miR-216a、miR-301a調(diào)控BMPR2促進(jìn)缺氧環(huán)境下肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖

林瀟,鄭煒平,李鴻茹,陳愉生,周夢

(福建省立醫(yī)院 1. 老年科； 2. 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科； 3. 風(fēng)濕免疫科,福建 福州 350001)

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension, PAH)是由多因素引起的肺血管阻力增加,引發(fā)肺動(dòng)脈壓力異常升高的臨床綜合征,其病理生理特點(diǎn)主要為肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial smooth muscle cells, PASMC)過度增殖、肥大,后期逐漸演變?yōu)榉窝軈矤罾w維化[1],右心室后負(fù)荷增加,最終導(dǎo)致右心功能衰竭[2]。目前PAH的治療主要包括一氧化氮、內(nèi)皮素受體拮抗劑和前列環(huán)素類似物[3],但總體效果不佳,死亡率高,因此亟需尋找新的分子通路靶點(diǎn)用于藥物研發(fā)。當(dāng)前微小RNA(miRNA)參與PAH發(fā)病機(jī)制的研究已成為學(xué)術(shù)界的熱點(diǎn),多篇文獻(xiàn)已報(bào)道,miR-21、miR-124、miR-140和miR-663等多種miRNA參與調(diào)控PASMC的增殖、遷移[4-7],有研究發(fā)現(xiàn)miR-216a、miR-301a在PAH大鼠或人的PASMC中表達(dá)上調(diào)[8-9],然而缺氧環(huán)境下miR-216a、miR-301a調(diào)控PASMC增殖的相關(guān)機(jī)制研究較少。本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討miR-216a、miR-301a對缺氧條件下人PASMC(HPASMC)增殖的影響及相關(guān)分子機(jī)制,旨在為治療PAH開發(fā)新型靶向藥物提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

HPASMC及iCell原代平滑肌細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(上海賽百慷生物技術(shù)公司)；超純RNA提取試劑盒、超純miRNA提取試劑盒及BCA蛋白定量試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技公司)；mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及miRNA熒光定量qPCR檢測試劑盒(南京諾唯贊生物科技公司)；mRNA熒光定量qPCR檢測試劑盒(廈門生命互聯(lián)科技公司)；CCK8細(xì)胞增殖檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)公司)；RIPA細(xì)胞裂解液(北京普利萊基因技術(shù)公司)；ECL超敏發(fā)光液(美國賽默飛公司)；骨形成蛋白2型受體(bone morphogenetic protein receptor type 2, BMPR2)、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、β-肌動(dòng)蛋白抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(英國Abcam公司)；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑(美國Invitrogen公司)；雙熒光素酶報(bào)告檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司)；293T細(xì)胞(河北北納生物科技公司)；miR-216a模擬物、miR-216a抑制物(anti-miR-216a)、miR-301a模擬物、miR-301a抑制物(anti-miR-301a)、模擬物對照(miR-NC)及抑制物對照(anti-miR-NC)、BMPR2過表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA-BMPR2)及空白載體(pcDNA)均購自江西中洪博元生物公司。

1.2 主要方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將HPASMC加入iCell原代平滑肌細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,常氧組細(xì)胞于21% O2、5% CO2、74% N2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,缺氧組細(xì)胞于3% O2、5% CO2、92% N2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),根據(jù)HPASMC在缺氧環(huán)境下培養(yǎng)時(shí)間的不同分為3組,分別為缺氧12 h、缺氧24 h和缺氧48 h組。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 HPASMC傳代培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)70%時(shí),更換為無血清的培養(yǎng)基,根據(jù)Lipofectamine 3000試劑盒說明書,將miR-216a和miR-301a模擬物、anti-miR-216a、anti-miR-301a、miR-NC、anti-miR-NC、pcDNA-BMPR2及空白載體轉(zhuǎn)染入HPASMC,轉(zhuǎn)染4 h后加入血清含量為20%的完全培養(yǎng)基,放回缺氧培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行檢測。

1.2.3 qRT-PCR 提取常氧組和各缺氧組HPASMC中的BMPR2 mRNA和miR-216a、miR-301a,紫外分光光度計(jì)檢測RNA純度和濃度,分別通過mRNA和miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,將cDNA分別采用mRNA和miRNA熒光定量qPCR檢測試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)步驟為預(yù)變性95 ℃,10 min；變性95 ℃,10 s；退火58 ℃,30 s；延伸72 ℃,30 s；40個(gè)循環(huán)。分別以β-肌動(dòng)蛋白和U6作為mRNA和miRNA的內(nèi)參,miR-216a、miR-301a、BMPR2 mRNA的相對表達(dá)量根據(jù)2-△△Ct法計(jì)算。miR-216a上游引物:5′-CGCGTCACAGTGGTCTCTGG-3′,下游引物:5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′；miR-301a上游引物:5′-CGCGCAGTGCAATAGTATTGT-3′,下游引物:5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′；BMPR2上游引物:5′-TTGCCGTCTTGCTCATTCT-3′,下游引物:5′-GTCTATTTCCAGTCAGCCTCAT-3′；β-肌動(dòng)蛋白上游引物:5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′,下游引物:5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′；U6上游引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.4 CCK8檢測HPASMC增殖活力 將造模的HPASMC消化、重懸、計(jì)數(shù)、鋪板,細(xì)胞密度為5×103個(gè)/孔,將細(xì)胞培養(yǎng)48 h后,待測的96孔板細(xì)胞換成相同的培養(yǎng)基,每孔加入10 μL CCK8試劑,置于培養(yǎng)箱中孵育2 h,酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測每孔的光密度值,并計(jì)算常氧和不同缺氧時(shí)間培養(yǎng)下HPASMC的存活率,以及缺氧環(huán)境下轉(zhuǎn)染miR-216a或miR-301a抑制物,同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-216a或miR-301a聯(lián)合pcDNA-BMPR2后HPASMC的存活率。

1.2.5 蛋白免疫印跡檢測BMPR2、PCNA表達(dá) 使用RIPA細(xì)胞裂解液提取HPASMC中的蛋白,BCA試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白質(zhì)加熱變性后,進(jìn)行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳2 h,后用300 mA恒流轉(zhuǎn)至PVDF膜80 min。將膜浸入5%脫脂奶粉封閉液中孵育2 h,4 ℃下與BMPR2抗體、PCNA抗體及β-肌動(dòng)蛋白抗體孵育過夜,二抗溶液中室溫孵育2 h。在PVDF膜上滴加ECL發(fā)光液,并在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。采用Image-Pro軟件分析各抗體條帶灰度值。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告檢測各轉(zhuǎn)染組螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶活性 將含有miR-216a結(jié)合位點(diǎn)的BMPR2 3′-UTR的野生型(WT)和突變型(MUT)片段克隆到pmirGLO質(zhì)粒上,分別構(gòu)建BMPR2野生型熒光素酶載體(BMPR2 WT-1)和BMPR2突變型熒光素酶載體(BMPR2 MUT-1),用同樣的方法構(gòu)建與miR-301a結(jié)合位點(diǎn)互補(bǔ)的BMPR2 WT-2載體和BMPR2 MUT-2載體。將293T細(xì)胞鋪板,待細(xì)胞完全貼壁后密度達(dá)70%時(shí),將miR-216a、miR-301a、miR-NC和構(gòu)建的BMPR2熒光素酶載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后裂解細(xì)胞,通過雙熒光素酶檢測法分別檢測各轉(zhuǎn)染組螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性,驗(yàn)證BMPR2與miR-216a、BMPR2與miR-301a之間的關(guān)系。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 缺氧對細(xì)胞增殖活力及miR-216a、miR-301a、BMPR2表達(dá)的影響

CCK8結(jié)果顯示,HPASMC的增殖活力隨缺氧時(shí)間延長逐漸增加,Spearman相關(guān)性分析提示細(xì)胞增殖活力與缺氧時(shí)間呈正相關(guān)(r=0.865,P<0.001)。因?yàn)樵诒狙芯恐腥毖?8 h組細(xì)胞增殖活力最強(qiáng),故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇缺氧48 h進(jìn)行。qRT-PCR結(jié)果顯示,miR-216a在缺氧24 h和48 h的表達(dá)水平均顯著高于常氧組及缺氧12 h組(P<0.05),miR-216a表達(dá)與缺氧時(shí)間也呈正相關(guān)(r=0.870,P<0.001)。miR-301a在缺氧12 h、24 h和48 h組的表達(dá)量均高于常氧組(P<0.05),并且在缺氧24 h組表達(dá)量最高。BMPR2 mRNA的表達(dá)水平隨著缺氧時(shí)間延長而逐漸降低,兩者呈負(fù)相關(guān)(r=-0.978,P<0.001)。見圖1。

①:常氧組,②:缺氧12 h組,③:缺氧24 h組,④:缺氧48 h組。a:P<0.05,與常氧組比較；b:P<0.05,與缺氧12 h組比較；c:P<0.05,與缺氧24 h組比較

2.2 缺氧環(huán)境下miR-216a、miR-301a對HPASMC增殖的影響

CCK8和蛋白免疫印跡結(jié)果顯示,與常氧組比較,缺氧組HPASMC的細(xì)胞增殖活力增強(qiáng),PCNA表達(dá)增加(P均<0.05),轉(zhuǎn)染抑制物對照miR-NC幾乎不影響缺氧組HPASMC的增殖活力及PCNA表達(dá)。轉(zhuǎn)染miR-216a或miR-301a抑制物后,HPASMC增殖活力受到抑制,PCNA表達(dá)下降(P均<0.05),提示下調(diào)miR-216a或miR-301a抑制缺氧環(huán)境下HPASMC的增殖能力,間接表明缺氧條件下miR-216a、miR-301a能促進(jìn)HPASMC的增殖(圖2)。

①:常氧組,②:缺氧組,③:缺氧+anti-miR-216a-NC組,④:缺氧+anti-miR-216a組,⑤:缺氧+anti-miR-301a-NC組,⑥:缺氧+anti-miR-301a組。a:P<0.05,與常氧組比較；b:P<0.05；與缺氧組比較；c:P<0.05,與缺氧+anti-miR-216a-NC組比較；d:P<0.05,與缺氧+anti-miR-301a-NC組比較

2.3 BMPR2是miR-216a、miR-301a的靶基因

借助Starbase數(shù)據(jù)庫(https://starbase.sysu.edu.cn)搜索發(fā)現(xiàn)miR-216a與BMPR2 mRNA的3′-UTR中的7個(gè)堿基互補(bǔ),miR-301a也與BMPR2 mRNA的3′-UTR中的7個(gè)堿基互補(bǔ),提示BMPR2可能是這兩個(gè)miRNA分子的靶點(diǎn)(圖3A)。雙熒光素酶報(bào)告結(jié)果顯示,miR-216a聯(lián)合BMPR2 WT-1轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性顯著低于miR-NC聯(lián)合BMPR2 WT-1轉(zhuǎn)染組和單純BMPR2 WT-1轉(zhuǎn)染組(P均<0.05),而miR-216a聯(lián)合BMPR2 MUT-1轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性與miR-NC聯(lián)合BMPR2 MUT-1轉(zhuǎn)染組和單純BMPR2 MUT-1轉(zhuǎn)染組比較無顯著差異(圖3B),提示BMPR2是miR-216a的靶基因。同樣,miR-301a聯(lián)合BMPR2 WT-2轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性顯著低于miR-NC聯(lián)合BMPR2 WT-2轉(zhuǎn)染組和單純BMPR2 WT-2轉(zhuǎn)染組(P均<0.05),miR-301a聯(lián)合BMPR2 MUT-2轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性與miR-NC聯(lián)合BMPR2 MUT-2轉(zhuǎn)染組和單純BMPR2 MUT-2轉(zhuǎn)染組比較無顯著差異(圖3C),提示BMPR2也是miR-301a的靶基因。

A:Starbase數(shù)據(jù)庫預(yù)測BMPR2分別與miR-216a、miR-301a的結(jié)合位點(diǎn)；B:雙熒光素酶報(bào)告測定BMPR2與miR-216a之間的關(guān)系；C:雙熒光素酶報(bào)告測定BMPR2與miR-301a之間的關(guān)系。①:BMPR2 WT-1組,②:BMPR2 WT-1+miR-NC組,③:BMPR2 WT-1+miR-216a組,④:BMPR2 MUT-1組,⑤:BMPR2 MUT-1+miR-NC組,⑥:BMPR2 MUT-1+miR-216a組,⑦:BMPR2 WT-2組,⑧:BMPR2 WT-2+miR-NC組,⑨:BMPR2 WT-2+miR-301a組,⑩:BMPR2 MUT-2組,:BMPR2 MUT-2+miR-NC組,:BMPR2 MUT2+miR-301a組。a:P<0.05,與BMPR2 WT-1組比較；b:P<0.05,與BMPR2 WT-1+miR-NC組比較；c:P<0.05,與BMPR2 WT-2組比較；d:P<0.05,與BMPR2 WT-2+miR-NC組比較

2.4 缺氧環(huán)境下miR-216a、miR-301a下調(diào)BMPR2基因促進(jìn)HPASMC的增殖

蛋白免疫印跡結(jié)果顯示,與常氧組比較,缺氧組BMPR2表達(dá)降低(P<0.05),轉(zhuǎn)染了pcDNA-BMPR2后,HPASMC中的BMPR2表達(dá)升高(P<0.05)。與轉(zhuǎn)染miR-NC聯(lián)合pcDNA-BMPR2組相比,當(dāng)轉(zhuǎn)染了miR-216a或miR-301a聯(lián)合pcDNA-BMPR2后,BMPR2明顯下降(P<0.05),提示miR-216a或miR-301a抑制BMPR2的表達(dá)。與缺氧環(huán)境下轉(zhuǎn)染空白載體比較,缺氧環(huán)境下轉(zhuǎn)染pcDNA-BMPR2,CCK8結(jié)果顯示細(xì)胞增殖活力降低(P<0.05),蛋白免疫印跡結(jié)果顯示HPASMC中的PCNA表達(dá)下降(P<0.05),提示BMPR2抑制HPASMC的增殖。與轉(zhuǎn)染miR-NC聯(lián)合pcDNA-BMPR2組比較,當(dāng)轉(zhuǎn)染miR-216a或miR-301a聯(lián)合pcDNA-BMPR2后,細(xì)胞增殖活力明顯升高(P<0.05),PCNA表達(dá)也呈上升趨勢,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜上所述,缺氧環(huán)境下miR-216a或miR-301a通過抑制BMPR2,促進(jìn)HPASMC的增殖。見圖4。

①:常氧組,②:缺氧組,③:缺氧+pcDNA組,④:缺氧+pcDNA-BMPR2組,⑤:缺氧+miR-NC+pcDNA-BMPR2組,⑥:缺氧+miR-216a+pcDNA-BMPR2組,⑦:缺氧+miR-301a+pcDNA-BMPR2組。a:P<0.05

3 討論

缺氧是引發(fā)PAH的重要因素之一。目前有關(guān)慢性缺氧引發(fā)PAH的機(jī)制尚未完全闡明,有研究表明缺氧可能通過促進(jìn)大鼠PASMC中的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4表達(dá)增加,誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生,促進(jìn)PASMC增殖[10]。新近研究發(fā)現(xiàn)缺氧還可誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因蛋白-1的異常表達(dá),通過調(diào)控PASMC的增殖和焦亡過程,促進(jìn)PAH的形成[11]。本研究結(jié)果顯示,HPASMC的增殖活力隨缺氧時(shí)間延長而逐漸增加,HPASMC在缺氧組中的PCNA表達(dá)水平高于常氧組,均提示缺氧環(huán)境能顯著誘發(fā)肺血管平滑肌細(xì)胞增殖,促進(jìn)肺血管重塑。

已有研究發(fā)現(xiàn)miR-130/301家族在HPASMC中表達(dá)上調(diào),并通過抑制PPARγ表達(dá),調(diào)控下游STAT3/miR-204信號通路,促進(jìn)HPASMC增殖[9]。另有研究表明miR-130/301家族受轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子YAP/TAZ激活,促進(jìn)肺血管細(xì)胞外基質(zhì)的重塑,參與PAH的形成[12]。目前有關(guān)miR-216a促進(jìn)PAH形成機(jī)制的文獻(xiàn)報(bào)道極少,Chinnappan等[8]通過對HIV病毒轉(zhuǎn)基因大鼠注射可卡因以構(gòu)建PAH模型,發(fā)現(xiàn)miR-216a在這類大鼠模型的PASMC中呈現(xiàn)高表達(dá),進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-216a通過沉默下游BMPR2基因表達(dá),促進(jìn)PASMC的增殖和遷移。而關(guān)于miR-216a在缺氧誘導(dǎo)PAH模型中的發(fā)病機(jī)制研究尚未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn),隨著缺氧時(shí)間延長,miR-216a表達(dá)水平增加；miR-301a在缺氧24 h的表達(dá)水平也顯著高于常氧組和缺氧12 h組。通過下調(diào)缺氧環(huán)境中HPASMC的miR-216a和miR-301a表達(dá),發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖活力和PCNA表達(dá)均受到抑制,表明miR-216a和miR-301a可能參與PAH的發(fā)病過程。

BMPR2是轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor, TGF)超家族中一類重要的細(xì)胞因子,已被發(fā)現(xiàn)與肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。Roberts等[13]報(bào)道BMPR2基因突變失活是特發(fā)性PAH的主要發(fā)病原因之一。Jiang等[14]發(fā)現(xiàn)在博萊霉素誘導(dǎo)PAH大鼠模型中,BMP9/BMPR2/SMAD信號傳導(dǎo)通路受到抑制,繼而導(dǎo)致肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加及肺血管平滑肌增厚。另有報(bào)道發(fā)現(xiàn)恢復(fù)BMPR2信號傳導(dǎo)能夠緩解甚至逆轉(zhuǎn)肺血管重塑[15]。本研究發(fā)現(xiàn)BMPR2 mRNA表達(dá)隨著缺氧時(shí)間延長而逐漸下降,對缺氧組HPASMC轉(zhuǎn)染pcDNA-BMPR2,細(xì)胞增殖活力明顯降低,PCNA表達(dá)下降,上述結(jié)果提示BMPR2具有抑制HPASMC增殖的作用。

目前,miRNA參與調(diào)節(jié)BMPR2基因或BMP/TGF-β信號通路誘導(dǎo)PAH形成機(jī)制的研究已成為學(xué)者廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)。例如miR-17-92系列通過IL-6/STAT3信號通路下調(diào)BMPR2表達(dá),對PASMC和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮促增殖和抗凋亡作用[16]。miR-424/503通過上調(diào)Apelin基因,恢復(fù)BMPR2信號傳導(dǎo),抑制PASMC和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖[17]。新近研究發(fā)現(xiàn)miR-182通過沉默髓系相關(guān)分化標(biāo)志基因(myeloid-associated differentiation marker, MYADM),促進(jìn)BMP/TGF-β信號通路傳導(dǎo),延緩缺氧誘導(dǎo)PAH的發(fā)病進(jìn)程[18]。本實(shí)驗(yàn)通過雙熒光素酶報(bào)告測定證實(shí)BMPR2是miR-216a、miR-301a的下游靶點(diǎn)。進(jìn)一步研究表明,同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-216a或miR-301a聯(lián)合pcDNA-BMPR2可顯著抑制BMPR2表達(dá)水平,細(xì)胞增殖活力增強(qiáng),PCNA表達(dá)上調(diào),提示miR-216a、miR-301a通過抑制BMPR2參與缺氧誘導(dǎo)PAH的形成。

綜上所述,缺氧條件下miR-216a和miR-301a均能促進(jìn)HPASMC增殖,其作用機(jī)制與抑制下游BMPR2表達(dá)有關(guān)。本研究在設(shè)計(jì)上還存在以下不足:首先,本研究僅通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)來探討miRNA參與PAH發(fā)病的相關(guān)機(jī)制,尚缺少動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)的驗(yàn)證；其次,PAH的發(fā)病過程不僅與PASMC的增殖有關(guān),也和細(xì)胞的遷移、凋亡等多種生物學(xué)行為有關(guān)聯(lián)。故今后有必要進(jìn)一步探討上述兩個(gè)miRNA對缺氧環(huán)境下PASMC遷移及凋亡的影響,并研究潛在的信號傳導(dǎo)通路,同時(shí)增加動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)來確認(rèn)miR-216a和miR-301a在PAH發(fā)病中的作用。另外,近年來環(huán)狀RNA(circRNA)與PAH關(guān)系的研究已成為學(xué)者關(guān)注的前沿?zé)狳c(diǎn),已發(fā)現(xiàn)circRNA可通過吸附miRNA(miRNA海綿作用),削弱miRNA對下游靶基因的抑制,上調(diào)靶基因的表達(dá),參與疾病的發(fā)病過程[19]。今后可在本研究基礎(chǔ)上繼續(xù)探尋miR-216a、miR-301a上游可能參與PAH發(fā)病的circRNA,探索相關(guān)分子通路,為未來精準(zhǔn)化治療提供新的靶點(diǎn)。