生理生化法評(píng)價(jià)黃精屬種質(zhì)資源的耐蔭性和抗寒性

蔣宇杰，賈巧君，焦 劼，陳喜良，馬存德，常 暉，梁宗鎖

（1浙江理工大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)藥學(xué)院/浙江省植物次生代謝調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310018；2浙江萬(wàn)壽康生物科技有限公司，浙江武義 321200；3陜西步長(zhǎng)制藥集團(tuán)公司，西安 710000）

0 引言

黃精是藥食兩用植物，藥用歷史悠久，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、潤(rùn)肺、益腎的功效，臨床上用于脾胃氣虛、體倦乏力、肺虛燥咳、勞嗽咳血等疾病的治療[1]。此外，黃精在抗衰老、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫力、預(yù)防治療糖尿病等方面具有潛在的藥用價(jià)值[2]。

黃精喜蔭蔽，適合種于蔭蔽、半蔭蔽環(huán)境，因此在種植栽培時(shí)需要間作玉米等高稈植物進(jìn)行遮蔭[3-4]。在遮蔭弱光條件下，葉片內(nèi)的葉綠素含量會(huì)發(fā)生變化，相對(duì)低的葉綠素a/b值和高的葉綠素含量能使植物具有較高的光合特性，保持自身的平衡系統(tǒng)，進(jìn)行正常的生命活動(dòng)[5-6]。李迎春等[7]以葉綠素、類(lèi)胡蘿卜素含量作為多花黃精的耐蔭性指標(biāo)，研究表明，隨著透光率下降，葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b含量均先升高后降低，而葉綠素a/b和類(lèi)胡蘿卜素含量則相反。谷豐收[8]以光合有效輻射降低至600 μmol/(m2·s)時(shí)的凈光合速率改變幅度作為判斷藥用植物是否喜蔭的依據(jù)，發(fā)現(xiàn)黃精的凈光合速率改變幅度為13.74%，小于15%，為喜蔭植物。此外，黃精能耐寒凍，性耐寒，幼苗能露地越冬[9]，但是持續(xù)的過(guò)低溫度會(huì)延緩黃精生長(zhǎng)發(fā)育速度，甚至破壞其生理功能，降低產(chǎn)量、影響品質(zhì)。賈向榮[10]選用可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸、丙二醛含量作為黃精抗寒性評(píng)價(jià)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)葉片中可溶性糖含量呈先升高后降低的趨勢(shì)，而可溶性蛋白與游離脯氨酸含量則呈先降低后升高再降低的趨勢(shì)，MDA含量先上升后下降。

當(dāng)前，關(guān)于黃精的研究主要集中在黃精的藥用成分和藥理研究等方面，盡管已有研究對(duì)黃精耐蔭性、抗寒性指標(biāo)的選擇確定進(jìn)行了報(bào)道，但是對(duì)黃精耐蔭性、抗寒性種質(zhì)篩選和鑒定的研究鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)測(cè)定黃精葉片中的葉綠素含量及可溶性糖、游離蛋白質(zhì)、脯氨酸、丙二醛含量，比較不同產(chǎn)地及不同黃精種間、種內(nèi)的耐蔭性和抗寒性差異，并獲得耐蔭性和抗寒性較強(qiáng)的黃精種質(zhì)，以期為后續(xù)黃精耐蔭、抗寒育種提供合適的材料和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

研究田間試驗(yàn)于2014年5月開(kāi)始、10月結(jié)束。田間試驗(yàn)與室內(nèi)試驗(yàn)均在陜西省略陽(yáng)縣步長(zhǎng)集團(tuán)GAP黃精基地進(jìn)行。試驗(yàn)地位于陜西省略陽(yáng)市，屬于溫暖帶濕潤(rùn)季風(fēng)性氣候，試驗(yàn)期間測(cè)定的平均氣溫為20.9℃，最高氣溫達(dá)34.8℃。

1.2 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料來(lái)自陜西省略陽(yáng)縣步長(zhǎng)集團(tuán)GAP黃精基地的黃精種質(zhì)資源圃，其中多花黃精24份、黃精10份，種質(zhì)來(lái)源詳見(jiàn)表1。每個(gè)地區(qū)共收集黃精根莖100株，并對(duì)其進(jìn)行初步篩選。選擇無(wú)霉變、大小一致的2年生具休眠芽的根莖，進(jìn)行統(tǒng)一種植栽培，試驗(yàn)期間定期供水、除草。

表1 種質(zhì)資源表

UV-2802H型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（尤尼柯上海儀器有限公司），XMTD-8222型恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：20130115），無(wú)水乙醇、丙酮、蒽酮、濃硫酸、冰醋酸等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 耐蔭性測(cè)定方法

5月黃精出苗后，在隔離帶中種植玉米進(jìn)行遮蔭，同年10月結(jié)束遮蔭處理。遮蔭與未遮蔭組中，各地區(qū)黃精種質(zhì)各選取20株參與試驗(yàn)。

分別統(tǒng)一采集遮蔭前后健康且生長(zhǎng)旺盛的黃精植株中部葉片，依次用蒸餾水、去離子水沖洗，用濾紙吸干水分后，備用。準(zhǔn)確稱取葉片100 mg，轉(zhuǎn)入研缽中，加入預(yù)先配制的4.5:4.5:1的無(wú)水乙醇、丙酮和蒸餾水混合提取液和少量的石英砂，研磨至勻漿；暗處理2 h后，以提取液為對(duì)照，采用紫外分光光度計(jì)分別在645、663 nm下測(cè)定樣品的吸光值，每個(gè)樣品重復(fù)3次。采用Arnon公式[11]計(jì)算葉片中葉綠素的含量。

1.4 抗寒性測(cè)定方法

各地區(qū)黃精種質(zhì)各選取20株參與試驗(yàn)。分別統(tǒng)一采集長(zhǎng)勢(shì)旺盛黃精植株中帶有葉片的莖，依次用蒸餾水、去離子水沖洗，用濾紙吸干水分后，備用。在4℃處理24 h后將材料取出放入冰箱12 h，備用。設(shè)3個(gè)重復(fù)。將葉片分為3份，分別置于密封的自封袋中。測(cè)定植物葉片中丙二醛(MDA)含量（硫代巴比妥酸法）[12]、游離脯氨酸(Pro)含量（酸性茚三酮法）[13]、可溶性蛋白含量（考馬斯亮藍(lán)G-250染色法）[14]和可溶性糖含量（蒽酮比色法）[15]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

原始數(shù)據(jù)的整理、單因素方差分析運(yùn)用Microsoft Excel 2010完成。

采用模糊綜合評(píng)判法，計(jì)算各參試材料測(cè)定指標(biāo)的隸屬函數(shù)Xn[16]。隸屬函數(shù)值計(jì)算如式(1)；如果指標(biāo)與耐蔭性、抗寒性呈負(fù)相關(guān)，則采用反隸屬函數(shù)值計(jì)算，如式(2)。葉綠素b、總?cè)~綠素含量與耐蔭性呈正相關(guān)，葉綠素a含量及葉綠素a/b值與耐蔭性呈負(fù)相關(guān)；可溶性糖、游離蛋白質(zhì)、脯氨酸含量與抗寒性呈正相關(guān)，MDA含量與抗寒性呈負(fù)相關(guān)。

式中，X為各材料某一指標(biāo)的測(cè)定均值，Xmax為各材料該指標(biāo)測(cè)定值中的最大值，Xmin為該指標(biāo)中的最小值。將各材料各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值進(jìn)行累加，計(jì)算其平均值，平均隸屬函數(shù)值越大種質(zhì)越優(yōu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 遮蔭對(duì)多花黃精和黃精葉綠素含量的影響

2.1.1 遮蔭對(duì)多花黃精的葉綠素含量的影響 多花黃精的葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量指標(biāo)的種內(nèi)變異性大，變異系數(shù)均＞20%。遮蔭后，除葉綠素a/b值外，其余變異系數(shù)增大（表2）。遮蔭后，多花黃精葉綠素a含量、總?cè)~綠素呈上升趨勢(shì)。其中安徽池州、安徽青陽(yáng)、安徽涇縣、廣西宜州地區(qū)的多花黃精葉片葉綠素a含量、總?cè)~綠素均呈極顯著性增加；安徽六安、貴州鎮(zhèn)遠(yuǎn)地區(qū)的多花黃精葉綠素a含量顯著增加，貴州鎮(zhèn)遠(yuǎn)地區(qū)的多花黃精葉片總?cè)~綠素含量顯著增加。遮蔭后，葉綠素a含量、總?cè)~綠素含量最高的為安徽涇縣，分別為2.89、3.92 mg/g，廣西宜州次之，含量最低的為江西修水。遮蔭后，浙江仙居地區(qū)的多花黃精葉綠素a和總?cè)~綠素含量極顯著降低；其余地區(qū)遮蔭前后變化不大。

表2 多花黃精耐蔭性指標(biāo)含量分析及隸屬函數(shù)值評(píng)價(jià)

遮蔭后，多花黃精種內(nèi)葉綠素b含量總體略有下降，其中浙江仙居地區(qū)的多花黃精葉片葉綠素b含量極顯著降低，但安徽池州、安徽青陽(yáng)、安徽涇縣地區(qū)的多花黃精葉綠素b含量極顯著增加，廣西宜州、貴州鎮(zhèn)遠(yuǎn)地區(qū)的多花黃精葉綠素b含量顯著增加。遮蔭后，葉綠素b含量最高的為安徽涇縣(1.04 mg/g)，廣西宜州次之(1.02 mg/g)，含量最低的為浙江仙居(0.28 mg/g)。

遮蔭后，安徽青陽(yáng)、安徽涇縣、江西修水、浙江天臺(tái)4個(gè)地區(qū)的多花黃精葉綠素a/b值極顯著降低，葉綠素a/b值最小的是江西修水(2.28)，葉綠素a/b值最大的是湖北咸寧(3.36)。其他地區(qū)的多花黃精a/b值均增加，其中10個(gè)地區(qū)的多花黃精a/b值達(dá)顯著水平，其余不顯著。

2.1.2 遮蔭對(duì)黃精的葉綠素含量的影響 遮蔭后黃精葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量的種內(nèi)變異系數(shù)增大，且變異系數(shù)均＞20%，而葉綠素a/b值變異系數(shù)減少（表3）。遮蔭后，黃精葉綠素a含量、總?cè)~綠素總體呈增加趨勢(shì)。其中陜西略陽(yáng)、陜西寧強(qiáng)地區(qū)的黃精葉綠素a含量、總?cè)~綠素均極顯著增加。遮蔭后，葉綠素a含量、總?cè)~綠素含量最高的為河南靈寶寺河村，分別為2.46、3.27 mg/g；陜西寧強(qiáng)次之；含量最低的為河南南召，其葉綠素a含量、總?cè)~綠素含量顯著降低；其余地區(qū)遮蔭前后變異不大。

表3 黃精耐蔭性指標(biāo)含量分析及隸屬函數(shù)值評(píng)價(jià)

遮蔭后，黃精種內(nèi)陜西寧強(qiáng)地區(qū)的葉片葉綠素b含量呈極顯著性增加，河南南召、陜西安康地區(qū)的葉片葉綠素b含量顯著降低，其他地區(qū)略有增減，但不顯著。遮蔭后葉綠素b含量最高的為河南靈寶寺河村、河南靈寶蘇村(0.81 mg/g)，陜西寧強(qiáng)次之為(0.79 mg/g)，含量最低的為河南南召(0.40 mg/g)。

遮蔭后，除河南靈寶蘇村地區(qū)的黃精外，其余黃精葉綠素a/b值均有所增加，其中河南魯山、陜西略陽(yáng)、陜西安康地區(qū)呈極顯著性增加。葉綠素a/b值最小的是河南靈寶蘇村(2.28)，葉綠素a/b值最大的是陜西安康(3.36)。

2.1.3 多花黃精和黃精的耐蔭性分析 由表4可知，未遮蔭條件下，多花黃精和黃精間的葉綠素b含量、葉綠素a/b值無(wú)顯著性差異，而葉綠素a含量存在極顯著差異(P＜0.01)，總?cè)~綠素含量存在顯著差異(P＜0.05)；遮蔭處理后，葉綠素a含量、葉綠素b含量、總?cè)~綠素含量和葉綠素a/b值均無(wú)顯著性差異。

表4 2種黃精種質(zhì)資源耐蔭性狀方差分析

植物的耐蔭性是指植物在弱光條件下的生存能力，在遮蔭條件下2種黃精的葉綠素a含量、葉綠素b含量、總?cè)~綠素含量、葉綠素a/b值都發(fā)生不同程度的變化，因此綜合多個(gè)指標(biāo)的隸屬函數(shù)法評(píng)價(jià)2個(gè)黃精種的耐蔭性。多花黃精種內(nèi)，安徽池州、安徽青陽(yáng)、安徽涇縣、廣西宜州、貴州鎮(zhèn)遠(yuǎn)、江西修水地區(qū)的種質(zhì)耐蔭性較強(qiáng)，耐蔭性綜合評(píng)定值分別為0.51、0.65、0.63、0.65、0.51、0.52（表2）；黃精種內(nèi)，河南靈寶寺河村、河南靈寶蘇村、陜西寧強(qiáng)地區(qū)的種質(zhì)耐蔭性較強(qiáng)，耐蔭性綜合評(píng)定值分別為0.50、0.54、0.51（表3）?？傮w來(lái)看，多花黃精的耐蔭性綜合評(píng)定平均值為0.43，略大于黃精的耐蔭性綜合評(píng)定平均值0.42，兩者耐蔭性差異??；在所有黃精種質(zhì)資源中，來(lái)自安徽青陽(yáng)和廣西宜州的多花黃精種質(zhì)耐蔭性最優(yōu)。

2.2 多花黃精和黃精抗寒性分析

2.2.1 抗寒性指標(biāo)含量分析 由表5可知，2種黃精各抗寒性指標(biāo)的種內(nèi)變異性大，變異系數(shù)均≥40%。

表5 2種黃精種質(zhì)資源的抗寒性指標(biāo)含量分析及隸屬函數(shù)值評(píng)價(jià)

多重比較發(fā)現(xiàn)，同一種內(nèi)不同地區(qū)的黃精可溶性糖、游離蛋白、脯氨酸、MDA含量存在顯著性差異。多花黃精中，可溶性糖、游離蛋白、脯氨酸、MDA含量最高的地區(qū)分別是廣西宜州(2.06%)、貴州銅仁(7.20%)、浙江仙居(17.07%)、貴州銅仁(52.23%)，約為各對(duì)應(yīng)指標(biāo)最低含量的10、51、9、25倍。黃精中，可溶性糖、游離蛋白、脯氨酸、MDA含量最高的地區(qū)分別是河南靈寶蘇村(2.55%)、陜西安康(3.97%)、河南靈寶寺河村(29.41%)、河南靈寶蘇村(33.71%)，約為各對(duì)應(yīng)指標(biāo)最低含量的4、9、9、5倍。此外，黃精的可溶性糖、游離蛋白、脯氨酸、MDA含量平均值均大于多花黃精。

2.2.2 2個(gè)黃精種間抗寒性差異分析 由表6可知，在4℃時(shí)，多花黃精和黃精間的可溶性糖、游離蛋白、脯氨酸含量無(wú)顯著性差異，MDA含量存在顯著差異。

表6 抗寒性狀方差分析

利用隸屬函數(shù)法綜合評(píng)價(jià)2種黃精的抗寒性強(qiáng)弱。多花黃精種內(nèi)，云南大理地區(qū)的綜合評(píng)定值最高，為0.56；江西修水、浙江天臺(tái)分別次之，為0.54、0.53。黃精種內(nèi)，河南靈寶寺河村的綜合評(píng)定值最高，為0.62，甘肅隴南次之，為0.55?？傮w來(lái)看，黃精的抗寒性綜合評(píng)定平均值為0.41，略大于多花黃精的抗寒性綜合評(píng)定平均值0.38；在所有種質(zhì)中，河南靈寶寺河村的黃精抗寒性最佳。

3 結(jié)論與討論

遮蔭條件下，葉綠素含量的增加和葉綠素a/b的下降是植物對(duì)弱光利用能力增強(qiáng)的重要指標(biāo)[17]。植物葉綠素a對(duì)紅光的吸收能力強(qiáng)，植物葉綠素b對(duì)藍(lán)紫光的吸收能力強(qiáng)，在弱光條件下，植物冠層下部的紅光比例較低，因此葉綠素b在蔭蔽條件下可捕獲更多的光能。梁文斌等[17]研究發(fā)現(xiàn)葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量隨著遮蔭程度的增強(qiáng)而上升，而葉綠素a/b則下降。本研究中，遮蔭后總?cè)~綠素含量上升，此結(jié)果與已報(bào)道研究一致；但遮蔭后多數(shù)多花黃精和黃精的葉綠素a/b值卻上升。楊渺[18]研究發(fā)現(xiàn)，隨著遮蔭梯度的加大，a/b值減小，但在時(shí)間尺度上，隨著植物對(duì)低光環(huán)境的適應(yīng)，葉綠素a/b的比值增加，即在所增加的葉綠素總量中，葉綠素a所占比重大；而且葉綠素a是光合作用中真正的光化學(xué)反應(yīng)場(chǎng)所，這顯示了植株對(duì)遮蔭環(huán)境較強(qiáng)的適應(yīng)能力。王迅等[19]也指出，短期的遮蔭葉綠素a/b值會(huì)降低，長(zhǎng)期的遮蔭則會(huì)使葉綠素a/b的值增加。因此推測(cè)遮蔭后黃精葉綠素a/b值的上升與其長(zhǎng)時(shí)間的遮蔭有關(guān)。此外，多花黃精的耐蔭性略優(yōu)于黃精的耐蔭性，推測(cè)原因是多花黃精主要分布于秦嶺淮河以南，黃精主要分布于秦嶺淮河以北，南部全年的日照時(shí)間更短、日照輻射量更小，更適合耐蔭植物的生長(zhǎng)。劉春濤[20]、陳吉祥[21]、江廷均[22]等指出楠木、魔芋、茶樹(shù)等耐蔭植物，需要較短的日照時(shí)長(zhǎng)及較弱的光照強(qiáng)度，否則會(huì)影響正常的生長(zhǎng)。

李富生等[23-25]研究發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的降低，游離脯氨酸、游離蛋白、可溶性糖、MDA的含量都相應(yīng)增加?？扇苄蕴?、可溶性蛋白、游離脯氨酸是細(xì)胞內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能增強(qiáng)細(xì)胞的保水能力以及起到保護(hù)生物膜的作用[26]；MDA含量的增加，表明在低溫脅迫時(shí)產(chǎn)生了膜脂氧化作用[25]。本研究中，可溶性糖、游離蛋白、脯氨酸含量高且MDA含量低的地區(qū)，具有較高的抗寒性綜合評(píng)定值，符合上述規(guī)律?？傮w上黃精的抗寒性略優(yōu)于多花黃精的抗寒性，可能是本研究中所用多花黃精來(lái)自于安徽、廣西、廣東、貴州、湖北、湖南、江西、云南、浙江等地，均在秦嶺—淮河線以南；而黃精來(lái)自于河南、陜西、甘肅等地，分布在秦嶺—淮河線以北。秦嶺—淮河線以北的地區(qū)1月平均氣溫＜0℃，秦嶺—淮河線以南的地區(qū)1月平均氣溫＞0℃，因此主要分布在北方的黃精相比于多花黃精，更能適應(yīng)低溫的環(huán)境，擁有更好的抗寒能力。

植物的耐蔭性、抗寒性會(huì)受到多種因素的影響，不同物種或種質(zhì)材料對(duì)不同指標(biāo)的響應(yīng)規(guī)律不一定相同，為全面評(píng)價(jià)植物的耐蔭性、抗寒性強(qiáng)弱，隸屬函數(shù)法可以消除用單一指標(biāo)鑒定的片面性。根據(jù)綜合評(píng)價(jià)結(jié)果，安徽青陽(yáng)、安徽涇縣、廣西宜州3個(gè)地區(qū)的多花黃精種質(zhì)耐蔭性最優(yōu)，可用于選育耐蔭性品種；云南大理、江西修水、浙江天臺(tái)地區(qū)的多花黃精和河南靈寶寺河村、甘肅隴南地區(qū)的黃精可作為選育抗寒性品種。

運(yùn)用科學(xué)、合理的評(píng)價(jià)方法篩選黃精優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源，是黃精種質(zhì)資源研究的核心內(nèi)容。本研究收集了全國(guó)多個(gè)地區(qū)的黃精種質(zhì)資源，進(jìn)行統(tǒng)一種植、規(guī)范管理，為后續(xù)試驗(yàn)提供材料，同時(shí)可對(duì)黃精種植的道地性進(jìn)行研究。種植于略陽(yáng)GAP基地的各黃精種質(zhì)，由于環(huán)境條件與原產(chǎn)地不同，生長(zhǎng)狀況各異，廣西、貴州、云南、浙江等地區(qū)的種質(zhì)果實(shí)未能成熟；滇黃精在當(dāng)?shù)厣L(zhǎng)發(fā)育周期緩慢。本研究采取多個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)，并統(tǒng)一采用隸屬度函數(shù)法對(duì)黃精的耐蔭性及抗寒性做出綜合評(píng)價(jià)。對(duì)比耐蔭性和抗寒性評(píng)價(jià)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沒(méi)有共有的優(yōu)良種質(zhì)。試驗(yàn)應(yīng)選擇多類(lèi)評(píng)價(jià)指標(biāo)和評(píng)價(jià)方法對(duì)黃精種質(zhì)資源進(jìn)行評(píng)價(jià)，因此亟需建立一套合理、準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)體系。

黃精種質(zhì)資源庫(kù)、道地產(chǎn)區(qū)的建立能進(jìn)一步了解黃精，科學(xué)合理地栽培黃精。但種質(zhì)資源信息庫(kù)建立需要大量的數(shù)據(jù)與材料，是一項(xiàng)長(zhǎng)期的、繁重的工作。此外黃精種質(zhì)資源的研究應(yīng)立足于多方向的綜合研究，如黃精多糖、黃酮、皂苷等物質(zhì)的活性研究，黃精重要代謝通路中基因的表達(dá)及功能研究，黃精功能食品和保健食品的研發(fā)等。