金黃色葡萄球菌RAA-LFD快速檢測方法的建立與應(yīng)用

后來旺，李達(dá)容，鄧 波，趙 勇,3,4，潘迎捷,3,4，豐東升，孫曉紅,3,4,*

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.上海市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，上海 201799；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（上海），上海 201306；4.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306）

隨著人們生活水平的提高，食品安全已成為一個引起廣泛關(guān)注的全球公共衛(wèi)生問題。金黃色葡萄球菌是一類可引起人類頭暈、腹瀉、惡心、嘔吐等急性腸胃炎的食源性致病微生物[1-2]，其污染的食品會給全球食品產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并對人類健康造成嚴(yán)重的威脅[3]。在我國每年發(fā)生的細(xì)菌性食物中毒事件中，金黃色葡萄球菌的檢出率高達(dá)25%，嚴(yán)重影響食品安全[4]。牛乳中存在金黃色葡萄球菌會破壞牛乳的營養(yǎng)組分，影響乳品質(zhì)量[5]。同時，飲用由金黃色葡萄球菌污染的牛乳會引起人體不適，進(jìn)而引發(fā)炎癥或中毒[6]。因此，開發(fā)準(zhǔn)確可靠的診斷方法是實現(xiàn)金黃色葡萄球菌動態(tài)監(jiān)測的重要保證。

目前國家標(biāo)準(zhǔn)對金黃色葡萄球菌檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”方法為微生物生化鑒定法[7-8]，可準(zhǔn)確檢測出引發(fā)食物中毒的病原微生物，該方法具有成本低廉、準(zhǔn)確度高等特點，但該方法存在步驟操作繁瑣，費時費力，不能檢測葡萄球菌腸毒素等問題。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）因其高靈敏度與特異性、反應(yīng)迅速等特點廣泛應(yīng)用于病原菌的檢測。Saka等[9]根據(jù)16S rRNA基因與耐熱核酸酶基因（nuc）建立PCR方法檢測乳制品中金黃色葡萄球菌，但PCR檢測方法需溫控設(shè)備和專業(yè)實驗室，這些條件限制了該方法在基層的應(yīng)用。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，多重交叉置換擴(kuò)增技術(shù)（multiple cross displacement amplification，MCDA）、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（loopmediated isothermal amplification，LAMP）等恒溫擴(kuò)增技術(shù)的出現(xiàn)彌補(bǔ)了PCR技術(shù)應(yīng)用的局限性，能在非實驗室環(huán)境條件下實現(xiàn)快速準(zhǔn)確檢測。MCDA因其操作簡單、產(chǎn)物質(zhì)量好且穩(wěn)定而被廣泛應(yīng)用于病原菌的檢測。Wang Yi等[10]建立MCDA能特異性鑒別出耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，但該方法存在起始模板量低時會引起擴(kuò)增偏差大等問題。LAMP可在恒溫條件下（65 ℃）擴(kuò)增目的基因，具有操作簡單、成本低、對設(shè)備要求低等特點被廣泛應(yīng)用。Tian Xiaolan等[11]建立了特異性檢測金黃色葡萄球菌的LAMP方法，但引物設(shè)計復(fù)雜，需要2～3 對引物，而且存在反應(yīng)時間長等缺點，無法滿足現(xiàn)場快速檢測和大規(guī)模監(jiān)測的需求。

重組酶等溫擴(kuò)增技術(shù)（recombinase aided amplification，RAA）主要是3種核心酶（重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白和DNA聚合酶）在適宜溫度條件發(fā)生酶促反應(yīng)，快速完成解鏈、配對與延伸實現(xiàn)DNA快速復(fù)制的一項分子生物學(xué)檢測技術(shù)[12]。該技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、反應(yīng)時間短、穩(wěn)定性好、對設(shè)備要求低等優(yōu)點，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用到病毒、細(xì)菌、支原體、寄生蟲等的快速檢測中[13-18]。側(cè)流層析試紙條（lateral flow dipstick，LFD）是一種可視化觀察擴(kuò)增產(chǎn)物的端點檢測技術(shù)，RAA擴(kuò)增的雙標(biāo)記產(chǎn)物通過抗原抗體結(jié)合作用，在檢測線位置形成“熒光素抗體-雙標(biāo)記核酸擴(kuò)增產(chǎn)物-膠體金復(fù)合體”，5 min后可直接肉眼觀察結(jié)果。結(jié)合RAA擴(kuò)增與LFD檢測技術(shù)的RAA-LFD方法具有良好的特異性與靈敏度、結(jié)果易讀、對設(shè)備與實驗操作人員要求低，適用于非實驗室環(huán)境的快速檢測，作為一種有力的監(jiān)測手段已廣泛應(yīng)用于病原微生物的早期監(jiān)測與排查、出入境快速檢疫與食品安全等眾多領(lǐng)域[19-22]。

本研究根據(jù)金黃色葡萄球菌高度保守的耐熱核酸酶基因（nuc）為靶基因，將RAA與LFD相結(jié)合，建立一種快速檢測牛奶中金黃色葡萄球菌的RAA-LFD方法，并通過模擬樣品與實際樣品的檢測進(jìn)行可靠性驗證，以期為牛奶及其制品中金黃色葡萄球菌的快速篩查提供技 術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金黃色葡萄球菌與其他常見致病菌菌株均于-80 ℃超低溫甘油管凍存。其中3 株金黃色葡萄球菌、1 株單核細(xì)胞性李斯特菌、1 株產(chǎn)酸克雷伯氏菌和1 株肺炎克雷伯氏菌均分離自奶牛養(yǎng)殖場。實驗所用的細(xì)菌菌株見表1。

表1 實驗所用的細(xì)菌菌株Table 1 Bacterial strains used in this study

RAA核酸擴(kuò)增試劑盒 江蘇奇天基因生物科技有限公司；一次性核酸檢測試紙條（3號） 杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；瓊脂糖、核酸染料 生工生物工程（上海）股份有限公司；PremixTaq（ExTaqVersion 2.0 plus dye） 寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京） 有限公司；LB瓊脂培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基、胰酪胨大豆瓊脂（trypticase soy agar，TSA）培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯（tryptone soy broth，TSB）培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

53311型PCR儀 美國Eppendorf公司；HWS-12型電熱恒溫水浴鍋 上海申生科技有限公司；酶標(biāo)儀 美國伯騰儀器有限公司；凝膠成像分析儀 美國伯樂 公司；ESCO超凈工作臺 美國Airstream公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計與篩選

從GenBank中下載金黃色葡萄球菌的nuc基因序列（LS483300.1、LR134088.1、EF529607.1、EF529597.1、AJ938182.1），通過DNAMAN比對分析nuc基因序列的同源性并確定保守區(qū)域，采用Primer-BLAST和Primer5軟件根據(jù)保守區(qū)域共設(shè)計3 對引物 （表2）。通過RAA擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳篩選特異性引物。確定最佳引物后在上下引物5′端分別標(biāo)記熒光素（6-carboxyfluorescein，6-FAM）和生物素（Biotin），用于結(jié)合膠體金示蹤物進(jìn)行試紙條檢測。引物及引物的標(biāo)記由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表2 實驗所用引物Table 2 Primers used in this study

1.3.2 細(xì)菌基因組DNA的提取

試劑盒提取法：將保存在甘油管中的細(xì)菌菌株，劃線接種于TSA固體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，挑取單菌落接種到TSB營養(yǎng)肉湯中。37 ℃過夜培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接2 次后，取1 mL上述經(jīng)活化培養(yǎng)的細(xì)菌培養(yǎng)液至1.5 mL離心管中，根據(jù)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行提取。提取的基因組DNA通過1%瓊脂糖凝膠電泳和BioTek酶標(biāo)儀測定基因組DNA完整性、濃度與純度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

參考Gao Weifang等[24]通過煮沸裂解法提取細(xì)菌基因組DNA，略作改動。取1 mL活化培養(yǎng)的細(xì)菌菌液至1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心2 min，棄上清液后加入1 mL無菌生理鹽水重懸，12 000 r/min離心2 min后棄去上清液，加入100 μL ddH2O重懸，95 ℃處理10 min，冰上放置2 min，12 000 r/min離心2 min，取上清液， 于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 金黃色葡萄球菌RAA-LFD檢測方法的建立

RAA反應(yīng)根據(jù)RAA核酸擴(kuò)增試劑盒說明書進(jìn)行。反應(yīng)體系總體積為50 μL：nuc-RAA-LF/LR各1 μL（10 μmol/L），基礎(chǔ)緩沖液25 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 19.5 μL充分混勻后加入到含凍干酶粉的反應(yīng)管中，充分溶解，加入2.5 μL醋酸鎂溶液（280 mmol/L），充分混勻后離心，放入水浴鍋39 ℃溫浴反應(yīng)30 min后，反應(yīng)管立即置于冰上5 min。取10 μL RAA核酸擴(kuò)增產(chǎn)物滴加到樣品墊，將LFD樣品墊末端垂直插入含有100 μL緩沖液的EP管中，5 min后取出試紙條進(jìn)行觀察并拍照。LFD結(jié)果判定[25]：陽性樣品試紙條的質(zhì)控線與檢測線均出現(xiàn)清晰可見的紅色條帶，表明樣本中含有待檢測的核酸片段；陰性樣品則僅有質(zhì)控線出現(xiàn)清晰可見的紅色條帶，表明樣本中不含目的核酸片段，或其數(shù)量低于試紙條的最低檢出量。

1.3.4 RAA-LFD擴(kuò)增反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化

在保持RAA反應(yīng)體系中酶、基礎(chǔ)緩沖液和醋酸鎂等不變的情況下，加入不同濃度的引物（400 、200、100、50、25、12.5 nmol/L），分別在25、31、33、35、37、39、41、43 ℃擴(kuò)增5、10、15、20、25、30 min。擴(kuò)增產(chǎn)物采用LFD進(jìn)行檢測，通過裸眼觀察試紙條T線顏色深淺與ImageJ軟件對T線條帶的強(qiáng)度進(jìn)行量化共同判定結(jié)果，獲得RAA擴(kuò)增的最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。

1.3.5 RAA-LFD方法的特異性評價

分別對4 株金黃色葡萄球菌和10 株非金黃色葡萄球菌基因組DNA進(jìn)行RAA擴(kuò)增，LFD檢測擴(kuò)增結(jié)果，驗證金黃色葡萄球菌特異性引物對與非靶標(biāo)菌株無交叉反應(yīng)。

1.3.6 RAA-LFD方法的靈敏度評價

1.3.6.1 基因組DNA的檢出限

通過試劑盒提取的金黃色葡萄球菌基因組DNA 10 倍梯度稀釋（4 ng/μL、400 pg/μL、40 pg/μL、4 pg/μL、400 fg/μL、40 fg/μL、4 fg/μL），各取1 μL作為模板進(jìn)行RAA擴(kuò)增，以ddH2O作為陰性對照，擴(kuò)增產(chǎn)物通過LFD進(jìn)行端點檢測確定該方法對靶向基因的檢出限。

1.3.6.2 純培養(yǎng)物的檢出限

將培養(yǎng)至109CFU/mL的金黃色葡萄球菌純培養(yǎng)物進(jìn)行10 倍梯度稀釋，取各稀釋梯度菌液進(jìn)行涂布，次日進(jìn)行平板計數(shù)，同時取各稀釋梯度的金黃色葡萄球菌菌液，用煮沸法提取基因組DNA，各取1 μL作為模板進(jìn)行RAA擴(kuò)增，以ddH2O作為陰性對照，擴(kuò)增產(chǎn)物通過LFD進(jìn)行端點檢測確定該方法對金黃色葡萄球菌純培養(yǎng)物的檢出限。

1.3.7 模擬牛奶樣品檢測靈敏度

1.3.7.1 RAA-LFD法檢測模擬牛奶樣品靈敏度

按照GB 4789.10—2016《食品微生物學(xué)檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》[26]檢測確定金黃色葡萄球菌陰性的市售牛奶樣品備用。將37 ℃條件下培養(yǎng)至109CFU/mL金黃色葡萄球菌菌懸液進(jìn)行10 倍梯度稀釋，分別加入到25 mL備用牛奶中，均勻混合后加入225 mL TSB培養(yǎng)基，置于37 ℃條件下分別培養(yǎng)0、2、4、6 h后，各取1 mL采用煮沸法提取基因組DNA，進(jìn)行RAA擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過試紙條觀察并拍照記錄結(jié)果。

1.3.7.2 PCR法檢測模擬牛奶樣品靈敏度

將1.3.7.1節(jié)提取的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增[23]，擴(kuò)增引物見表2。PCR體系為25 μL：PremixTaq12.5 μL，PCR-F/R各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL充分混勻后離心，置于PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后于2%瓊脂糖凝膠電泳，并用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

1.3.8 牛奶中金黃色葡萄球菌的檢測

從上海郊區(qū)奶牛場采集牛奶樣本64 份，置于冰中運回實驗室。采用微生物生化鑒定法、PCR法與RAA-LFD方法進(jìn)行檢測，驗證所建立方法在實際樣品中檢測金黃色葡萄球菌的應(yīng)用效果。從靈敏度、特異性和總符合率3個指標(biāo)評價所建立方法診斷實驗真實性[27]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本研究所有實驗重復(fù)3 次，實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad prism 8.0軟件作圖，通過IBM SPSS statistics 22.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選

根據(jù)RAA引物設(shè)計原則共設(shè)計3 對引物，通過RAA擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳篩選最佳引物。如圖1所示，3 對引物均能擴(kuò)增得到預(yù)期目的條帶，其中第2對引物擴(kuò)增目的片段大小為159 bp，擴(kuò)增條帶明亮且無雜帶，擴(kuò)增效率最高（圖1A）。隨后將第2條擴(kuò)增產(chǎn)物割膠回收純化后送至公司測序，測序結(jié)果與GenBank基因庫相對應(yīng)的序列進(jìn)行比對，分析該序列同源性為99.4%～100% （圖1B），表明第2對引物具有較高的特異性，因此選用第2對引物nuc-RAA-F2/nuc-RAA-R2用于檢測金黃色葡萄球菌的nuc基因。

圖1 金黃色葡萄球菌RAA引物篩選（A）與序列同源性比對結(jié)果圖（B）Fig. 1 Screening of RAA primers for S. aureus (A) and sequence homology comparison (B)

2.2 RAA-LFD反應(yīng)條件優(yōu)化

分別對RAA反應(yīng)體系中引物濃度、反應(yīng)溫度與反應(yīng)時間進(jìn)行優(yōu)化確定最佳反應(yīng)條件。在引物濃度為12.5 nmol/L與25 nmol/L時試紙條T線未有條帶，隨著引物濃度的增加，LFD試紙條T線顏色加深，顯色明顯且穩(wěn)定（圖2A）。經(jīng)ImageJ軟件分析發(fā)現(xiàn)反應(yīng)體系中引物濃度大于50 nmol/L時T線灰度值在不同引物濃度間存在顯著差異（P＜0.05）（圖2D）。隨著引物濃度的增加有助于顯色觀察，但會加大引物二聚體產(chǎn)生的可能性，因此選擇顯色明顯的200 nmol/L為最佳引物濃度。在不同反應(yīng)溫度條件下，試紙條T線亮度在較寬的溫度范圍內(nèi)呈“拱形”變化（圖2B）。在33～37 ℃時，試紙條T線顏色明亮清晰，結(jié)合ImageJ軟件分析T線灰度值無顯著差異（P＞0.05）（圖2E），表明在33～37 ℃條件下更加有利于RAA反應(yīng)酶與引物形成復(fù)合體，擴(kuò)增效率更高。為使檢測更加接近環(huán)境溫度，因此選擇33 ℃作為反應(yīng)溫度。在引物濃度200 nmol/L、溫度33 ℃的基礎(chǔ)上優(yōu)化反應(yīng)時間，RAA擴(kuò)增超過20 min后檢測線位置條帶明亮且趨于穩(wěn)定，裸眼可見并沒有明顯變化（圖2C）。反應(yīng)時間為20、25 min和30 min的產(chǎn)物T線灰度值無顯著差異 （P＞0.05）（圖2F），為保證實驗的快速性選擇20 min為RAA最佳反應(yīng)時間。通過對RAA反應(yīng)體系中引物濃度、反應(yīng)溫度與反應(yīng)時間的優(yōu)化，最終獲得最佳反應(yīng)條件為50 μL的反應(yīng)體系中引物濃度為200 nmol/L，33 ℃反應(yīng)20 min。

圖2 RAA-LFD法檢測金黃色葡萄球菌的條件優(yōu)化Fig. 2 Optimization of the RAA-LFD reaction conditions for S. aureus detection

2.3 RAA-LFD檢測特異性分析

以4 株金黃色葡萄球菌和10 株非金黃色葡萄球菌的基因組DNA為模板，對RAA進(jìn)行特異性分析。如 圖3所示，4 株金黃色葡萄球菌在試紙條T線有陽性條帶出現(xiàn)，而其他10 株病原菌經(jīng)擴(kuò)增后在試紙條T線位置未出現(xiàn)陽性條帶，表明基于nuc基因保守序列設(shè)計的金黃色葡萄球菌擴(kuò)增引物具有高度特異性。

圖3 RAA-LFD法檢測金黃色葡萄球菌特異性實驗Fig. 3 Specificity of RAA-LFD for S. aureus detection

2.4 RAA-LFD檢測靈敏度分析

2.4.1 基因組DNA的檢出限

以不同質(zhì)量濃度的金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，擴(kuò)增產(chǎn)物采用LFD進(jìn)行檢測。如圖4所示，隨著金黃色葡萄球菌基因組DNA濃度的遞減，T線條帶亮度逐漸變?nèi)?，?dāng)基因組DNA質(zhì)量濃度低至4 fg/μL時，仍可觀察到T線有陽性條帶。因此，RAA-LFD方法檢測金黃色葡萄球菌檢出限為4 fg/μL DNA。

圖4 RAA-LFD法檢測金黃色葡萄球菌基因組DNA靈敏度實驗Fig. 4 Sensitivity of RAA-LFD for detection of S. aureus genomic DNA

2.4.2 純培養(yǎng)物的檢出限

將1.83×109CFU/mL細(xì)菌培養(yǎng)液進(jìn)行10 倍稀釋，分別對稀釋的模板進(jìn)行RAA-LFD檢測。如圖5所示，隨著金黃色葡萄球菌純菌液濃度的遞減，T線條帶亮度呈變?nèi)踮厔荨．?dāng)濃度為1.83×102CFU/mL 時，T線仍可通過裸眼觀察有陽性條帶。因此，RAALFD方法檢測金黃色葡萄球菌純培養(yǎng)物檢出限為 1.83×102CFU/mL。楊發(fā)龍等[28]建立的多重PCR檢測金黃色葡萄球菌純菌液濃度為1.1×102CFU/mL；Tian Xiaolan等[11]建立的金黃色葡萄球菌LAMP技術(shù)，檢測純菌液的靈敏度為7.6×102CFU/mL。本研究建立的RAA-LFD法對金黃色葡萄球菌純菌液的檢出限與多重PCR和LAMP法檢出限一致，達(dá)到102CFU/mL。Ahn等[29]建立了一種基于紙質(zhì)芯片裝置的重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplification，RPA）技術(shù)能夠檢測到金黃色葡萄球菌最低純菌液濃度為102CFU/mL，所需時間為20 min。RAA-LFD相比基于紙質(zhì)芯片裝置的RPA在相同的時間，無需設(shè)備的輔助即可達(dá)到相同的檢出限，更適合在現(xiàn)場和非實驗室環(huán)境中的快速檢測。

圖5 RAA-LFD法檢測金黃色葡萄球菌純培養(yǎng)物基因組DNA靈敏度實驗Fig. 5 Sensitivity of RAA-LFD for detection of genomic DNA in pure cultures of S. aureus

2.5 模擬牛奶樣品檢測

通過人工污染牛奶樣品驗證RAA-LFD方法的可靠性，同時與PCR檢測方法進(jìn)行結(jié)果比較。牛奶樣品中分別加入103、102、101、100CFU/mL金黃色葡萄球菌時，在未經(jīng)富集（圖6A、E）與富集2 h（圖6B、F）的牛奶樣品通過PCR與RAA-LFD均檢測不到金黃色葡萄球菌；富集4 h后通過RAA-LFD可檢測到1.83×102CFU/mL 金黃色葡萄球菌（圖6G），而采用PCR方法檢測到1.83×103CFU/mL金黃色葡萄球菌（圖6C），表明在富集4 h時，RAA-LFD法檢測牛奶中金黃色葡萄球菌的靈敏度高于PCR檢測方法；在富集6 h后通過PCR與RAALFD檢測結(jié)果一致，檢出限低至1.83×101CFU/mL金黃色葡萄球菌（圖6D、H）。Hu Jinqiang等[30]建立的金黃色葡萄球菌RPA檢測方法，在富集6 h后可檢出牛奶中 38 CFU/mL金黃色葡萄球菌，但需要制膠與電泳去檢測。由此可見RAA-LFD檢測牛奶中的金黃色葡萄球菌更為靈敏，適合用于現(xiàn)場的快速檢測。

圖6 RAA-LFD和PCR方法檢測模擬樣品中金黃色葡萄球菌Fig. 6 Results of detection of S. aureus in simulated samples by RAA-LFD and PCR

2.6 實際樣品檢測結(jié)果

對采集的64 份牛奶樣本分別進(jìn)行RAA-LFD法、微生物生化鑒定法和PCR法檢測，并用κ系數(shù)比較RAA-LFD法與其他2種方法結(jié)果的一致性，結(jié)果如表3所示。RAALFD法檢測結(jié)果與微生物生化鑒定法或PCR法都具有較高的一致性。RAA-LFD法與微生物生化鑒定法相比，64 份牛奶樣本中微生物生化鑒定法檢測到了16 份陽性，而RAA-LFD法檢測到了19 份陽性，靈敏度達(dá)100%；在微生物生化鑒定法檢測到的48 份陰性樣本中，RAALFD法檢測到45 份陰性，特異性達(dá)93.8%；RAA-LFD和微生物生化鑒定法的總符合率達(dá)到95.3%，κ系數(shù)為0.822 （κ＞0.75），表明RAA-LFD法與微生物生化鑒定法的檢測結(jié)果基本一致。RAA-LFD法與PCR法相比，靈敏度為100%，特異性為97.8%，總符合率達(dá)到了98.4%，κ系數(shù)達(dá)到了0.961（κ＞0.75），表明RAA-LFD法與PCR有比微生物生化鑒定法更高的一致性。但是RAA-LFD與PCR法相比，仍然有一份假陽性，這可能是因為采集的牛奶樣本中金黃色葡萄球菌的濃度較低，達(dá)到了RAA-LFD法的檢出限但未達(dá)到PCR法的檢出限，另外，RAA法具有較高的食品基質(zhì)耐受性，這也可能是RAA-LFD法能檢測到更多陽性樣本的原因[31-32]。盡管如此，RAA-LFD法與微生物生化鑒定法和PCR法的高符合率說明了RAA-LFD法具有較高的檢測準(zhǔn)確性。然而，RAA-LFD法既不需要繁瑣的操作步驟，也不需要較長的培養(yǎng)鑒定時間或制膠與電泳的時間，這縮短了實際樣本中金黃色葡萄球菌的檢測時間。另外，利用試紙條檢測RAA擴(kuò)增產(chǎn)物可達(dá)到裸眼直接觀察檢測結(jié)果的效果，十分利于在基層環(huán)境中的檢測。

表3 實際樣品檢測結(jié)果Table 3 Results of S. aureus detection in actual samples by RAA-LFD compared with PCR and conventional culture method

3 結(jié) 論

本研究以金黃色葡萄球菌高度保守的耐熱核酸酶基因（nuc）為靶基因，建立了RAA-LFD快速檢測方法，并優(yōu)化確定最佳反應(yīng)條件：50 μL的反應(yīng)體系中引物濃度為200 nmol/L，33 ℃反應(yīng)20 min。RAA-LFD法檢測金黃色葡萄球菌基因組DNA的檢出限為4 fg/μL、純菌液為1.83×102CFU/mL，相比微生物生化鑒定法和PCR方法檢測更為快速、靈敏。當(dāng)人工污染牛奶樣品量為1.83×101CFU/mL金黃色葡萄球菌時，RAA-LFD法可在7 h內(nèi)完成樣品處理和檢測。對采集的64 份牛奶樣品進(jìn)行檢測，RAA-LFD法檢測結(jié)果與微生物生化鑒定法、PCR法均具有較高的一致性。因此，在實驗室資源有限的情況下，RAA-LFD法可作為牛奶及其制品中金黃色葡萄球菌快速篩查的有力手段。