納布啡通過激活MAPK/ERK信號通路減輕心肌缺血再灌注大鼠心臟損傷*

李 濤， 袁振武， 王義鳳， 吳 儀

（荊門市第一人民醫(yī)院麻醉科，湖北 荊門 448001）

心肌缺血再灌注（myocardial ischemia-reperfusion，MIR）損傷是指缺血心肌由于冠狀動脈血流恢復(fù)導(dǎo)致的較缺血時更為嚴(yán)重的損傷，常發(fā)生在溶栓、皮冠狀動脈介入術(shù)和心臟外科手術(shù)治療過程中，影響治療效果，威脅患者生命安全［1］。MIR損傷的發(fā)生率很高，卻缺乏有效的治療策略，因此，在手術(shù)中減輕損傷具有重要意義。

心肌缺血時，缺氧同步發(fā)生，機(jī)體對氧自由基的清除能力不足，而再灌注恢復(fù)血供時，大量富氧血流在短期內(nèi)快速進(jìn)入缺血區(qū)域，生成氧化自由基等較多有細(xì)胞毒性的物質(zhì)，造成細(xì)胞損傷、壞死或凋亡［2-3］。減少氧自由基的形成有利于減少細(xì)胞凋亡［4］，減輕心肌損傷，改善心肌功能［5］。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信號通路可響應(yīng)炎癥、細(xì)胞因子、氧自由基等刺激而被激活，介導(dǎo)有絲分裂、抗凋亡、增殖、抗氧化等信號，是細(xì)胞應(yīng)對環(huán)境刺激的重要信號通路［6］。研究顯示，通過激活MAPK/ERK 信號通路調(diào)控氧化應(yīng)激可減輕心肌細(xì)胞凋亡［7］及MIR損傷［8］。

納布啡（nalbuphine，NAL）是一種阿片類受體激動/拮抗劑，主要通過激活脊髓中的κ 受體和脊髓上端κ3 受體發(fā)揮緩解劇烈疼痛的作用，也可部分拮抗μ 受體，被廣泛應(yīng)用于燒傷、手術(shù)、心肌梗死、心絞痛等疼痛的緩解［9］。研究表明，NAL 對MIR 大鼠的鎮(zhèn)痛效果好，安全性高，且對心功能具有一定保護(hù)作用［9］。另外，在不同MIR 損傷模型中，多種麻醉藥物均可通過激活MAPK/ERK 信號通路發(fā)揮對MIR損傷的保護(hù)作用［10-11］。本實驗擬建立MIR大鼠模型，進(jìn)一步探討NAL 對氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和MAPK/ERK 信號通路的影響，以明確其作用機(jī)制。

材料和方法

1 動物

40 只SPF 級雄性SD 大鼠，體重200～230 g，購自北京維通利華公司，許可證號：SCXK（京）-2016-0011。實驗過程中分籠飼養(yǎng)于濕度（50±5）%、溫度（22.0±0.5）℃、光照/黑暗周期12 h/12 h 的動物房中，自由攝水?dāng)z食。

2 主要試劑和儀器

鹽酸NAL 注射液購自江蘇紫龍藥業(yè)公司；MAPK 激酶1/2（MAPK kinase 1/2，MEK1/2）抑制劑PD98059 購自MCE；2，3，5-三苯基氯化四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）購自Sigma；抗Raf、p-Raf、MEK1/2、p-MEK1/2、ERK1/2、p-ERK1/2、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3 和GAPDH 抗體，以及羊抗兔和羊抗小鼠IgG 抗體購自Abcam；HE 染色試劑盒，大鼠肌酸激酶（creatine kinase，CK）、心肌鈣蛋白T（cardiac troponin T，cTnT）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）ELISA 試劑盒，丙二醛（malondialdehyde，MDA）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）比色法檢測試劑盒，以及TUNEL 原位凋亡試劑盒購自上海生工；活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒（DCFH-DA 探針檢測）和總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）檢測試劑盒購自上海碧云天。

心電圖機(jī)購自湖南百眾公司；小動物呼吸機(jī)購自上海奧爾科特公司；光學(xué)及熒光顯微鏡購自Leica；電泳相關(guān)儀器購自Bio-Rad等。

3 主要方法

3.1 MIR 模型建立 術(shù)前12 h 禁食不禁水。經(jīng)腹腔注射1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后，行氣管插管連接小動物呼吸機(jī)。參照文獻(xiàn)［12］，經(jīng)左胸行開胸手術(shù)，暴露第3、4 肋骨之間的心臟，在冠狀動脈左前降支近心端下穿線并系活結(jié)以造成心肌缺血，可觀察到左心室前壁顏色變白。30 min 后先腹腔注射相應(yīng)藥物，之后打開活結(jié)恢復(fù)動脈血流（即再灌注），逐層縫合大鼠胸部并連接心電圖機(jī)，假手術(shù)（sham）組穿線但不結(jié)扎。

3.2 動物分組及給藥 隨機(jī)數(shù)字法將大鼠分為sham 組、MIR 組、NAL組和NAL+PD98059組，每組10只。NAL 組在系活結(jié)30 min 后給予2.5 mg/kg NAL腹腔注射［9］；NAL+PD98059 組在給予NAL 前先腹腔注射10 mg/kg PD98059［10］；sham 組和MIR 組給予同體積生理鹽水。

3.3 心肌梗死面積測定 再灌注120 min 后，各組隨機(jī)取5 只大鼠，經(jīng)頸靜脈注射預(yù)冷的1% TTC 溶液，10 min 后處死并分離心臟，從心臟基部向心尖方向逐層切為1 mm 厚的切片，置于預(yù)冷4%多聚甲醛中固定6 h，拍照后采用ImageJ 軟件分析測量各切片梗死面積。梗死面積百分比（%）=白色梗死區(qū)域面積/切片總面積×100%。

3.4 樣本采集 再灌注120 min 后，剩余大鼠均經(jīng)腹主動脈取血，4 ℃離心獲取血清；立即處死分離心臟，取梗死區(qū)域周圍心肌組織，部分置于-80 ℃，部分置于4%多聚甲醛，常規(guī)制備5 μm 厚的心肌石蠟切片。

3.5 HE 染色 心肌切片經(jīng)二甲苯脫蠟，乙醇脫水，蘇木素溶液、伊紅溶液染色，乙醇再次脫水，封片后光鏡下觀察各組心肌病理變化。

3.6 血清CK、cTnT 及LDH 水平測定 采用大鼠CK、cTnT 和LDH ELISA 試劑盒，按照說明書分別測定血清CK、cTnT及LDH水平。

3.7 心肌MDA、SOD、ROS 及T-AOC 水平測定 取-80 ℃中的梗死心肌周圍組織制為勻漿液，4 ℃離心取上清，定量后分別采用MDA 和SOD 比色法檢測試劑盒、ROS 檢測試劑盒及T-AOC 檢測試劑盒，按照說明書測定MDA、SOD、ROS及T-AOC水平。

3.8 TUNEL 染色 心肌切片經(jīng)脫蠟至水，蛋白酶K消化，H2O2反應(yīng)，TBS 洗滌后，依次逐步加入TUNEL試劑盒中各項試劑，用DAPI 復(fù)染細(xì)胞核，用抗熒光淬滅液封片，熒光顯微鏡拍照并用ImageJ 軟件分析細(xì)胞凋亡比例。凋亡率（%）=凋亡細(xì)胞TUNEL+數(shù)量/總細(xì)胞DAPI+數(shù)量×100%。

3.9 Western blot 檢測 將-80 ℃中的梗死心肌周圍組織制為勻漿液，經(jīng)RIPA 裂解液裂解后4 ℃離心提取總蛋白。定量后取20 μg蛋白煮沸上樣，電泳分離后切膠，電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封膜1 h，Ⅰ抗（p-Raf、Raf、p-MEK1/2、MEK1/2、p-ERK1/2、ERK1/2、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3 和GAPDH）稀釋液與膜孵育，4 ℃過夜，Ⅱ抗與膜室溫孵育1.5 h，ECL 發(fā)光液與膜室溫孵育5 min 后，在蛋白凝膠成像儀上拍照并行灰度分析。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）描述實驗數(shù)據(jù)。以單因素方差分析行多組間比較，以SNK-q檢驗行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 NAL對心肌梗死面積的影響

TTC 染色結(jié)果顯示，sham 組心肌未見梗死區(qū)域，MIR 組心肌梗死面積為（35.75±4.29）%；NAL 組心肌梗死面積為（14.54±2.15）%，較MIR 組顯著減?。≒＜0.05）；NAL+PD98059 組 心 肌 梗 死 面 積 為（27.54±3.12）%，較NAL 組 顯 著 增 大（P＜0.05），見圖1。

Figure 1. Myocardial infarction in the 4 groups（TTC staining）.圖1 4組心肌梗死情況

2 NAL對MIR大鼠心肌組織形態(tài)的影響

HE染色結(jié)果顯示，sham 組心肌纖維排列規(guī)則有序，心肌細(xì)胞胞膜、胞核完整，細(xì)胞質(zhì)染色均勻；MIR組心肌纖維排列不規(guī)則且有斷裂，部分心肌細(xì)胞可見核皺縮變形，局部有炎癥細(xì)胞浸潤；NAL 組上述損傷明顯緩解；NAL+PD98059 組心肌損傷弱于MIR組，重于NAL組，見圖2。

3 NAL對心肌損傷標(biāo)志物的影響

相比于sham 組，MIR 組血清CK、cTnT 和LDH 水平顯著增高（P＜0.05）；相比于MIR 組，NAL 組血清CK、cTnT 和LDH 水平顯著降低（P＜0.05）；相比于NAL 組，NAL+PD98059 組血清CK、cTnT 和LDH 水平顯著增高（P＜0.05），見表1。

表1 4組CK、cTnT及LDH水平比較Table 1. Comparison of CK，cTnT and LDH levels among the 4 groups（Mean±SD. n=5）

4 NAL對心肌細(xì)胞凋亡的影響

相比于sham 組，MIR 組凋亡率及cleaved caspase-3 蛋白水平顯著增高（P＜0.05），Bcl-2/Bax 水平顯著降低（P＜0.05）；相比于MIR組，NAL組凋亡率及cleaved caspase-3 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），Bcl-2/Bax水平顯著增高（P＜0.05）；相比于NAL組，NAL+PD98059組凋亡率及cleaved caspase-3蛋白水平顯著增高（P＜0.05），Bcl-2/Bax 水平顯著降低（P＜0.05），見圖3及表2。

表2 4組凋亡率、cleaved caspase-3水平及Bcl-2/Bax的比較Table 2. Comparison of apoptosis rate，cleaved caspase-3 level and Bcl-2/Bax among the 4 groups（Mean±SD. n=5）

Figure 2. Morphological changes of myocardial tissues in the 4 groups（HE staining，scale bar=50 μm）.圖2 4組心肌組織形態(tài)

5 NAL對心肌氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

相比于sham 組，MIR組心肌MDA 和ROS水平顯著增高（P＜0.05），SOD 和T-AOC 水平顯著降低（P＜0.05）；相比于MIR組，NAL組心肌MDA、ROS水平顯著降低（P＜0.05），SOD 和T-AOC 水平顯著增高（P＜0.05）；相比于NAL 組，NAL+PD98059 組心肌MDA和ROS 水平顯著增高（P＜0.05），SOD 和T-AOC 水平顯著降低（P＜0.05），見表3。

表3 4組MDA、ROS、SOD及T-AOC水平的比較Table 3. Comparison of levels of MDA，ROS，SOD and T-AOC among the 4 groups（Mean±SD. n=5）

6 NAL對心肌MAPK/ERK信號通路的影響

相比于sham 組，MIR 組Raf、MEK1/2 和ERK1/2磷酸化水平顯著降低（P＜0.05）；相比于MIR 組，NAL組Raf、MEK1/2 和ERK1/2 磷酸化水平顯著升高（P＜0.05）；相比于NAL 組，NAL+PD98059 組ERK1/2 磷酸化水平顯著降低（P＜0.05），Raf 和MEK1/2 磷酸化水平無顯著差異（P＞0.05），見圖4及表4。

表4 4組MAPK/ERK信號通路相關(guān)蛋白水平的比較Table 4. Comparison of MAPK/ERK signaling pathway-related protein levels among the 4 groups（Mean±SD. n=5）

討論

本研究采用較為常用的在體冠脈阻斷法復(fù)制MIR 大鼠模型，研究NAL 對其心肌損傷的改善作用。心肌梗死面積為MIR 損傷的最終呈現(xiàn)，可直觀反應(yīng)損傷的嚴(yán)重程度［5］，在梗死發(fā)生前，心肌細(xì)胞損傷已發(fā)生，細(xì)胞膜被破壞，心肌酶、蛋白質(zhì)等胞內(nèi)物質(zhì)釋放進(jìn)入血液中，可作為心肌損傷預(yù)警的標(biāo)志物［11］。另外，心肌組織形態(tài)在梗死前已發(fā)生改變，表現(xiàn)為心肌纖維斷裂、心肌細(xì)胞變形、炎癥細(xì)胞浸潤等［12-13］。本研究中，MIR 大鼠心肌梗死面積為（35.75±4.29）%，伴隨血清CK、cTnT和LDH 水平增高及心肌組織形態(tài)病理性改變，表明模型復(fù)制成功。近期研究顯示，2.5 mg/kg NAL 能在有效鎮(zhèn)痛的同時保護(hù)大鼠心功能［9］。本研究進(jìn)一步證實，2.5 mg/kg NAL 可顯著減小MIR 后心肌梗死面積，減輕心肌組織病變程度，降低血清CK、cTnT 和LDH 水平，表明NAL 對MIR損傷具有一定緩解作用。

MIR 發(fā)生時，一方面缺血引起SOD 等多種酶活性被破壞，機(jī)體抗氧化能力不足；另一方面再灌注短時間內(nèi)給予組織大量氧，這些氧無法被快速清除，導(dǎo)致氧自由基急劇增加，進(jìn)一步引起蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等過氧化，造成細(xì)胞膜等結(jié)構(gòu)破壞和功能損害［3，14］。另外，細(xì)胞凋亡也是MIR損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其中caspase家族、Bcl-2 家族等蛋白參與細(xì)胞凋亡的全過程。caspase-3 為線粒體途徑和Fas 激活受體途徑的凋亡執(zhí)行分子，被剪切后具有活性，啟動凋亡［15］；AIF（apoptosis-inducing factor）為不依賴caspase凋亡途徑的關(guān)鍵因子，可直接傳導(dǎo)凋亡信號入核，啟動凋亡，其釋放受到Bcl-2 家族的調(diào)節(jié)［16］。研究顯示，MIR 損傷過程中的細(xì)胞壞死雖不可逆，然而可通過減少氧自由基數(shù)量來抑制心肌細(xì)胞凋亡，減輕心肌損傷［17］。本研究中，NAL 干預(yù)可顯著降低心肌MDA、ROS、細(xì)胞凋亡率及cleaved caspase-3蛋白水平，增加SOD、TAOC 及Bcl-2/Bax 水平，提示NAL 對MIR 損傷心肌的保護(hù)主要通過增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，減少氧自由基損害，減少細(xì)胞凋亡實現(xiàn)。

Figure 3. Cardiomyocyte apoptosis test results. A：cardiomyocyte apoptosis detected by TUNEL staining（scale bar=50 μm）；B：Western blot detection of myocardial apoptosis-related protein levels.圖3 心肌細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果

Figure 4. Western blot detection of myocardial MAPK/ERK pathway-related protein levels.圖4 Western blot檢測心肌MAPK/ERK信號通路相關(guān)蛋白水平

ERK1/2 屬于MAPK 家族，通過Raf-MEK-ERK 級聯(lián)信號調(diào)節(jié)c-Myc等活性，促進(jìn)細(xì)胞存活和蛋白質(zhì)合成，也可募集或活化Bcl-2 等，提高機(jī)體抗凋亡水平，阻斷細(xì)胞凋亡［18-19］。此外，MAPK/ERK 信號通路已被證實可調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞存活，在MIR 期間具有抗細(xì)胞凋亡、保護(hù)心肌的功能［8，10-11］。本研究中，NAL 可顯著提高M(jìn)IR 損傷后心肌組織中Raf、MEK1/2 和ERK1/2 的磷酸化水平，提示NAL 可促進(jìn)MAPK/ERK信號通路活化。為探究NAL 的作用機(jī)制，本研究采用MEK1/2 抑制劑PD98059 進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，PD98059 可減弱NAL 的心肌保護(hù)作用及抗氧化應(yīng)激、抗凋亡作用，提示MAPK/ERK 信號通路在NAL減輕MIR損傷中發(fā)揮一定作用。

綜上所述，NAL 可能通過激活MAPK/ERK 信號通路調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和凋亡，進(jìn)而減輕MIR 損傷。過往研究主要集中于MIR 造模前或損傷后的治療，對應(yīng)臨床上手術(shù)前或損傷發(fā)生后的治療，而本研究是分析麻醉藥物NAL 在MIR 過程中的保護(hù)作用，具有一定臨床意義。