾乎所有發(fā)育途徑和生物學過程，在干細胞分化、細胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變期間發(fā)揮重要作用。miR-302b-3p是胚胎干細胞周期調(diào)節(jié)miRNA，屬于miR-302 基因簇，可調(diào)節(jié)染色質(zhì)狀態(tài)，調(diào)控細胞分化、凋亡及細胞周期，能夠提高胚胎干細胞活力，促使胚胎干細胞存活和自我更新［9］。近年有研究報道，miR-302b-3p 在胃癌組織中表達下調(diào)，并能通過抑制含有Rho 相關(guān)卷曲螺旋蛋白激酶2 表達，抑制腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移，并促進其凋亡［10］。miR-302b-3p 在結(jié)直腸癌中表達下調(diào)，轉(zhuǎn)染miR-302b-3p后可抑制腫瘤細胞侵襲并促進其凋亡［11］。在喉鱗狀細胞癌中，miR-302b-3p 可抑制胰島素樣生長因子1受體表達，進而抑制腫瘤進展［12］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-302b-3p在上皮性卵巢癌中亦表達下調(diào)，且其表達與腫瘤FIGO 分期、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)。結(jié)果表明，miR-302b-3p表達缺失與上皮性卵巢癌進展有關(guān)，miR-302b-3p在上皮性卵巢癌中可能發(fā)揮抑癌基因作用。

lncRNA 是一類長度超過200 個核苷酸的非編碼RNA。lncRNA表達失調(diào)會誘導(dǎo)基因異常表達，從而促進人類惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。SNHG16 是一種與腫瘤相關(guān)的lncRNA，能夠通過靶向調(diào)控miRNA發(fā)揮抑癌或致癌作用［13］。有研究報道，lncRNA SNHG16 在肝細胞癌中表達下調(diào)，并能夠通過靶向Hsa-miR-93 抑制肝癌細胞增殖［14］。在肺癌細胞中l(wèi)ncRNA SNHG16 表達上調(diào)，并通過與 miR-520 結(jié)合上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子表達，促進肺癌細胞遷移［15］。lncRNA SNHG16 在胃癌中表達上調(diào)，且通過下調(diào)Wnt 信號通路抑制劑Dickkopf-3 促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，增強胃癌細胞侵襲能力，促進胃癌進展［13］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，lncRNA SNHG16 在上皮性卵巢癌中表達上調(diào)，且其表達與腫瘤FIGO 分期、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)。結(jié)果表明，lncRNA SNHG16 在上皮性卵巢癌中可能發(fā)揮致癌基因作用，與 YANG 等［16］研究結(jié)果一致，SNHG16 可能通過激活蛋白激酶B 磷酸化，上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶9表達，促進卵巢癌細胞增殖、侵襲和遷移。

lncRNA 作為miRNA 的前體，可通過誘導(dǎo)染色質(zhì)修飾、調(diào)控信使RNA 或作為競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）與靶基因競爭性結(jié)合miRNA，參與核糖核酸甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑等，從而誘發(fā)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［17］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上皮性卵巢癌患者血清lncRNA SNHG16 水平與血清miR-302b-3p水平呈負相關(guān)關(guān)系，表明lncRNA SNHG16 可能通過負向調(diào)控miR-302b-3p 表達促使上皮性卵巢癌的發(fā)生 。 XU 等［18］研 究 報 道 ，lncRNA SNHG16 存 在miR-302b-3p 的靶向結(jié)合位點，可充當miR-302b-3p的分子海綿，從而調(diào)控miR-302b-3p 表達。王茜等［19］研究結(jié)果顯示，lncRNA SNHG16 能夠靶向結(jié)合miR-302b-3p，從而調(diào)控卵巢癌細胞增殖、侵襲和遷移。

本研究ROC 曲線分析顯示，血清miR-302b-3p、lncRNA SNHG16 水平診斷上皮性卵巢癌的AUC分別為0.664、0.742，靈敏度分別為72.29%、75.90%，特異度分別為67.65%、73.53%，提示血清miR-302b-3p、lncRNA SNHG16水平對上皮性卵巢癌均具有一定診斷價值。當血清miR-302b-3p、lncRNA SNHG16水平聯(lián)合時，其診斷上皮性卵巢癌的AUC達到0.898，靈敏度和特異度分別為90.36%、88.24%。結(jié)果表明，血清 miR-302b-3p、lncRNA SNHG16 水平聯(lián)合時能夠明顯提高對上皮性卵巢癌的診斷價值。

綜上所述，上皮性卵巢癌患者血清miR-302b-3p水平下調(diào)、血清lncRNA SNHG16水平上調(diào)，二者呈負相關(guān)關(guān)系并與腫瘤FIGO分期、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；血清miR-302b-3p、lncRNA SNHG16水平對上皮性卵巢癌均具有一定診斷價值，二者聯(lián)合時診斷價值更高。但本研究存在一定局限性，尚不能證實lncRNA SNHG16對miR-302b-3p的直接調(diào)控作用，今后仍需進一步研究證實。