植物甾醇對脂多糖誘導小鼠炎癥的抑制作用

趙云博， 王寧靜， 胡永員， 牛永潔， 孟永宏

(1.陜西海斯夫生物工程有限公司，陜西 楊凌 712199； 2.陜西師范大學 食品工程與營養(yǎng)科學學院，西安 710119)

隨著我國居民對肉制品日益增長的需求，我國的養(yǎng)殖規(guī)模也在不斷擴大，但是如果養(yǎng)殖環(huán)境差、技術水平低，易引發(fā)飼養(yǎng)的動物炎癥。飼養(yǎng)動物發(fā)生炎癥，不僅造成其能量損失[1]，而且會引發(fā)大規(guī)模傳染，增加飼養(yǎng)動物病死率，養(yǎng)殖場經(jīng)濟效益受影響。同時，患病動物也會對國民健康造成危害。因此，篩選有效抗炎的天然成分以抑制飼養(yǎng)動物炎癥已成為養(yǎng)殖行業(yè)的重要課題[2-4]。

植物甾醇(Phytosterol，PS)是天然類固醇化合物，主要來源于植物油、植物種子和豆類產(chǎn)品[5-6]?！讹暳咸砑觿┢贩N目錄(2013)》中植物甾醇可作為飼料添加劑使用。近年來國內(nèi)外對天然成分植物甾醇的體外抗炎功效做了大量研究，如：Caroprese等[2]研究揭示了植物甾醇對體外免疫調節(jié)和抗炎活性的有益作用；Vilahur[3]、Fraile[7]等分別在綿羊和豬的體外研究中發(fā)現(xiàn)，植物甾醇可以增加外周血單個核細胞(PBMC)的數(shù)量，從而提升動物抗炎活性；于學珍等[8]研究發(fā)現(xiàn)，植物甾醇凝膠對小鼠燒傷部位有抗炎作用，可減小潰瘍面積，減少炎癥細胞滲出。但上述研究主要在細胞水平上證實植物甾醇的抗炎作用，并且側重于研究植物甾醇的治療作用，而植物甾醇在生物體水平的預防炎癥效果和作用機制依然缺乏。

本研究利用脂多糖誘導小鼠發(fā)生炎癥，研究植物甾醇對小鼠血清炎癥因子，肝臟、脾臟組織病理學損傷，免疫組化，促炎癥細胞因子轉錄及通路蛋白表達的影響，揭示植物甾醇抗炎作用機制，為以植物甾醇為原料開發(fā)新型抗炎產(chǎn)品提供科學依據(jù)，并以期通過天然抗炎成分植物甾醇的推廣使用，提高養(yǎng)殖業(yè)利潤，保障國民健康。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

雄性SPF級KM小鼠，西安交通大學動物實驗中心(許可證號SYXK(陜)2020-005)；小鼠顆粒型日糧維持飼料，河南天馳實驗動物飼料廠；植物甾醇(純度≥95%)，陜西海斯夫生物工程有限公司；脂多糖(LPS)、地塞米松(DXMS)、RIPA裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF)以及白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的ELISA試劑盒，北京索萊寶公司；蘇木精-伊紅(HE)染液，武漢賽維爾生物科技有限公司；Trizol，Invitrogen公司；HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)試劑盒、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒，南京諾唯贊生物科技有限公司；一氧化氮合酶(iNOS)抗體，Bioss公司；β-肌動蛋白(β-actin)、NF-κB p65蛋白、NF-κB 磷酸化p65(Pp65)蛋白、辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，Abcam公司；BCA蛋白定量試劑盒、Tunel染色試劑盒，碧云天生物技術有限公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜，Merck Millipore公司。

Thermo1500全波長酶標儀，Sigma高速離心機，BioRad ELITE300電泳儀，Light Cycler Nano 熒光定量PCR儀，TANON 5200MULTI顯影儀，DMi8AUTOL MATED倒置顯微鏡，Veriti 96 Well 梯度PCR儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組及處理

將50只體重為(22±2)g的雄性SPF級KM小鼠平均分成5組，分別記為空白對照組、脂多糖對照組、植物甾醇低劑量組、植物甾醇高劑量組、地塞米松組。實驗期間小鼠自由攝食及飲水，3～4只/籠分籠飼養(yǎng)于SPF級飼養(yǎng)環(huán)境，室溫(20±2)℃，相對濕度40%～70%，每日明暗比12 h/12 h。適應性飼喂5 d，然后進行灌胃給藥，其中：空白對照組與脂多糖對照組灌胃0.5 mL 4%吐溫80溶液；植物甾醇低、高劑量組分別灌胃0.5 mL植物甾醇4%吐溫80溶液，使最終的植物甾醇灌胃劑量分別達到20、200 mg/kg；地塞米松組灌胃0.5 mL地塞米松4%吐溫80溶液，對應地塞米松灌胃劑量為5 mg/kg。每日灌胃1次，連續(xù)7 d，最后1 d斷水斷糧，于最后一次灌胃1 h后，空白對照組腹腔注射生理鹽水0.5 mL，其余4組注射0.5 mL質量濃度為0.2 mg/mL的脂多糖。脂多糖處理6 h后，觀察小鼠狀態(tài)，待確認小鼠建模成功后，采血后處死小鼠并進行解剖，采集脾臟、肝臟，稱重，計算肝臟指數(shù)；5組各選1例制作石蠟切片，用于組織病理學和免疫組化分析；剩余保存于-80℃，用于目的基因mRNA轉錄和目的蛋白表達分析。

1.2.2 ELISA試劑盒檢測血清中相關炎癥因子

將血漿離心后得到血清，按照ELISA試劑盒說明書進行炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α檢測。

1.2.3 HE染色法觀察肝臟、脾臟組織病理學

將肝臟和脾臟部分制作石蠟切片后進行HE染色，在顯微鏡下觀察肝臟和脾臟組織的病理學變化。

1.2.4 免疫組化法檢測肝臟及脾臟的iNOS表達

參考繆?？〉萚9]的方法對石蠟切片進行染色和處理，采用Olym-pusDP-71圖像分析系統(tǒng)進行觀察、拍照，其中陽性表達呈棕黃色，每張切片從(400×)的視野中隨機取樣5次，采用Image-ProPlus軟件計算分析每個視野中iNOS陽性細胞表達的平均光密度值。

1.2.5 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測肝臟及脾臟中iNOS和SHP-1的mRNA轉錄

參考Rizzi等[10]的方法，iNOS、SHP-1和β-actin引物用Primer Premier 5.0軟件進行設計，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其中iNOS引物序列(參考基因序列號NC_000077.7)、SHP-1引物序列(參考基因序列號NM_013545.3)見表1。以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的mRNA轉錄水平。

表1 iNOS、SHP-1和β-actin基因引物序列

1.2.6 蛋白質免疫印跡法(Western Blot)檢測肝臟中NF-κB p65蛋白和磷酸化p65蛋白的表達

參考丁程程等[11]的方法，將孵育至PVDF膜上的蛋白顯色后，使用成像設備掃描蛋白條帶并用Image lab軟件對條帶灰度進行分析，目的蛋白以β-actin為內(nèi)參進行校正。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

實驗數(shù)據(jù)表示為“平均值±標準差”，使用SPSS 17.0中的單因素方差分析進行數(shù)據(jù)分析，組間比較采用LSD法檢驗，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，用Graphpad Prism5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 植物甾醇對小鼠體重與肝臟指數(shù)的影響(見表2)

表2 植物甾醇對小鼠體重與肝臟指數(shù)的影響

脂多糖是研究由細菌感染引起炎癥反應的理想模型[12]，常用作甾體藥物抗炎實驗的致炎因子。地塞米松是常用的抗炎類甾體藥物，與植物甾醇結構類似[13]。經(jīng)脂多糖造模6 h后，可觀察到脂多糖對照組小鼠精神狀態(tài)變?nèi)?，聚堆抱團，而空白對照組與其他各處理組小鼠精神狀態(tài)良好，具有良好活力，說明造模成功。由表2可知，脂多糖對照組小鼠肝臟指數(shù)相較空白對照組增加了4.66%，與脂多糖對照組相比，經(jīng)過預飼喂植物甾醇小鼠肝臟指數(shù)降低(差異不顯著，P>0.05)，且相比于植物甾醇低劑量組，植物甾醇高劑量組肝臟指數(shù)降低更多，證明炎癥有所減輕，而地塞米松組小鼠肝臟指數(shù)相比其他組顯著升高，可能與飼喂地塞米松顯著降低了小鼠的體重有關。

2.2 植物甾醇對小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的影響(見表3)

表3 植物甾醇對小鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α含量的影響 ng/L

炎癥的發(fā)生和促進主要由免疫細胞驅動[14]，所以由免疫細胞產(chǎn)生的相關炎癥因子可以反映炎癥的嚴重程度。IL-1β、IL-6、TNF-α參與了炎癥相關疾病的發(fā)病機制，是炎癥反應的關鍵靶點和抗炎指標[15]。由表3可以看出：與空白對照組比較，脂多糖對照組小鼠血清中的炎癥因子含量極顯著升高(P<0.01)；與脂多糖對照組相比，植物甾醇低、高劑量組小鼠炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α含量顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)降低，且高劑量組降低更多，相比于脂多糖對照組分別降低了54.75%、60.12%、63.50%，說明植物甾醇可有效降低炎癥的損害程度。

2.3 植物甾醇對小鼠肝臟、脾臟組織形態(tài)的影響

圖1為小鼠肝臟、脾臟組織病理學觀察結果。

注：A.空白對照組；B.脂多糖對照組；C.植物甾醇低劑量組；D.植物甾醇高劑量組；E.地塞米松組。下同

由圖1可知：空白對照組小鼠的肝臟組織、肝血竇及中央靜脈細胞無明顯形態(tài)改變，肝細胞輪廓清晰；經(jīng)脂多糖誘導，小鼠肝細胞腫脹且部分細胞核染色加深；植物甾醇低、高劑量組與地塞米松組小鼠的腫脹肝細胞數(shù)目明顯減少，肝細胞細胞核邊界明顯。脾臟組織病理學觀察顯示，空白對照組小鼠脾臟組織無明顯病理學變化，脂多糖誘導后小鼠脾臟白髓異常增生，生發(fā)中心出現(xiàn)，植物甾醇低劑量組小鼠依然可見白髓和生發(fā)中心，但相比脂多糖對照組有所改善，植物甾醇高劑量組和地塞米松組小鼠白髓增生明顯減輕，接近空白對照組。病理學觀察結果顯示飼喂植物甾醇后可以有效抑制炎癥導致的小鼠內(nèi)臟損傷。

2.4 植物甾醇對小鼠肝臟、脾臟中iNOS表達的影響(見表4、圖2)

表4 植物甾醇對小鼠肝臟、脾臟中iNOS 基因mRNA轉錄水平、平均光密度值的影響

圖2 小鼠肝臟、脾臟iNOS基因分布(400×)

在正常生理條件下，iNOS一般不表達或低表達，但是發(fā)生炎癥后會在巨噬細胞和白細胞中分泌[16]。鄭海崇等[17]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠肺部發(fā)生炎癥感染時，可以通過抑制iNOS表達來抑制炎癥因子的分泌。因此，組織內(nèi)的iNOS可以反映炎癥的發(fā)生情況。

由表4可知：植物甾醇對經(jīng)脂多糖誘導的小鼠的肝臟和脾臟中iNOS基因的mRNA轉錄水平有一定的抑制作用，且植物甾醇高劑量組的抑制效果更好；相較于脂多糖對照組，植物甾醇高劑量組小鼠的肝臟和脾臟中iNOS轉錄水平極顯著降低(P<0.01)，分別降低了39.85%、56.05%。由圖2可以看出，5組小鼠肝臟細胞中出現(xiàn)了不同程度的iNOS陽性染色，主要出現(xiàn)在肝血竇，破裂的細胞周邊區(qū)域也有少量。脾臟組織的白髓區(qū)有較為明顯的陽性信號出現(xiàn)，脾臟血管中也有部分陽性信號，植物甾醇高劑量組與地塞米松組iNOS陽性信號相對降低。相比于脂多糖對照組，植物甾醇低、高劑量組小鼠肝臟和脾臟iNOS平均光密度值極顯著降低(P<0.01)，且高劑量組降低更多，較脂多糖對照組分別降低了70.62%、48.70%，鏡下可明顯觀察到植物甾醇處理對炎癥的減輕有明顯效果。

2.5 植物甾醇對小鼠NF-κB p65蛋白和磷酸化p65蛋白水平的影響(見表5、圖3)

表5 小鼠肝臟中NF-κB p65蛋白和Pp65蛋白水平 ng/L

圖3 小鼠肝臟中NF-κB p65蛋白和Pp65蛋白的表達

NF-κB幾乎存在于所有動物中，當受到外界刺激時NF-κB與其抑制蛋白IκB分離并磷酸化產(chǎn)生活性，是體內(nèi)免疫應答的關鍵一環(huán)[18]。iNOS是NF-κB信號轉導中的轉導分子[19]。因此，NF-κB p65蛋白和磷酸化p65(Pp65)蛋白的表達情況可以反映小鼠炎癥的程度。由表5可知，與空白對照組相比，脂多糖對照組小鼠的p65蛋白及Pp65蛋白水平極顯著升高(P<0.01)，分別升高180.6%和94.6%。與脂多糖對照組相比，植物甾醇低、高劑量組小鼠肝臟組織中p65蛋白及Pp65蛋白水平顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)降低，證明炎癥發(fā)展程度更低，圖3也直觀地證明了該結論。

2.6 植物甾醇對小鼠肝臟、脾臟SHP-1基因mRNA轉錄水平的影響(見表6)

SHP-1是許多信號通路中必不可少的調節(jié)分子，免疫反應過程中其功能涉及先天免疫和適應性免疫，可以抑制NF-κB等因子的活化，在抗炎癥方面發(fā)揮了重要作用[20-21]。由表6可以看出，與脂多糖對照組相比，植物甾醇低、高劑量組小鼠肝臟、脾臟SHP-1基因轉錄水平極顯著升高(P<0.01)，且高劑量組與空白對照組相比無顯著差異，表明植物甾醇可以顯著提高小鼠的抗炎能力，控制炎癥發(fā)展。

表6 在小鼠肝臟、脾臟中SHP-1基因的轉錄水平

2.7 討論

Gupta等[22]首次發(fā)現(xiàn)天然活性物質植物甾醇的抗炎能力后，其他科研人員在細胞水平上做了很多驗證。通過分析已有文獻發(fā)現(xiàn)，植物甾醇的生物活性都是基于植物甾醇與膽固醇競爭抑制進入機體后發(fā)生的，其主要抗炎機制在于抑制NF-κB p65蛋白及其磷酸化，其原因是攝入植物甾醇后，提升了法尼醇X受體(FXR)/SHP-1合成膽汁酸通路的表達水平[23]，其中SHP-1又可作為NF-κB的上游負調控因子，因此結合本文研究結果推測，SHP-1的升高抑制NF-κB激活，進而降低iNOS表達水平，抑制下游炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的生成，從而降低炎癥對機體器官的損害，對炎癥發(fā)生起到預防作用。

相比于白藜蘆醇、大蒜素、牛磺酸和百里香酚等具有抑制炎癥作用的天然活性物質，植物甾醇具有更加全面的生理功能。白藜蘆醇通過抑制MAPK蛋白激酶減輕炎癥對肝臟的損傷[24]。大蒜素通過提高巨噬細胞的吞噬功能，抑制 IL-6的分泌發(fā)揮抗炎作用[25]。牛磺酸主要通過內(nèi)皮依賴性和非依賴性機制誘導血管擴張，減少炎癥對內(nèi)皮損傷[26]。百里香酚的主要作用器官多為乳腺、子宮等雌性特有器官[27-28]。本研究發(fā)現(xiàn)植物甾醇不僅抗炎效果顯著，前期實驗發(fā)現(xiàn)其還具有良好的促進生長效果，機制明確，有更廣泛的應用范圍。

3 結 論

研究了植物甾醇對脂多糖誘導小鼠炎癥的抑制作用。結果表明，植物甾醇可提高飼養(yǎng)小鼠的抗炎能力，通過抑制炎癥發(fā)展降低炎癥導致的器官損傷，可在我國養(yǎng)殖行業(yè)全面替代抗生素方面發(fā)揮重要作用。