薄殼山核桃油水酶法提取工藝優(yōu)化及品質(zhì)分析

王亞萍，姚小華，常 君，任華東，張成才

(中國林業(yè)科學(xué)研究院 亞熱帶林業(yè)研究所，杭州 311400)

薄殼山核桃(Caryaillinoensis(Wangenh.) K. Koch.)，又名美國山核桃、長山核桃，是胡桃科山核桃屬植物，原產(chǎn)于美國和墨西哥，是世界上重要的干果樹種之一，也是珍貴的干果和木本油料樹種[1]。薄殼山核桃殼薄易剝，出仁率高，果仁中富含油脂、蛋白質(zhì)、碳水化合物，還含有對人體有益的維生素和礦質(zhì)元素等[2]，具有較高的營養(yǎng)和保健價值。與我國的核桃(JuglansregiaL.)和山核桃(CaryacathayensisSary.)相比，薄殼山核桃具有明顯的易于機(jī)械剝殼取仁、果味純正、貯藏性好等優(yōu)點，其油脂是高檔優(yōu)質(zhì)的木本食用油[3]。目前，國內(nèi)對薄殼山核桃的研究主要集中在產(chǎn)地及其分布、生態(tài)要求、生物學(xué)特性、品種類型、繁殖培育、病蟲害防治、栽培技術(shù)、生長發(fā)育、遺傳多樣性、品種鑒定和化學(xué)成分等方面[4-5]。隨著薄殼山核桃產(chǎn)量的增大和人們營養(yǎng)保健意識的增強，有必要對薄殼山核桃油的加工及開發(fā)利用進(jìn)行研究。

水酶法提油具有條件溫和、無需經(jīng)高溫高壓及有機(jī)溶劑處理，能夠較完整地保留油脂固有的天然活性成分等特點，目前國內(nèi)已在核桃油[6-9]和山核桃油[10-12]提取方面有相關(guān)研究，但在薄殼山核桃油提取方面還鮮見報道。

本研究以薄殼山核桃仁為原料，采用水酶法提取薄殼山核桃油，在單因素試驗的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗優(yōu)化，探求水酶法提取薄殼山核桃油的最佳工藝條件，旨在更好地利用薄殼山核桃資源，開發(fā)具有高附加值的薄殼山核桃油產(chǎn)品，推動國內(nèi)水酶法提取薄殼山核桃油在生產(chǎn)中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

薄殼山核桃堅果，建德市敏捷家庭農(nóng)場有限公司。將薄殼山核桃堅果去殼，堅果仁(含油率為70.03%)用粉碎機(jī)粉碎為0.425 mm(40目)左右的顆粒。

蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、植物復(fù)合水解酶，諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司。4種酶制劑的特性見表1。

表1 4種酶制劑的特性

180E-Y耐歐小型粉碎機(jī)；R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、B-811索氏提取儀，瑞士布奇公司；BS-1F全溫度振蕩培養(yǎng)搖床；GC-2010 plus氣相色譜儀、UV-2550紫外分光光度計，日本島津公司；Agilent 1290高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；Avanti J-E高速冷凍離心機(jī)，德國貝克曼公司；ZYJ-9018家用榨油機(jī)。

1.2 試驗方法

1.2.1 水酶法提油

稱取5 g粉碎的薄殼山核桃仁，裝入50 mL離心管中，按一定料液比加入蒸餾水，調(diào)節(jié)pH，于90℃水浴中滅酶10 min，然后快速冷卻。加入一定量的酶制劑，混勻后于一定溫度搖床(轉(zhuǎn)速120 r/min)酶解一定時間，結(jié)束后于90℃水浴中滅酶10 min，冷卻，于10 000 r/min離心20 min，用移液槍小心吸取上層清油，離心管內(nèi)的殘油再用10 mL正己烷分3次溶解后傾出，傾出液合并，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑后與上層清油合并，稱重后于4℃冷藏備用。按下式計算油脂提取率(Y)。

Y=m1/(m0×C)×100%

(1)

式中：m1為清油質(zhì)量，g；m0為薄殼山核桃仁質(zhì)量,g；C為薄殼山核桃仁含油率。

1.2.2 溶劑浸提法提油

稱取20 g粉碎的薄殼山核桃仁，加入石油醚(沸程30～60℃)于50℃浸提8 h，在50℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去石油醚，得到薄殼山核桃油，于4℃冷藏備用。

1.2.3 壓榨法制油

稱取20 g薄殼山核桃仁放入榨油機(jī)，選擇冷榨模式，壓榨、過濾后用無水硫酸鈉脫水，得到薄殼山核桃油，于4℃冷藏備用。

1.2.4 測定方法

酸值測定采用GB 5009.229—2016方法，過氧化值測定采用GB 5009.227—2016方法，脂肪酸測定采用GB 5009.168—2016(第三法)，生育酚測定采用GB 5009.82—2016(第二法)，總酚測定采用LS/T 6119—2017，角鯊烯測定采用LS/T 6120—2017，β-谷甾醇測定采用NY/T 3111—2017。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016軟件進(jìn)行基礎(chǔ)數(shù)據(jù)處理、分析與作圖。采用SPSS 19.0作正交試驗并進(jìn)行顯著性及相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶制劑的篩選

設(shè)置加酶量分別為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，料液比為1∶4，纖維素酶、果膠酶、植物復(fù)合水解酶的酶解pH均為4.5，蛋白酶酶解pH為7.5，酶解溫度為50℃(水浴)，酶解時間為2.0 h。以山核桃油提取率為指標(biāo)，考察酶制劑的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 不同酶制劑對薄殼山核桃油提取率的影響

植物細(xì)胞的細(xì)胞壁主要由果膠和纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等多糖類物質(zhì)組成，其中嵌入一些功能性蛋白質(zhì)，油脂通常與其他大分子物質(zhì)(蛋白質(zhì)、碳水化合物等)結(jié)合構(gòu)成脂多糖、脂蛋白等復(fù)合體。因此，采用酶解工藝可以快速有效地瓦解細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，促使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來[13]。由圖1可見，與纖維素酶、果膠酶和植物復(fù)合水解酶3種酶制劑相比，蛋白酶的酶解效果最好，薄殼山核桃油提取率最高，這可能是由于在提取過程中蛋白酶酶解了細(xì)胞中包被在油脂周圍的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)膜，使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)瓦解，從而促進(jìn)了油脂從脂質(zhì)體中釋放出來[14]。因此，選擇蛋白酶進(jìn)行后續(xù)的酶解工藝優(yōu)化。

2.2 蛋白酶酶解工藝的優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗

2.2.1.1 料液比

理論上，加水量越大油脂提取率越高[15]，適宜的料液比可以使溶液具有較好的流動性，有利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行，從而有效提高油脂的提取率。設(shè)置料液比分別為1∶3、1∶4、1∶5、1∶6，在酶解pH 7.5、加酶量2.0%、酶解溫度50℃、酶解時間2.0 h條件下，考察料液比對薄殼山核桃油提取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 料液比對薄殼山核桃油提取率的影響

由圖2可見，當(dāng)料液比從1∶3增加到1∶4時，提取率從61.37%提高到63.49%，此后隨著料液比的繼續(xù)增大，提取率呈顯著下降趨勢(P<0.05)。這是由于酶解體系中溶劑(水)的量過低時，酶解液黏稠，不利于酶與底物的充分接觸，使得酶解反應(yīng)不徹底，不利于油脂分子充分遷移出來；溶劑(水)的量過高時，酶解液的濃度降低，酶與底物分子的碰撞概率降低，酶解反應(yīng)的效率也隨之降低[16]。因此，選擇料液比為1∶4。

2.2.1.2 加酶量

加酶量會影響酶與底物的接觸概率，進(jìn)而影響酶促反應(yīng)效率，其是影響油脂提取率的重要因素之一。設(shè)置加酶量分別為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，在料液比1∶4、酶解溫度50℃、酶解時間2.0 h、酶解pH 7.5條件下，考察加酶量對薄殼山核桃油提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 加酶量對薄殼山核桃油提取率的影響

由圖3可見，在加酶量1.0%時提取率為67.59%，此后隨加酶量的增加，酶解體系中的酶濃度增大，酶與底物的接觸概率增大，促進(jìn)酶解反應(yīng)的進(jìn)行，進(jìn)而增加油脂的提取率[17]。當(dāng)加酶量增大到2.0%時，薄殼山核桃油提取率達(dá)到最大值(70.83%)，當(dāng)加酶量繼續(xù)增加時，提取率開始下降。這是由于底物的量有限，繼續(xù)增大加酶量，過量的酶會附著在薄殼山核桃仁表面，影響了油脂的釋放；同時，加酶量過多也易使酶解體系發(fā)生深度水解，水解產(chǎn)物增強蛋白質(zhì)的乳化性，使油脂分子再度被蛋白質(zhì)包裹，產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，增加了油脂的分離難度；另外，加酶量過多會使酶分子間產(chǎn)生競爭作用，降低了酶的作用效率，致使薄殼山核桃油提取率降低[18]。因此，選擇加酶量為2.0%。

2.2.1.3 酶解時間

一般來說，酶解時間越長，物料細(xì)胞的降解程度越大，油脂提取率越高，但酶解時間過長也可能使體系中乳狀液趨于穩(wěn)定，造成破乳困難。設(shè)置酶解時間分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，在料液比1∶4、酶解pH 7.5、加酶量2.0%、酶解溫度50℃條件下，考察酶解時間對薄殼山核桃油提取率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 酶解時間對薄殼山核桃油提取率的影響

由圖4可見，酶解時間為1.0 h時，提取率為65.61%，1.5 h時提取率稍有下降(64.31%)但不顯著(P>0.05)，當(dāng)酶解時間延長至2.0 h時，提取率達(dá)到峰值(69.87%)，此后隨著酶解時間的繼續(xù)延長提取率稍微下降。這可能是由于底物的量和酶的總量有限，反應(yīng)完全后停止酶解，持續(xù)延長時間不會增加提取效率還可能會加重油脂乳化現(xiàn)象[19]，從而導(dǎo)致提取率在酶解2.0 h后有所下降。且酶解時間過長，易使油脂發(fā)生氧化導(dǎo)致油脂品質(zhì)下降[20]。因此，選擇酶解時間為2.0 h。

2.2.1.4 酶解溫度

酶解溫度過高或過低都不利于油脂的提取，升高溫度能夠提高反應(yīng)體系的活化能進(jìn)而提高反應(yīng)速率，但過高的溫度又會使酶失活，因此適當(dāng)?shù)拿附鉁囟仁种匾猍21]。設(shè)置酶解溫度分別為40、45、50、55、60℃，在料液比1∶4、酶解pH 7.5、加酶量2.0%、酶解時間2.0 h條件下，考察酶解溫度對薄殼山核桃油提取率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 酶解溫度對薄殼山核桃油提取率的影響

由圖5可見，隨酶解溫度升高，提取率先增大后降低，在55℃時提取率達(dá)到最大，為66.50%。這是由于隨溫度升高酶解反應(yīng)的速率增大，相同反應(yīng)時間內(nèi)細(xì)胞壁裂解程度加大，有利于油脂從細(xì)胞中釋放出來；同時，酶解體系溫度升高可以增大分子擴(kuò)散系數(shù)，降低溶劑及油脂的黏度，加快油脂分子的擴(kuò)散速度[22]；過高的溫度超過了蛋白酶的最適溫度，酶活力降低，酶解反應(yīng)速度降低，從而導(dǎo)致提取率下降。因此，選擇酶解溫度為55℃。

2.2.1.5 酶解pH

酶解pH既影響酶的活性，又影響油脂的提取和分離。設(shè)置酶解pH分別為5、6、7、8、9，在料液比1∶4、加酶量2.0%、酶解溫度50℃、酶解時間2.0 h條件下，考察酶解pH對薄殼山核桃油提取率的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 酶解pH對薄殼山核桃油提取率的影響

由圖6可見，酶解pH由5增大到7時，提取率逐漸下降，但變化不顯著(P>0.05)，當(dāng)酶解pH增至8時，提取率最高。這可能是因為過高或過低的pH均會影響酶的空間構(gòu)象，從而影響酶的活力，當(dāng)酶解體系的pH逐漸接近蛋白酶的最適pH時，蛋白酶活力升高，酶反應(yīng)速度加快[23]；而當(dāng)酶解pH大于8時，蛋白酶活力下降，同時pH過高時溶液的乳化程度提高，導(dǎo)致提取率下降[24]。因此，選擇酶解pH為8。

2.2.2 正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以蛋白酶為酶制劑，選取料液比、加酶量、酶解溫度、酶解時間和酶解pH為因素，以薄殼山核桃油提取率為指標(biāo)，進(jìn)行五因素四水平正交試驗，優(yōu)化水酶法提取薄殼山核桃油的工藝條件。正交試驗因素水平、正交試驗設(shè)計和結(jié)果分別見表2和表3。

表2 正交試驗因素水平

表3 正交試驗設(shè)計和結(jié)果

續(xù)表3

由表3可知，5個因素對薄殼山核桃油提取率影響的主次順序為加酶量>酶解pH>酶解溫度>酶解時間>料液比，即加酶量對薄殼山核桃油提取率的影響最大，酶解pH和酶解溫度次之，料液比的影響最小。薄殼山核桃油的最佳提取條件為A2B3C3D2E4，即料液比1∶4、加酶量2.5%、酶解溫度55℃、酶解時間2.0 h、酶解pH 8。在最佳條件下進(jìn)行驗證試驗，薄殼山核桃油提取率達(dá)到68.44%。

2.3 制油方法對薄殼山核桃油品質(zhì)的影響

2.3.1 薄殼山核桃油的酸值、過氧化值及脂肪酸組成(見表4)

由表4可知，薄殼山核桃油中主要含有7種脂肪酸，分別是棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、α-亞麻酸、花生酸和順-11-二十碳烯酸，其中不飽和脂肪酸含量高達(dá)90%以上，且以油酸和亞油酸為主，油酸含量最高，達(dá)70%以上，亞油酸含量在15%以上。對比3種制油方法，水酶法制取的薄殼山核桃油中油酸含量最高，為73.82%，顯著高于溶劑浸提法和壓榨法(P<0.05)。3種制油方法中，水酶法制取的薄殼山核桃油過氧化值和酸值最低，與溶劑浸提法和壓榨法相比，過氧化值分別降低了62.5%和25.0%，酸值分別降低了14.3%和42.5%?？梢?，水酶法更有利于保持薄殼山核桃油的品質(zhì)。

表4 不同方法制取的薄殼山核桃油的酸值、過氧化值、脂肪酸組成及含量

2.3.2 薄殼山核桃油中的活性物質(zhì)(見表5)

表5 不同方法制取的薄殼山核桃油中的活性物質(zhì)及含量

由表5可見，薄殼山核桃油中含有α-生育酚和γ-生育酚，且以γ-生育酚為主。3種方法制取的薄殼山核桃油中γ-生育酚含量呈現(xiàn)極顯著差異(P<0.01)，以水酶法的最高，達(dá)21.00 mg/100 g；此外，水酶法制取的薄殼山核桃油中的總酚、角鯊烯和β-谷甾醇含量均極顯著高于其他兩種方法(P<0.01)。

對不同方法制取的薄殼山核桃油的過氧化值、酸值、主要脂肪酸與其活性物質(zhì)進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果如表6所示。

表6 薄殼山核桃油的過氧化值、酸值、主要脂肪酸與其活性物質(zhì)的相關(guān)性

由表6可以看出：薄殼山核桃油的過氧化值與生育酚和β-谷甾醇含量存在極顯著的負(fù)相關(guān)，與總酚含量存在顯著的負(fù)相關(guān)；酸值與油酸、角鯊烯含量存在顯著的負(fù)相關(guān)，說明油脂中較高含量的生育酚、總酚、β-谷甾醇、角鯊烯和油酸更有利于油脂品質(zhì)的保持。因此，水酶法制取的薄殼山核桃油中較高的生育酚、總酚、β-谷甾醇、角鯊烯和油酸含量，使得薄殼山核桃油具有較高的抗氧化性。

3 結(jié) 論

(1)蛋白酶可作為水酶法提取薄殼山核桃油的適宜酶制劑。薄殼山核桃油的最佳提取工藝條件為：料液比1∶4，加酶量2.5%，酶解溫度55℃，酶解時間2.0 h，酶解pH 8。在最佳提取工藝條件下，薄殼山核桃油提取率為68.44%。

(2)薄殼山核桃油中含有棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、α-亞麻酸、花生酸和順-11-二十碳烯酸7種主要脂肪酸，其中不飽和脂肪酸含量高達(dá)90%以上，且以油酸和亞油酸為主，油酸含量高達(dá)70%以上，亞油酸含量在15%以上，是一種優(yōu)質(zhì)木本食用油。

(3)與傳統(tǒng)制油方法相比，水酶法制取的薄殼山核桃油中生育酚、總酚、β-谷甾醇和角鯊烯含量較高，水酶法是一種較為理想的油脂提取方法。