HeLa細胞S期核仁DNA的動態(tài)分布變化和衍生過程

關 欣，陳立梅，初曉丹，張德剛

(北華大學基礎醫(yī)學院，吉林 吉林 132013)

核仁是核糖體RNA基因(rDNA)和核糖體亞基裝配的場所，核仁增大和數(shù)量增多通常被作為鑒別惡性腫瘤的病理標志.在電鏡下觀察核仁主要由纖維中心(FC)、致密纖維組分(DFC)和顆粒組分(GC)3種結構組成[1-3].研究[4-6]表明：核仁中rDNA轉錄是腫瘤細胞特有的、在細胞周期中以高度動態(tài)變化的特異性作用于核仁結構空間分離區(qū)域，調控核仁組裝、拆卸及相應功能.核仁蛋白NPM1(Nucleophosmin)是典型的多功能的核仁蛋白，主要存在于核仁中，作為腫瘤抑制因子發(fā)揮作用，可引起核仁形態(tài)大小和數(shù)量的變化[7-8].我們前期研究[9-10]發(fā)現(xiàn)，核仁結構在間期以兩個動態(tài)時段存在：G1期的FC/DFC是有絲分裂后以核仁組織者區(qū)(NOR)為中心構建的結構；G2期的FC/DFC是S期改構后重新構建的結構.本研究將建立細胞同步化培養(yǎng)體系，結合電鏡DNA特異性染色方法對HeLa細胞進行觀察，使用免疫熒光抗體標記NPM1蛋白，進一步探討腫瘤細胞周期進程中S期時段核仁DNA組分及調節(jié)其表達核仁蛋白的形態(tài)學構效關系，為臨床腫瘤診療提供新的靶點.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗細胞：人宮頸癌HeLa 細胞(中國醫(yī)學科學院腫瘤細胞庫).

主要試劑：1640培養(yǎng)基、胎牛血清(GIBCO公司，美國)；胸腺嘧啶、 吖啶橙染色液(Sigma Aldrich公司，美國)；25%的戊二醛溶液、多聚甲醛溶液和醋酸雙氧鈾(北京新興百瑞技術有限公司)；Epon812環(huán)氧樹脂包埋劑套裝(SPI公司，美國)；NPM1和FITC標記IgG二抗(Cell Signaling Technology公司，美國).

1.2 HeLa細胞培養(yǎng)和細胞周期同步化

將HeLa細胞接種于1640新鮮培養(yǎng)基中，加入10%小牛血清在37 ℃含5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育.當單層細胞大約生長到40%時，將2 mmol/L濃度胸腺嘧啶加入培養(yǎng)基中.37 ℃ 孵育18 h后，PBS(pH 7.0)沖洗細胞，加入新的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)9 h，再次沖洗細胞加入胸腺嘧啶繼續(xù)培養(yǎng)16 h，沖洗同步化細胞，繼續(xù)孵育并開始釋放.

1.3 核仁中DNA特異性染色和電鏡超薄切片制備

為了更直接地對核仁中DNA的排布進行原位觀察，采用改良的NAMA-Ur方法[11].胸腺嘧啶阻斷后獲取HeLa細胞，用2.5%戊二醛和4%多聚甲醛室溫固定1 h，離心除去固定液，用PBS充分洗滌.將固定的HeLa細胞浸泡在NA溶液(NaOH，0.5 mol/L)4 ℃ 過夜處理，雙蒸水充分洗滌后再加入1%冰醋酸洗滌3次，再用雙蒸水充分洗滌.將細胞團浸入MA溶液(V(甲醇)∶V(醋酸酐)=1∶5)中，室溫條件下處理24 h，直到樣品適度漂白.細胞團用2.5%瓊脂糖包裹離心后取前端樣品，再將細胞樣品團塊經乙醇-甲醇系列脫水后，由甲醇和Epon812包埋劑混合液室溫浸透、包埋和聚合.在Reicher Jung切片機上切成厚度為60～80 nm的超薄切片，然后用5%水溶醋酸鈾60 ℃ 染色70 min.室溫冷卻，應用雙蒸水洗滌后再烘干，在Hitachi-7500型透射電子顯微鏡下進行觀察.

1.4 核仁DNA和RNA吖啶橙特異性染色

HeLa細胞經細胞周期同步化培養(yǎng)，分別收取0～16 h的細胞樣品.加入95%乙醇4 ℃ 固定1 h，PBS(pH 7.0)清洗3次，再加入濃度1%的吖啶橙染色液染色15 min，PBS漂洗3次.細胞樣品用90%甘油封片.激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞周期中核仁DNA和RNA的表達情況.為保證實驗的準確性和真實性，每個樣品取5個視野觀察.

1.5 免疫熒光染色檢測NPM1蛋白表達

將HeLa細胞經細胞周期同步化培養(yǎng)后分別取0～16 h的細胞樣品，加入95%乙醇4 ℃ 固定1 h，PBS漂洗3次，加入0.5% TritonX-100穿孔.細胞經5% BSA封閉30 min，加入1%BSA稀釋的NPM1抗體4 ℃ 過夜.加入1%BSA稀釋的FITC標記的二抗，37 ℃ 雜交1 h，DAPI染色5 min，細胞樣品用90%甘油封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞周期中NPM1蛋白的表達情況.

2 結果與分析

2.1 建立HeLa細胞周期不同階段同步化培養(yǎng)體系

采用胸腺嘧啶雙阻斷法將HeLa細胞阻斷在G1/S期的臨界點，以此為起始點釋放，以起始點為0 h開始取樣，將各時段采獲的細胞樣品分別定義為[9]：0～7 h 為S期(改組重構時段)，8～12 h 為G2期(重構后時段)，13～18 h為G1期(改組前時段)，并根據(jù)核仁FC和DFC超微結構在S期發(fā)生的改組與重構前后不同時段的形態(tài)變化特征，構建了HeLa細胞核仁結構在細胞周期進程中的模式圖.見圖1.

圖1 HeLa細胞核仁結構在細胞周期進程中的模式Fig.1 Model diagram of nucleolar structureduring the cell cycle of HeLa cells

2.2 HeLa細胞核仁DNA組分在細胞周期不同時段的衍生過程

G1期改組前時段，核仁中較大的FC出現(xiàn)在核仁中央，且FC區(qū)域內部或者邊緣出現(xiàn)染色較淺的染色質纖維，依稀可見從外向內伸入的DNA纖維.核內染色質開始解集縮成少量的條索狀纖維分散在核仁，位于DFC區(qū)域的DNA組分纖維有明顯的連接(見圖2 a白箭頭)，此時DFC的密度明顯高于核仁內的其他區(qū)域，變得更加的松散、寬厚，形成“云狀DNA”，DFC區(qū)域的密度明顯高于核仁內的其他區(qū)域，且FC與DFC的界線變得明顯(見圖2 a黑箭頭和白箭頭所示).

圖2 HeLa細胞周期中核仁DNA結構和分布的動態(tài)衍生變化 (Bar，0.5 μm)Fig.2 Dynamic derivation change of nucleolar DNA configuration and distributionduring the cell cycle of HeLa cells (Bar，0.5μm)

在S期改組重構時段，核仁DNA組分存在兩種形態(tài)：一種是在FC區(qū)域染色較淺的團塊狀DNA組分，一種是在勻質的結構中致密的顆粒狀DNA組分(見圖2 b星號).細胞核仁內FC區(qū)域有染色較淺的團塊狀DNA組分(見圖2 b黑箭頭).隨著DNA快速的集縮和解集縮的形態(tài)轉化，使FC和DFC結構區(qū)域從分界清晰逐漸變得模糊(見圖2 b白箭頭).值得注意的是，這個時段核膜周邊團塊狀染色質開始發(fā)生集縮，連續(xù)分布于核仁周邊形成一個連續(xù)的“環(huán)狀”DNA組分圍繞在核仁周圍(見圖2 b白箭頭).

G2期重構后時段，核仁周圍的“環(huán)狀”DNA染色質纖維開始變得松散伸入核仁內部.FC區(qū)域出現(xiàn)染色較淺的塊狀DNA組分，DFC區(qū)域的DNA組分逐漸變淺，F(xiàn)C邊緣與DFC交界處區(qū)域含有致密的顆粒狀DNA組分(見圖2 c黑箭頭和白箭頭).核仁內DNA組分的密度變得極不均勻，以較淺極細的染色質纖維的形態(tài)交聯(lián)在一起與核仁周邊染色質纖維相互連接的更加密集(見圖2 c白箭頭).隨后染色質在核膜處大面積高度的集縮，呈大塊染色質團塊，此時核仁周邊染色質延伸到核膜處，伴隨這一過程核仁逐漸解體(見圖2 d白箭頭).結果顯示：核仁周邊染色質不僅是核仁結構組分FC和DFC中DNA組分的重要來源，也是維持核仁正常形態(tài)的重要物質.

2.3 吖啶橙特異性熒光染色檢測DNA和RNA表達

將HeLa細胞在含2 mmol/L的胸腺嘧啶1640培養(yǎng)基中進行同步化培養(yǎng)，選取4、8、16 h的細胞，采用吖啶橙特異性熒光染色，檢測細胞核內DNA和RNA表達變化情況.DNA綠色熒光分布在細胞核內和核仁周邊，RNA橙色熒光在核仁中有很強的熒光信號，細胞核內熒光信號弱.觀察結果顯示：S期核仁體積最小，數(shù)量最少，在G2期核仁體積最大，數(shù)量最多.在G1期較強的DNA綠色熒光分布核膜處核仁周邊，RNA橙色熒光主要分布在核仁內.在G2期，RNA 橙色熒光信號最強，提示RNA轉錄活躍程度在G2期最強.見圖3.

圖3 HeLa細胞間期不同時段的核內DNA和RNA表達情況 (Bar，0.5 μm)Fig.3 Nucleolar DNA and RNA expression at various time points of interphase in HeLa cells (Bar，0.5 μm)

2.4 免疫熒光染色檢測NPM1蛋白表達

將HeLa細胞在含2 mmol/L的胸腺嘧啶1640培養(yǎng)基中進行同步化培養(yǎng)，選取4、8、12、16 h 的細胞.前期研究發(fā)現(xiàn)，通過同步化培養(yǎng)細胞，觀察到核仁結構在細胞周期進程中是高度動態(tài)變化的.見圖1.通過熒光標記檢測綠色熒光的NPM1蛋白在細胞周期進程中的表達情況，結果顯示：NPM1蛋白在細胞周期各時期中熒光表達水平變化較大，在G1期和S期均定位于核仁，但在核仁結構重構后的G2期表達顯著增加，不僅位于核仁中，也位于核質和核膜表面.見圖4.

圖4 HeLa細胞間期不同時段的NPMI蛋白表達情況Fig.4 NPM1 expression at various time points of interphase in HeLa cells

3 討 論

核仁是核糖體基因(rDNA)轉錄和轉錄產物進一步加工成熟的形態(tài)學表現(xiàn).最新研究發(fā)現(xiàn)：腫瘤細胞核仁在核糖體生物發(fā)生和調控細胞增殖中發(fā)揮著驅動中心的作用，提示核仁大小和形態(tài)變化與腫瘤的惡性程度相關，其特性可為抗腫瘤策略提供新的可行性靶點[12].而且腫瘤細胞在細胞周期多個時段存在 DNA 復制行為，這可能與 DNA 復制異常引起DNA 損傷導致腫瘤的發(fā)生有關，可見保持 DNA 的穩(wěn)定性對于核仁的正常結構和功能是至關重要的[13].因此，研究腫瘤細胞核仁DNA組分及其核仁蛋白在細胞周期進程中的動態(tài)轉化特點，使細胞核仁更有希望成為抗癌策略的目標靶點.

核仁結構決定其功能，核仁中DNA轉錄區(qū)域是腫瘤細胞特有的RNA polI唯一高效轉錄的靶點[3，5，12-13].我們的前期研究發(fā)現(xiàn)：HeLa細胞核仁結構在細胞間期的S期時段FC/DFC發(fā)生了改構與重構，核仁大小和數(shù)量隨之發(fā)生改變.本研究結果顯示：核仁內DNA組分動態(tài)分布是隨著HeLa細胞周期進程中 FC/DFC結構高度動態(tài)變化的，共經歷了3個時段：1)G1期核仁內DNA組分解集縮時形成云狀DNA；2)S期核仁內DNA組分有兩種分布形態(tài)：一種是在FC區(qū)域染色較淺的團塊狀DNA組分，一種是在勻質的結構中致密的顆粒狀DNA組分；3)G2期核仁內染色較淺極細的纖維形式交聯(lián)在一起.提示S期時段可能是調控核仁結構和功能的關鍵節(jié)點.

核仁功能的改變與核仁蛋白在核仁中的定位和易位密切相關.越來越多的研究[3，8，14]提示：核仁蛋白易位的發(fā)生是核仁結構轉化的關鍵問題.當細胞處于有絲分裂期時核仁解體，核仁蛋白重新定位.我們前期通過對核仁結構的研究發(fā)現(xiàn)[9-10]：核仁在細胞周期進程中不是簡單的形成和解體，而是在細胞周期進程中S期時段內其結構組分發(fā)生改構與重構；FC和DFC的數(shù)量、大小和形態(tài)變化是由核仁結構的改構與重建產生的.NPM1是典型的易位蛋白，對于維持核仁的結構和功能起著重要作用，亦可作為腫瘤抑制因子發(fā)揮作用[10].本研究結果顯示：NPM1蛋白在G1期(改組前時段)和S期(改組重構時段)均位于核仁中，在G2期(重構后時段)表達顯著增加，不僅存在于核仁中，也位于核質和核膜表面，提示NPM1蛋白不僅在核仁解體后重新定位，在S期時段隨著核仁的改組重構也發(fā)生了易位，從而誘導核仁解聚轉化，表現(xiàn)為核仁形態(tài)大小、數(shù)量以及DNA組分的高度動態(tài)變化.

核仁的主要功能是調控核糖體的生物合成與成熟，在調控腫瘤細胞增殖中發(fā)揮著驅動中心的作用.本研究發(fā)現(xiàn)：以S期改組重構時段為形態(tài)轉換交界點，核仁DNA以兩種形式存在：松散的“云狀”DNA纖維(G1期為改組前時段和 G2期為重構后時段)和致密的染色質顆粒(S期改組重構時段)呈勻質狀態(tài)均勻的分散在核仁內.根據(jù)核仁功能在其結構上區(qū)間隔離化的作用原理，我們推測核仁中DNA組分發(fā)生集縮和解集縮的高度動態(tài)變化以及NPM1蛋白從核仁到核質的易位事件，提示S期的變化可能是調控腫瘤發(fā)生的關鍵拐點.