外源茉莉酸甲酯和赤霉素對茜草生長、相關酶活性及主要活性成分含量的影響研究

彭 亮，羅 瑤，李 翡，沈 霞，周可心，顏永剛，張健健，胡本祥1, ，楊冰月*

外源茉莉酸甲酯和赤霉素對茜草生長、相關酶活性及主要活性成分含量的影響研究

彭 亮1, 2，羅 瑤1, 2，李 翡3，沈 霞1, 2，周可心1, 2，顏永剛1. 2，張健健4，胡本祥1, 4，楊冰月1, 2*

1. 陜西中醫(yī)藥大學藥學院/陜西省秦嶺中草藥應用開發(fā)工程技術研究中心，陜西 西安 712046 2. “秦藥”研發(fā)重點實驗室，陜西 西安 712046 3. 陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712000 4. 陜西國際商貿學院，陜西 西安 712046

以茜草為研究對象，探討施加外源不同濃度茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）和赤霉素（gibberellins，GA3）對茜草幼苗生長、相關酶活性及主要活性成分含量的影響。取大小一致的1月齡茜草實生苗轉入霍格蘭營養(yǎng)液中培養(yǎng)30 d后，分別添加不同濃度的MeJA（25、50、100、150 μmol/L）和GA3（50、100、200、400 mg/L）繼續(xù)培養(yǎng)7 d，測定茜草的地上、地下部分長度和干鮮質量、滲透調節(jié)物質含量、抗氧化酶活性及5種主要活性成分的含量。在所選擇濃度范圍內，MeJA對茜草幼苗生長的影響為低濃度促生，高濃度抑制；GA3的影響則表現(xiàn)為低濃度抑制，高濃度促生。生理活性方面，50 μmol/L MeJA和400 mg/L GA3處理下，葉綠素、游離脯氨酸和總蛋白含量顯著增高；過氧化物酶（peroxidase，POD）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）活性因激素種類及濃度而呈差異性，150 μmol/L MeJA和50 mg/L GA3處理下活性較強。MeJA和GA3的濃度對茜草活性成分積累影響很大，50～150 μmol/L MeJA可以顯著促進茜草幼苗中茜草素、羥基茜草素、1,8-二羥基蒽醌、甲基異茜草素和大葉茜草素的積累，且隨著MeJA濃度的增加促進作用越強（＜0.05）；200、400 mg/L GA3處理可以明顯增強活性成分的積累（＜0.05）。茜草幼苗的生長發(fā)育、生理活性及主要活性成分的積累受外源MeJA和GA3濃度的影響，50 μmol/L MeJA和400 mg/L GA3誘導能夠顯著提高茜草幼苗生物量及促進茜草幼苗中茜草素、羥基茜草素、1,8-二羥基蒽醌、甲基異茜草素和大葉茜草素的積累。

茜草；茉莉酸甲酯；赤霉素；抗氧化酶；滲透調節(jié)物質；茜草素；羥基茜草素；1,8-二羥基蒽醌；甲基異茜草素；大葉茜草素

茜草L.為茜草科（Rubiaceae）茜草屬植物，其干燥根及根莖是我國傳統(tǒng)大宗藥材之一，始載于《神農本草經》，具有涼血、祛瘀、止血、通經等功效[1-2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，茜草有止血、抗腫瘤、抗癲癇、抗病毒、抗微生物和保肝作用[3]，主要活性物質為蒽醌及其苷類、萘醌及其苷類、香豆素類和三萜類等[4]。茜草分布廣泛，主產于陜西、河南、安徽、河北、山東等省，以陜西、河南出產者量大且質優(yōu)，現(xiàn)為15種陜西省“秦藥”區(qū)域特色中草藥品種之一[5]。近年來，隨著茜草化學成分、藥理活性研究的深入及臨床應用的增加，其市場需求量增大，然而流通的茜草藥材仍以野生品為主，僅在陜西、河南等地有少量人工種植[6-7]。茜草受環(huán)境，遺傳及生長年限等因素影響，不同產地及來源藥材品質差異性較大[8]。課題組前期已開展茜草野生變家種，種子質量標準，指紋圖譜，轉錄組學等研究[9-11]，在此基礎上借鑒外源激素可以提高藥材產量和促進有效成分積累這一有效手段[12]，篩選激素的種類和濃度，以非生物誘導子的方式外源添加給茜草，對改善茜草藥材品質具有一定的研究價值。

茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）和赤霉素（gibberellins，GA3）作為2種非常重要的植物激素，參與調節(jié)高等植物的多種生理事件并發(fā)揮重要作用[13-14]。研究證實，施加MeJA和GA3會誘導植物的生長發(fā)育、滲透調節(jié)物質、抗氧化酶活性和次生代謝產物積累發(fā)生一系列的變化，原因與外源激素使植物處于脅迫環(huán)境而致體內積累大量活性氧和MDA有關。如胡正平等[15]用MeJA處理川續(xù)斷幼苗后，指出150 μmol/L MeJA可以顯著提高川續(xù)斷皂苷Ⅵ的積累，且SOD等活性發(fā)生相應變化。Hou等[16]用MeJA處理丹參和絨毛栗色鼠尾草的毛狀根后，發(fā)現(xiàn)丹參酮類成分的含量明顯增加。GA3處理可以迅速打破重樓根莖的休眠且誘導生芽[17]，對丹參種苗生長也有促進作用[18]，在增加太子參根長度的同時降低了其直徑[19]。茜草方面，Bulgakov等[20]研究表明，1 μmol/L和10 μmol/L MeJA處理雖然使茜草愈傷組織生物量顯著降低，但蒽醌類成分卻明顯增加；Fan等[21]研究發(fā)現(xiàn)采用10 μmol/L MeJA處理可以提高茜草懸浮細胞中紅紫素的含量。然而，MeJA和GA3作為用來促進藥用植物生長和次生代謝產物積累的2種有效激素，外源施加對茜草植株的生長發(fā)育及茜草素等主要活性成分的影響尚待研究?；诖?，本研究以茜草為材料，研究MeJA和GA3對茜草生長發(fā)育、葉綠素含量、滲透調節(jié)物質、抗氧化酶系統(tǒng)及茜草素等主要活性成分的影響，旨在為通過外源激素改善茜草藥材品質提供參考。

1 儀器、試劑與材料

1.1 儀器

電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；Waterse-2695高效液相色譜儀、Waters 2998檢測器（美國waters公司）；KQ-200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；XS-02型多功能高速粉碎機（上海兆申科技有限公司）；SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；FA2104型十萬分之一電子分析天平（上海民橋精密科學儀器有限公司）；酶標儀A-5082（Tecan Austrla Gmbh Untersbergetr公司）。

1.2 試劑

對照品茜草素（批號AF20082801）、大葉茜草素（批號AF20071951）、羥基茜草素（AF20032706）、1,8-二羥基蒽醌（批號AF21012620）、甲基異茜草素（批號AF21020862）均購自成都埃法生物科技有限公司（質量分數(shù)≥98%）；色譜純乙腈、甲醇（賽默飛世爾科技有限公司）；總蛋白（total protein，TP）、總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測試盒（批號分別為20210414、20210418、20200102、20210419、20210417）、96孔板，均購于南京建成生物工程研究所；純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）；其他試劑均為分析純（天津市天力化學試劑有限公司）。

1.3 材料

供試的茜草種子采集于陜西省王益區(qū)，由第四次全國中藥資源普查王益區(qū)普查隊提供，經陜西中醫(yī)藥大學藥學院胡本祥教授鑒定為茜草L.的成熟種子。

2 方法

2.1 種苗培養(yǎng)

選取優(yōu)質飽滿、大小基本一致的茜草種子，流水下沖洗24 h，10% H2O2浸泡消毒15 min，蒸餾水沖洗干凈，擦拭種子表面多余水分后均勻撒入吸飽水的塑料盆（30 cm×35 cm，裝滿有機質土）中，上面覆蓋約0.5 cm薄土，表面噴灑適量水，置于組培室中模擬室溫環(huán)境下進行育苗培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度25 ℃、光照時間8 h/d。

2.2 幼苗水培

選取“2.1”項下培養(yǎng)至10 cm左右高度且大小一致的茜草幼苗進行移栽，移栽至放有珍珠巖的塑料盆（27 cm×16 cm×7 cm）中進行水培，1/2 Hogland營養(yǎng)液培養(yǎng)1周后轉至Hogland營養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)3周，營養(yǎng)液刻度線處于盆高度的2/3，在此期間注意營養(yǎng)液的補充和更換，培養(yǎng)條件為溫度25 ℃、光照時間8 h/d。

2.3 外源添加MeJA和GA3處理

茜草幼苗水培4周后，于Hogland營養(yǎng)液中添加MeJA，至終濃度為25、50、100、150 μmol/L；添加GA3，至終質量濃度為50、100、200、400 mg/L，純Hogland營養(yǎng)液作為對照（CK），每處理3次重復（12株茜草/盆），在此期間注意營養(yǎng)液的補充和更換，培養(yǎng)7 d后取樣。

2.4 測定指標及方法

2.4.1 生長指標 每盆隨機選取5株茜草（每濃度處理共15株），使用數(shù)顯游標卡尺測定地上和地下部分長度，精確度為0.01 cm；稱取地上、地下部分鮮質量，經過105 ℃（30 min）殺青后于60 ℃烘箱進行干燥，稱取干質量，精確度均為0.01 g。

2.4.2 生理指標 葉綠素含量測定采用乙醇－丙酮混合液浸泡法[22]，單位表示為mg/g；POD活性測定采用比色法，SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法，CAT活性采用鉬酸銨法，MDA含量采用TBA法，游離脯氨酸（free proline，PRO）含量測定采用酸性茚三酮法，TP含量采用考馬斯亮藍法測定，具體操作步驟按照試劑盒說明書進行。

2.4.3 供試品溶液制備 精密稱取藥材粉末（過6號篩）約1.0 g，置于50 mL三角瓶中，加入60%甲醇20 mL，稱定質量，加熱回流30 min，待冷卻至室溫后再次稱定質量并補足減失的質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液于25 mL量瓶中并定容至刻度，進樣前過0.22 μmol/L微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.4.4 對照品溶液制備 分別精密稱取茜草素對照品3.10 mg、羥基茜草素對照品2.90 mg、甲基異茜草素對照品2.30 mg、1,8-二羥基蒽醌對照品2.50 mg、大葉茜草素對照品2.80 mg，置于容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，臨進樣前用0.22 μmol/L微孔濾膜過濾，即得含茜草素 0.31 mg/mL、羥基茜草素0.29 mg/mL、甲基異茜草素0.23 mg/mL、1,8-二羥基蒽醌對照品0.25 mg/mL、大葉茜草素0.28 mg/mL對照品溶液。

2.4.5 色譜條件 色譜柱Agilent 5 TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.1%磷酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～5 min，21%～40% B；5～10 min，40%～45% B；10～15 min，45%～45% B；15～25 min，45%～63% B；25～35 min，63% B；35～50 min，63%～80% B；50～60 min，80%～85% B；60～65 min，85%～100% B）；體積流量為1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量10 μL，檢測波長為240 nm。

2.4.6 線性關系考察 取茜草素、羥基茜草素、甲基異茜草素、1,8-二羥基蒽醌及大葉茜草素混合對照品溶液，分別進樣5、10、15、20、25 μL，按上述色譜條件注入色譜儀，記錄峰面積，分別以各成分的峰面積（）對進樣量（）作回歸分析，計算回歸方程，見表1。

表1 5種主要活性成分的線性關系考察結果

Table 1 Linear regression equation of five main active components

化合物回歸方程r線性范圍/μg 茜草素Y＝1 690 509 X＋156 9260.999 51.55～7.75 羥基茜草素Y＝1 692 056 X＋237 0500.999 91.45～7.25 甲基異茜草素Y＝1 676 233 X＋978 9470.999 91.15～5.75 1,8-二羥基蒽醌Y＝1 308 256 X－342 3010.999 51.25～6.25 大葉茜草素Y＝1 547 538 X＋427 8280.999 61.40～7.00

2.4.7 精密度試驗 精密吸取“2.4.4”項下的混合對照品溶液，分別連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，計算相對標準偏差。結果表明，各個對照品的峰面積比值RSD均小于2%，表明儀器精密度較好。

2.4.8 重復性試驗 取6份茜草藥材粉末在相同條件下平行制備供試品溶液，按上述色譜條件分析。結果表明，各特征峰的相對保留時間RSD均小于2%，各特征峰的峰面積比值RSD均小于3%。

2.4.9 穩(wěn)定性試驗 取6份茜草粉末制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、16、24 h進樣。結果表明，茜草粉末各特征峰的相對保留時間RSD均小于1%，各特征峰的峰面積值RSD均小于3%。

2.4.10 加樣回收率試驗 精密稱取茜草粉末樣品0.05 g，置具塞離心管中，平行6份，分別加入一定體積的對照品溶液，精密加入50%甲醇（含0.5%甲酸）5 mL，按照“2.4.3”項方法制備供試品溶液，在“2.4.5”項條件下平行進樣分析，計算回收率和RSD值。結果茜草素、羥基茜草素、甲基異茜草素、1,8-二羥基蒽醌及大葉茜草素的平均回收率分別為102.56%、98.89%、100.87%、100.02%、99.06%，RSD值分別為2.30%、0.66%、2.00%、0.96%、1.00%。

2.5 數(shù)據處理

采用Microsoft Excel 2013軟件對數(shù)據進行處理，測定結果表示為形式，用SPSS19.0軟件進行方差分析，Duncan法進行多重比較分析，Original 2019b繪圖。

3 結果與分析

3.1 MeJA和GA3對茜草幼苗生長的影響

由表2可知，外源添加MeJA對茜草幼苗的影響表現(xiàn)為低濃度促生，高濃度抑制。50 μmol/Lol/L MeJA處理組對茜草幼苗的促生作用最大，除地下部分長度外，其余生長指標與CK組差異顯著（＜0.05），地上部分長度、地上部分鮮/干質量、地下部分鮮/干質量分別增加了20.09%、52.49%、107.11%、46.67%、27.28%；而150 μmol/L MeJA（T5）處理組對茜草幼苗的抑制作用最強，地上部分長度、地下部分長度、地上部分鮮/干質量分別較CK組降低了18.53%、20.24%、66.15%、33.50%。另一方面，GA3對茜草幼苗的影響則在實驗所選濃度范圍內表現(xiàn)為高濃度促進生長，400 mg/L GA3（T9）能夠顯著提高茜草幼苗的各項生長指標，與CK組相比差異顯著（＜0.05），地上部分長度、地下部分長度、地上部分鮮/干質量、地下部分鮮/干質量分別增加了24.65%、19.59%、91.98%、242.29%、119.08%、298.18%。說明MeJA和GA3作為常用的植物外源激素影響茜草的生長發(fā)育，當質量濃度合適時，可用來提高茜草的生物量。

3.2 MeJA和GA3對茜草幼苗葉片葉綠素和滲透調節(jié)物質含量的影響

添加外源MeJA和GA3后，茜草幼苗的葉綠素含量因外源激素的種類和濃度不同而呈現(xiàn)差異性（圖1）。其中，MeJA處理下茜草幼苗葉片葉綠素含量隨激素濃度的增加表現(xiàn)為先上升后降低，總葉綠素含量在50 μmol/L MeJA（T3）處理時達到最大值，為CK組的1.27倍。GA3處理下茜草幼苗葉片葉綠素含量則表現(xiàn)為隨激素濃度的增加逐漸升高，總葉綠素含量在400 mg/L GA3（T9）處理時達到最大值，為CK組的1.26倍?？芍?，添加適當濃度的MeJA和GA3可以提高茜草幼苗的光合能力，但MeJA濃度過高會抑制茜草幼苗葉片的光合系統(tǒng)。

游離脯氨酸和蛋白作為植物體內的滲透調節(jié)物質，在植物遭受外源刺激的時候可以發(fā)揮重要的生理活性[23]。由圖2可知，茜草幼苗中PRO和TP的含量隨著MeJA質量濃度的增加表現(xiàn)為先上升后下降，在50 μmol/L MeJA（T3）處理組達到最高點，分別為CK組的1.62倍和1.87倍（＜0.05）。不同于MeJA，茜草幼苗中PRO和TP的含量隨著GA3質量濃度的增加不斷增高，在400 mg/L GA3（T9）處理組達到最大值，分別為CK組的1.27倍和2.04倍（＜0.05）?？芍?，由于外源激素的刺激，茜草幼苗體內會通過積累脯氨酸和蛋白質以適應外在環(huán)境變化，且因刺激源不同而表現(xiàn)出差異。

表2 不同濃度MeJA和GA3處理下茜草幼苗生長情況

Table 2 Growth of R. cordifolia seedlings under MeJA and GA3 with different concentrations

編號處理地上長度/cm地下長度/cm地上鮮質量/g地上干質量/g地下鮮質量/g地下干質量/g T1CK48.68±3.92c11.66±1.01c2.69±0.28cd0.51±0.04d0.87±0.08c0.11±0.01d T225 μmol/L MeJA53.92±4.82bc8.88±0.92d2.62±0.43cd0.59±0.13d1.10±0.13b0.11±0.02d T350 μmol/L MeJA58.46±5.52ab12.30±1.78bc4.11±0.29ab1.05±0.15bc1.44±0.13b0.14±0.02c T4100 μmol/L MeJA39.86±6.62d8.60±0.37d1.64±0.14de0.52±0.06d0.65±0.22d0.06±0.01e T5150 μmol/L MeJA39.66±1.55d9.30±0.82d0.91±0.18e0.34±0.05e0.86±0.05c0.09±0.01d T650 μmol/L GA328.64±2.94e8.88±1.42d1.03±0.10e0.27±0.06e0.41±0.06e0.09±0.03d T7100 μmol/L GA342.28±3.05d12.68±0.58abc2.01±0.12de0.68±0.08d 0.99±0.10bc0.15±0.04c T8200 μmol/L GA348.24±4.17c13.30±0.60ab3.49±0.22bc1.27±0.18ab1.85±0.18a0.30±0.05b T9400 μmol/L GA360.68±10.55a11.06±2.26a5.17±0.97a1.73±0.32a1.91±0.21a0.44±0.06a

不同小寫字母表示處理間在0.05水平差異顯著，P＜0.05；下表同

Different lowercase letters indicate the significant difference among different MeJA and GA3 treatments at 0.05 level, P < 0.05; same as below

不同小寫字母表示處理間在0.05水平差異顯著，P＜0.05；下圖同

3.3 MeJA和GA3對茜草幼苗抗氧化酶活性和膜脂過氧化作用的影響

植物體內的抗氧化酶系統(tǒng)可以通過協(xié)同作用，將植物體內的H2O2轉化成H2O，以保持體內的活性氧在較低的水平上[19]。外源添加MeJA和GA3后，茜草幼苗POD活性的動態(tài)變化趨勢表現(xiàn)為隨著MeJA濃度的增加先降后增，150 μmol/L MeJA（T5）處理POD活性最大，為CK組的1.38倍（＜0.05）；GA3處理與MeJA不同，表現(xiàn)為逐漸降低，50 mg/L GA3（T6）處理組POD活性最大，與CK組同樣存在顯著性差異（＜0.05）（圖3-A）。茜草幼苗SOD活性隨MeJA和GA3質量濃度的增加呈現(xiàn)出逐漸增高的變化趨勢，并均在濃度最高點達到最高值，150 μmol/L MeJA（T5）處理是CK組的2.21倍（＜0.05），200 mg/L GA3（T8）處理組為CK的1.13倍（＜0.05）（圖3-A）。茜草幼苗CAT活性的動態(tài)變化趨勢與POD一致，150 μmol/L MeJA（T5）處理POD活性最大，為CK組的2.67倍（＜0.05）；50 mg/L GA3（T6）處理組CAT活性最大，為CK組的6.11倍（＜0.05）（圖3-B）。因此，茜草幼苗在遭受外源激素干擾產生過氧化傷害時，體內抗氧化酶活性會受到誘導而發(fā)生改變，從而發(fā)揮活性氧清除作用，以減輕過氧化傷害，其活性變化程度與外源激素的種類及濃度有關。

圖2 MeJA和GA3處理對茜草幼苗PRO和TP含量的影響

同時，外源添加MeJA后，茜草幼苗MDA含量隨著MeJA質量濃度的增加呈現(xiàn)先升后降，150 μmol/L MeJA（T5）處理組活性最低，比CK組降低了43.84%（＜0.05），50 μmol/L MeJA（T3）處理組活性最高，為CK組的1.47倍（＜0.05）（圖3-B）。添加GA3后，茜草幼苗MDA含量隨著GA3濃度增加而逐漸降低，400 mg/L GA3（T9）處理組比CK組降低了43.90%（＜0.05），50 mg/L GA3（T6）處理組則是CK組1.42倍（＜0.05）（圖3-B）。以上結果表明，外源添加MeJA或GA3后，會對茜草幼苗產生膜脂過氧化作用傷害，且與二者的濃度存在一定相關性。

圖3 MeJA和GA3處理對茜草幼苗SOD、POD (A) 和CAT、MDA (B) 的影響

3.4 MeJA對茜草幼苗中5種主要活性成分含量的影響

由圖4可知，除25 μmol/L MeJA（T2）處理組抑制1,8-二羥基蒽醌和大葉茜草素的積累外，外源添加50～150 μmol/L MeJA（T3～5）可以顯著促進茜草幼苗中5種主要活性成分的積累，且隨著MeJA質量濃度的增加促進作用越強，150 μmol/L MeJA（T5）處理下含量最高，茜草素、羥基茜草素、1,8-二羥基蒽醌、甲基異茜草素和大葉茜草素的含量分別為CK組的5.26、6.86、1.22、4.75、1.80倍（＜0.05）。

圖4 MeJA處理對茜草中茜草素、羥基茜草素、1,8-二羥基蒽醌、甲基異茜草素和大葉茜草素含量的影響

3.5 GA3對茜草幼苗中5種主要活性成分含量的影響

由圖5可知，GA3對茜草幼苗中5種主要活性成分積累的影響表現(xiàn)為低質量濃度抑制，高質量濃度促進。50 mg/L（T6）和100 mg/L（T7）GA3處理均明顯降低了茜草幼苗中茜草素、羥基茜草素、1,8-二羥基蒽醌、甲基異茜草素和大葉茜草素的含量，其中50 mg/L GA3（T6）相比CK組分別降低了50.50%、67.65%、67.84%、71.93%和71.93%（＜0.05）；200 mg/L（T8）和400 mg/L（T9） GA3處理則促進了茜草幼苗中5種活性成分的積累，除1,8-二羥基蒽醌外，其余4種成分與CK組相比差異顯著（＜0.05），其中400 mg/L GA3（T9）處理后茜草素、羥基茜草素、甲基異茜草素和大葉茜草素分別為CK組的2.65、2.98、1.44、1.33倍（＜0.05）。

圖5 GA3處理對茜草中茜草素、羥基茜草素、1,8-二羥基蒽醌、甲基異茜草素和大葉茜草素含量的影響

4 討論

植物激素屬于一類對植物生長發(fā)育有顯著作用的微量有機物質，在植物體內合成，常用的有生長素類、赤霉素類、茉莉酸類、細胞分裂素類和脫落酸類等[12]。大量研究表明，植物激素作為外源誘導子可以有效調節(jié)藥用植物的生長發(fā)育過程，具有增強抗逆與抗病性、提高產量、促進次生代謝產物積累等作用[24-25]。其中，茉莉酸化合物是普遍存在的激素植物，包括茉莉酸及其衍生物MeJA，MeJA在植物增強氧化應激、促進酶活性和次生代謝產物積累及相關基因表達水平等方面發(fā)揮著關鍵作用；GA的基本結構是赤霉烷，根據發(fā)現(xiàn)時間的先后命名為GA1、GA2、GA3等，GA3活性最大，能對植物生長和發(fā)育產生深遠而多樣的影響，MeJA和GA3通過調控藥用植物生長發(fā)育和次生代謝物積累，在藥材品質改善方面取得了一系列成果[26-27]。因此，通過外源施加MeJA和GA3考察茜草的生長發(fā)育情況，分析其生理特性及主要活性成分積累變化，可為茜草人工種植過程中植物激素的使用提供參考。

藥用植物的生長發(fā)育與其品質密切相關，也是中藥材種植過程中的重要考慮指標。本研究結果表明，MeJA和GA3對茜草幼苗生長發(fā)育的作用受濃度影響較大，前者為低濃度促生，高濃度抑制，后者則剛好相反。外源施加50 μmol/L MeJA（T3）和400 mg/L GA3（T9）能夠促進茜草幼苗的各項生長指標，與對照組相比，地上、地下部分長度和鮮干質量顯著增加（＜0.05）。說明MeJA和GA3作為常用的植物外源激素，能夠影響茜草的生長發(fā)育，當質量濃度合適時，可用來提高茜草的產量，與在丹參[18]、太子參[19]等的研究結果一致。

葉綠素含量是脅迫環(huán)境下植物耐受性的重要指標之一，添加MeJA和GA3后，茜草幼苗葉綠素含量隨著前者濃度的增加先增后降，50 μmol/L MeJA（T3）處理下含量最高；GA3處理則表現(xiàn)為質量濃度越高葉綠素含量越高，400 mg/L GA3（T9）處理組含量最高?？芍?，高質量濃度MeJA和低質量濃度GA3會導致茜草葉片內葉綠素含量顯著降低。滲透調節(jié)物質游離脯氨酸和蛋白的含量隨著MeJA質量濃度的增加先上升后下降，而隨著GA3質量濃度的增加不斷增高，推測原因為茜草幼苗的生理特征應對脅迫作用時的反應存在激素種類與濃度差異性。

外源添加MeJA和GA3會使植物處于脅迫環(huán)境而遭受傷害，此時植物體內的POD、SOD和CAT等抗氧化酶往往通過協(xié)同作用來有效緩解這種脅迫傷害。如李潔等[28]研究發(fā)現(xiàn)隨著MeJA濃度的增大，遠志愈傷組織中SOD、CAT、POD活性呈先上升后下降的趨勢。本研究中，茜草幼苗POD、CAT、SOD活性在MeJA和GA3處理中表達不同，且同一激素不同質量濃度間差異顯著，分析原因為在本實驗中MeJA和GA3質量濃度范圍內積累產生的超氧陰離子及過氧化物量未超過其體內抗氧化酶系統(tǒng)的清除能力，表現(xiàn)為MeJA誘導濃度越高抗氧化酶活性越強，而GA3低質量濃度抗氧化酶活性更強。MDA含量則隨著MeJA質量濃度的增加先升后降，隨GA3濃度的增加逐漸降低，可知MeJA或GA3濃度適當時，能夠通過減少MDA含量，和抗氧化酶系統(tǒng)一起協(xié)同調控植物體內活性氧代謝平衡，從而促進植株生長、增加茜草生物量。

國內外研究人員已在通過添加外源激素來提高藥用植物次生代謝產物積累，改善藥材品質和生產生物活性物質方面取得了一系列的研究進展，如通過MeJA處理甘西鼠尾草毛狀根后，發(fā)現(xiàn)丹酚酸B、迷迭香酸、隱丹參酮和丹參酮IIA等有效成分明顯高于對照組[29]；Li等[30]研究表明，GA3可以促進丹參毛狀根的生長，增加丹參酮和丹酚酸的含量。本研究中，外源添加不同濃度的MeJA和GA3能夠顯著影響茜草中5種主要活性成分的積累，二者均表現(xiàn)為低濃度抑制，高濃度促進，50 μmol/L～150 μmol/L MeJA（T3～T5）和200～400 mg/L（T8～T9） GA3處理可以顯著提高茜草素、羥基茜草素、甲基異茜草素、1,8-二羥基蒽醌和大葉茜草素的含量，其中150 μmol/L MeJA（T5）處理組羥基茜草素的含量是CK組的6.86倍（＜0.05）。與前人研究證實MeJA和GA3作為外源誘導子，可以促進相關成分積累量增加的結論一致，原因與次生代謝物生物合成途徑中關鍵酶基因和轉錄因子的表達量上調有關[29-30]。

綜上所述，外源MeJA和GA3刺激可以影響茜草幼苗生長發(fā)育、生理活性及主要有效成分的積累，且適當濃度可以顯著增加茜草生物量及大葉茜草素等有效成分的含量，為今后在茜草人工種植過程中通過外源誘導子改善藥材品質提供了一定的參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中國藥典[S]．一部. 2020: 245.

[2] 陳毅, 王海麗, 薛露, 等. 茜草的研究進展 [J]. 中草藥, 2017, 48(13): 2771-2779.

[3] Wang K, Gao L, Zhang Q,. Revealing the mechanisms and the material basis ofL. on abnormal uterine bleeding with uniting simultaneous determination of four components and systematic pharmacology approach-experimental validation [J]., 2020, 189: 113475.

[4] Hu Y Y, Zhang X J, Zhang Z H,. Qualitative and quantitative analyses of quinones in multi-originspecies by ultra-performance liquid chromatography- tandem mass spectrometry combined with chemometrics [J]., 2020, 189: 113471.

[5] 紀寶玉, 裴莉昕, 陳隨清, 等. 茜草藥材的HPLC指紋圖譜研究 [J]. 中國實驗方劑學雜志, 2013, 19(23): 87-90.

[6] He D B, Bai X, Ma Y H,. One new nucleoside and three furanpentanone derivatives from the aerial part ofL [J]., 2021, 41: 125-128.

[7] 喬玄, 趙麗, 張磊, 等. 陜西不同產地茜草HPLC指紋圖譜研究 [J]. 現(xiàn)代中醫(yī)藥, 2015, 35(1): 57-60.

[8] 王閩予, 何民友, 李國衛(wèi), 等. 不同產地茜草藥材UPLC指紋圖譜研究及化學計量學分析 [J]. 廣東藥科大學學報, 2020, 36(5): 609-614.

[9] 彭亮, 王媛媛, 黃濤, 等. ICP-MS法測定陜西不同產地野生茜草中9種重金屬元素 [J]. 中草藥, 2018, 49(6): 1418-1423.

[10] 彭亮, 張崗, 顏永剛, 等. 茜草轉錄組分析及其蒽醌類化合物合成相關基因的挖掘 [J]. 中草藥, 2018, 49(8): 1890-1896.

[11] 彭亮, 孫濤, 王媛媛, 等. 陜產茜草種子質量分級標準研究 [J]. 中南藥學, 2017, 15(9): 1224-1227.

[12] 樊建, 沈瑩, 鄧代千, 等. 植物生長調節(jié)劑在中藥材生產中的應用進展 [J]. 中國實驗方劑學雜志, 2022, 28(3): 234-240.

[13] Wu K, Xu H, Gao X H,. New insights into gibberellin signaling in regulating plant growth-metabolic coordination [J]., 2021, 63: 102074.

[14] Gutiérrez-Gamboa G, Pérez-álvarez E P, Rubio-Bretón P,. Changes on grape volatile composition through elicitation with methyl jasmonate, chitosan, and a yeast extract in Tempranillo (L.) grapevines [J]., 2019, 244: 257-262.

[15] 胡正平, 徐嬌, 周濤, 等. 茉莉酸甲酯對川續(xù)斷根中川續(xù)斷皂苷Ⅵ合成積累的影響 [J]. 藥學學報, 2021, 56(8): 2302-2307.

[16] Hou Z N, Li Y Y, Su F,. The exploration of methyl jasmonate on the tanshinones biosynthesis in hair roots ofBunge andf.Stib [J]., 2021, 167: 113563.

[17] Wang M L, Chen J Q, Zhang X D,. Gibberellin A3 induces polyaerial shoot formation and increases the propagation rate in Parisrhizomes [J]., 2021, 167: 113511.

[18] 馬俊瑩, 房海悅, 龍雪棟, 等. 不同質量濃度赤霉素對丹參種苗建成與藥材質量的影響 [J]. 東北林業(yè)大學學報, 2018, 46(8): 60-62.

[19] Zhang J Q, Zhou T, Zhang C,. Gibberellin disturbs the balance of endogenesis hormones and inhibits adventitious root development ofthrough regulating gene expression related to hormone synthesis [J]., 2021, 28(1): 135-147.

[20] Bulgakov V P, Tchernoded G K, Mischenko N P,. Effect of salicylic acid, methyl jasmonate, ethephon and cantharidin on anthraquinone production bycallus cultures transformed with the rolB and rolC genes [J]., 2002, 97(3): 213-221.

[21] Fan X, Hu G S, Li N,. Effects of lovastatin, clomazone and methyl jasmonate treatment on the accumulation of purpurin and mollugin in cell suspension cultures of[J]., 2013, 11(4): 396-400.

[22] 彭亮, 楊冰月, 張崗, 等. 干旱脅迫對遠志種子萌發(fā)及幼苗生長和生理特性的影響 [J]. 西北植物學報, 2018, 38(4): 741-749.

[23] Afzal I , Akram M W , Rehman H U,. Moringa leaf and sorghum water extracts and salicylic acid to alleviate impacts of heat stress in wheat[J]., 2019, 129: 169-174.

[24] Gee D M, La A, Rp A,. The role of methyl jasmonate in enhancing biomass yields and bioactive metabolites insp. (Bacillariophyceae) revealed by proteome and biochemical profiling [J].s, 2021, 249: 104381.

[25] K Zalewski, B Nitkiewicz, M Stolarski,. The influence of exogenous methyl jasmonate on the germination and, content and composition of flavonoids in extracts from seedlings of yellow and narrow-leafed lupine [J]., 2020, 87: 103398.

[26] Liu R, Wang Z R, Zheng J Y,. The effects of methyl jasmonate on growth, gene expression and metabolite accumulation inFort [J]., 2022, 177: 114482.

[27] Xie W, Han C, Zheng Z Q,. Determination of Gibberellin A3 residue in fruit samples by liquid chromatography-tandem mass spectrometry [J]., 2011, 127(2): 890-892.

[28] 李潔, 胡本祥, 彭亮, 等. 水楊酸和茉莉酸甲酯對遠志愈傷組織生長和相關酶活性及化學成分的影響 [J]. 中草藥, 2019, 50(12): 2976-2982.

[29] Li J, Li B, Luo L,. Increased phenolic acid and tanshinone production and transcriptional responses of biosynthetic genes in hairy root cultures ofMaxim. treated with methyl jasmonate and salicylic acid [J]., 2020, 47(11): 8565-8578.

[30] Li W R, Liu C F, Liu J L,. Transcriptomic analysis reveals the GRAS family genes respond to gibberellin inhairy roots [J]., 2020, 21(1): 727-740.

Effects of exogenous methyl jasmonate and gibberellins on growth, related enzyme activities and contents of active constituents of

PENG Liang1, 2, LUO Yao1, 2, LI Fei3, SHEN Xia1, 2, ZHOU Ke-xin1, 2, YAN Yong-gang1, 2, ZHANG Jian-jian4, HU Ben-xiang1, 4, YANG Bing-yue1, 2

1. Shaanxi Qinling Application Development and Engineerig Center of Chinese Herbal Medicine, College of Pharmacy, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xi’an 712046, China 2. Key Laboratory for Research of "Qin medicine"of Shaanxi Administration of Traditional Chinese Medicine, Xi’an 712046, China 3. Affiliated Hospital of Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712000, China 4. Shaanxi Institute of International Trade and Commerce, Xi’an 712046, China

To study the effects of exogenous methyl jasmonate (MeJA) and gibberellins (GA3) on seedling growth, related enzyme activities and the contents of main active components of.One-month-old seedlings ofwere cultured in Hoagland nutrient solution for 30 d, and then added with different concentrations of MeJA (25, 50, 100, 150 μmol/L) and GA3 (50, 100, 200, 400 mg/L) for 7 d, respectively. The length, dry and fresh weight, osmotic adjustment substance content, antioxidant enzyme activities and five main active components ofwere measured.The effect of MeJA on the growth ofseedlings was promoted by low concentration and inhibited by high concentration in the concentration range selected in this experiment. The effect of GA3 was inhibited by low concentration and promoted by high concentration. In physiological activities, the contents of chlorophyll, free proline and total protein increased significantly under 50 μmol/L MeJA and 400 mg/L GA3 treatment; The activities of POD, SOD, CAT and the content of MDA were different with the hormone types and concentrations. The activities were stronger under 150 μmol/L MeJA and 50 mg/L GA3 treatment. The concentration of MeJA and GA3 had a great influence on the accumulation of active components in. The accumulation of alizarin, purpurin, 1, 8-dihydroxyanthraquinone, rubiadin and mollugin was significantly promoted by 50—150 μmol/L MeJA in. seedlings, and the promotion was stronger with the increase of MeJA concentration (< 0.05); the accumulation of active components was significantly enhanced by 200 and 400 mg/L GA3 treatment (< 0.05).The growth, physiological activities and accumulation of main active components of.seedlings are affected by the concentration of exogenous MeJA and GA3. MeJA (50 μmol/L) and GA3 (400 mg/L) can significantly increase the biomass ofseedlings and promote the accumulation of alizarin, purpurin, 1,8-dihydroxyanthraquinone, rubiadin and mollugin inseedlings.

L.; methyl jasmonate; gibberellins; antioxidant enzyme; osmotic adjustment substance; alizarin; purpurin; 1,8-dihydroxyanthraquinone; rubiadin; mollugin

R286.2

A

0253 - 2670(2022)11 - 3463 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.11.024

2021-12-03

陜西省教育廳項目（19JK0225）；陜西省中醫(yī)藥管理局項目（2021-QYZL-02）；2018年醫(yī)療服務與保障能力提升補助資金（中醫(yī)藥事業(yè)傳承與發(fā)展部分）“全國中藥資源普查項目”（財社［2018］43號）；陜西中醫(yī)藥大學“秦藥”品質評價及資源開發(fā)學科創(chuàng)新團隊項目（2019-QN01）

彭 亮，博士，副教授，研究方向為中藥資源評價與利用，分子生藥學。E-mail: ppengliang@126.com

楊冰月，博士，副教授，研究方向為中藥品種、質量及資源開發(fā)。E-mail: 304951774@qq.com

[責任編輯 時圣明]