HPLC法測定硫酸慶大霉素滴眼液中8種抗氧劑

盧玉鳳 張振中

摘要：目的 建立硫酸慶大霉素滴眼液中8種抗氧劑含量的HPLC測定方法，考察包材中抗氧劑向藥液的遷移情況。方法 采用Inertsil ODS-3色譜柱（4.6 mm×100 mm，3 μm）；檢測波長：200 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：35℃；進樣量：10 μL；流動相為水-乙腈，梯度洗脫。采用正己烷對樣品中的抗氧劑進行提取，建立硫酸慶大霉素滴眼液中抗氧劑BHA、抗氧劑XH-245、抗氧劑BHT、抗氧劑3114、抗氧劑1010、抗氧劑330、抗氧劑1076和抗氧劑168含量的測定方法，并進行方法學驗證，同時測定了企業(yè)提供的原輔料和包材中8種抗氧劑的含量，并對制劑進行了影響因素考察試驗。結(jié)果 8種抗氧劑之間的分離度良好，均在0.3～30 μg/mL 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r≥0.9994）。方法精密度、重復性、回收率、穩(wěn)定性均符合有關(guān)規(guī)定。硫酸慶大霉素滴眼液、原輔料中均未檢出8種抗氧劑，包材中僅檢出抗氧劑BHT，影響因素試驗表明樣品中8種抗氧劑的遷移不受高溫、高濕和強光照射的影響，表明本品由包材中抗氧劑遷移帶來的安全風險較低。結(jié)論 所建立的方法靈敏、快速、準確、重復性好，提取方法簡單，可用于硫酸慶大霉素滴眼液中8種抗氧劑遷移情況的監(jiān)測和溯源。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；硫酸慶大霉素滴眼液；抗氧劑；原輔料；包材

中圖分類號：R978.1， R917文獻標志碼：A

Determination of eight antioxidants in gentamicin sulfate eye drops by HPLC

Lu Yu-feng1，2， and Zhang Zhen-zhong1

（1 Zhengzhou University， Zhengzhou 450001; 2 Institute for Food and Drug Control of Henan Province， Zhengzhou 450018）

Abstract Objective To establish an HPLC method for determining the content of eight antioxidants in gentamicin sulfate eye drops， and study the migration of antioxidants from plastic packaging materials to eye drops. Methods HPLC was performed on an Inertsil ODS-3 column（4.6 mm×100 mm， 3 μm）with the mobile phase of acetonitrile-water（gradient elution）. The flow rate was 1.0 mL/min，the detection wavelength was 200 nm， the column temperature was maintained at 30℃， and the sample volume was 10 μL. The antioxidant in the sample was extracted with n-hexane. The HPLC method was set up to determine the contents of antioxidant BHA， XH-245， BHT， 3114， 1010， 330， 1076， and 168. At the same time， the contents of eight antioxidants in the preparations， raw and auxiliary materials， and packaging materials provided by the enterprise were determined， and the influencing factors of the preparations were investigated. Results The eight antioxidants were well separated， which showed good linear relationship in the concentration range of 0.3～30 μg/mL（r≥0.9994）. The specificity， the precision， the accuracy， and the robustness were good. Conclusions The method is sensitive， rapid and accurate with good repeatability， which can be used to evaluate the migration of antioxidants from packaging materials and containers to gentamicin sulfate eye drops.

Key words HPLC; Gentamicin sulfate eye drops; Antioxidant; Raw and auxiliary materials; Packaging materials

硫酸慶大霉素滴眼液常采用了塑料藥品包裝材料，而此類包裝材料在生產(chǎn)過程中，為使其易于加工，在儲存、使用過程中更加穩(wěn)定，常需加入酚類、亞磷酸酯類或硫酯類抗氧劑。常用的抗氧劑BHA、BHT，毒副作用較大，對人體肝、脾、肺等均有不利影響；其他大多數(shù)抗氧化劑穩(wěn)定作用良好而且無毒，然而，由于苯基的存在，一些苯基取代的亞磷酸酯類被認為具有一定毒性；此外，抗氧劑168的主要氧化裂解產(chǎn)物鄰苯二甲酸丁二酯，毒理學試驗證明其有潛在的致癌作用。并且在包材使用過程中，抗氧劑與藥液接觸時發(fā)生相互作用或直接遷移至藥液時，會影響藥效的發(fā)揮甚至危及人體健康。因此，有必要對藥品中的抗氧劑含量進行考察，進一步提高藥品質(zhì)量，保障人民用藥安全。本試驗參考英國藥典（BP2021）[1]、歐洲藥典（EP10.0）[2]及相關(guān)文獻[3-9]，采用正己烷提取樣品中的抗氧劑，建立HPLC法測定硫酸慶大霉素滴眼液中8種抗氧劑含量的方法，并進行方法學驗證，該方法檢測限低，前處理過程簡單，方法可靠，為藥包材的質(zhì)量研究以及藥物與藥包材的相容性試驗提供了參考方法。按建立的方法測定了硫酸慶大霉素滴眼液2021年國家藥品抽檢樣品23批次樣品、企業(yè)調(diào)研樣品3批次、對照制劑2批次、2家企業(yè)提供的原輔包和影響因素試驗樣品中8種抗氧劑的含量，并對測定結(jié)果進行了分析和評估。

1 儀器與試藥

1.1 藥品與試劑

抗氧劑BHA（批號：LJ80U71）、抗氧劑330（批號：LF70T68）、抗氧劑1010（批號：LK20V115）、抗氧劑1076（批號：LRB0U122）、抗氧劑168（批號：L990U58）購自河北百靈威超精細材料有限公司，質(zhì)量分數(shù)均>98%；抗氧劑XH-245（批號：2787-01，質(zhì)量分數(shù)：100.0%）購自AccuStandard公司；抗氧劑BHT（批號：BCCC0032，質(zhì)量分數(shù)：99.0%）購自Aldrich公司；抗氧劑3114（批號：VQKUH-NY，質(zhì)量分數(shù)：98.0%）購自東京化成工業(yè)株式會社。硫酸慶大霉素（批號：190510010）、硼砂（批號：200908）、硼酸（批號：201102）、羥苯乙酯（批號：103620201001）均由A企業(yè)提供；硫酸慶大霉素滴眼液，2021年國家藥品抽檢樣品23批次和企業(yè)調(diào)研樣品3批次均由A、B兩家企業(yè)生產(chǎn)，見表1；硫酸慶大霉素滴眼液（批號L20A9G）購自日本株式會社日本點眼藥研究所；硫酸慶大霉素滴眼液（批號：T0274）購自美國Allergan公司。

低密度聚乙烯藥用滴眼劑瓶（批號：20100053）由A企業(yè)提供；低密度聚乙烯藥用滴眼劑瓶（批號：190605）由B企業(yè)提供；色譜級乙腈購自Sigma公司；色譜級正己烷購自VBS Biologic公司；超純水由Millipore純水儀制備。

1.2 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Waters 2489紫外檢測器（美國Waters公司）；Waters 2998二極管陣列檢測器（美國Waters公司）；XPE 205型電子天平（美國Mettler公司）；MS3 basic型渦旋振蕩器（德國IKA公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱Inertsil ODS-3色譜柱（4.6 mm×100 mm，3 μm）；檢測波長：200 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：35℃；進樣量：10 μL；A相：水，B相：乙腈，按表2進行梯度洗脫。

2.2 對照品溶液的制備

混合對照品溶液：取8種抗氧劑對照品10 mg，精密稱定，加乙腈1 mL，加正己烷適量，超聲使溶解，用正己烷稀釋并制成各約含100 μg/mL的混合對照品貯備液，再用正己烷稀釋制成含8種抗氧劑分別為0.3、0.5、1.0、5.0、8.0、10.0、12.0、20.0和30.0 μg/mL的混合對照品溶液1～9，其中對照品溶液6（10.0 μg/mL）作為系統(tǒng)適用性溶液。

2.3 空白溶液、原料溶液、輔料溶液、供試品溶液和重復性溶液的制備

空白溶液：正己烷。

原料溶液：按處方取硫酸慶大霉素原料適量，精密稱定，加水溶解并定容至50 mL，得相當于慶大霉素5 mg/mL的溶液。取該溶液8 g，精密稱定，置具塞玻璃試管中，精密加入正己烷2 mL，渦旋振蕩2 min后，靜置2 min，取正己烷層作為原料溶液。

輔料溶液：綜合兩家企業(yè)的處方，按比例稱取各輔料適量，精密稱定，按處方加水溶解并定容至50 mL。取該溶液8 g，精密稱定，置具塞玻璃試管中，精密加入正己烷2 mL，渦旋振蕩2 min后，靜置2 min，取正己烷層作為輔料溶液。

供試品溶液：取硫酸慶大霉素滴眼液8 g，精密稱定，置具塞玻璃試管中，精密加入正己烷2 mL，渦旋振蕩2 min后，靜置2 min，取正己烷層作為供試品溶液。

重復性溶液：取同一批硫酸慶大霉素滴眼液6瓶，分別取8 g，精密稱定，置具塞玻璃試管中，精密加入2 mL混合對照品溶液3，渦旋振蕩2 min后，靜置2 min，取正己烷層作為供試品溶液。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗

精密量取系統(tǒng)適用性溶液進行測定， 8種抗氧劑出峰順序依次為：抗氧劑BHA、抗氧劑XH-245、抗氧劑BHT、抗氧劑3114、抗氧劑1010、抗氧劑330、抗氧劑1076和抗氧劑168。色譜圖中8種抗氧劑及相鄰峰之間的分離度均大于1.5，本試驗方法的色譜條件可行，系統(tǒng)適用性溶液色譜圖見圖1。

2.5 專屬性試驗

分別取“2.3”中空白溶液、原料溶液、輔料溶液作為陰性對照溶液，同時取供試品溶液按“2.1”方法進行測定，結(jié)果顯示硫酸慶大霉素和各輔料均在4 min之前出峰，溶劑正己烷和原料、輔料均不干擾8種抗氧劑的測定，該方法專屬性良好，見圖2陰性對照溶液色譜圖和圖3供試品溶液色譜圖。

2.6 線性與范圍

分別精密量取“2.2”中混合對照品溶液1～9，按“2.1”方法進行測定，8種抗氧劑線性與范圍結(jié)果見表3，8種抗氧劑的峰面積與濃度的線性關(guān)系均良好。

2.7 精密度試驗

2.7.1 進樣精密度

精密量取“2.2”中混合對照品溶液6連續(xù)進樣，8種抗氧劑峰面積的RSD在0.61%～1.05%（n=6），表明該方法進樣精密度良好。

2.7.2 重復性

取同一批次硫酸慶大霉素滴眼液6瓶，按“2.3”方法分別制備供試品溶液并進行測定，結(jié)果供試品溶液中，均未檢出8種抗氧劑。另取同一批次硫酸慶大霉素滴眼液6瓶，按“2.3”方法分別制備重復性溶液，8種抗氧劑峰面積的RSD均在0.54%～1.85%（n=6），表明該方法重復性良好。

2.7.3 中間精密度

取同一批次硫酸慶大霉素滴眼液，在不同日期、由不同分析人員按“2.3”方法分別制備重復性溶液6份，使用不同儀器測定，8種抗氧劑峰面積的RSD均在0.91%～1.78%（n=6），表明說明該方法中間精密度良好。

2.8 檢測限與定量限

精密量取“2.2”中混合對照品溶液6用正己烷逐級稀釋，以信噪比S/N約為3：1計為檢測限，以信噪比S/N約為10：1計為定量限，檢測限與定量限結(jié)果見表4。

2.9 穩(wěn)定性試驗

將混合對照品溶液6和供試品溶液和重復性溶液在室溫下放置，分別在0、2、4、6、8、10和12 h進樣測定，對照品溶液中8種抗氧劑峰面積的RSD%在1.12%～1.71%，表明對照品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。供試品溶液在12 h內(nèi)均未檢出8種抗氧劑，重復性溶液在12 h內(nèi)8種抗氧劑峰面積的RSD在0.61%～1.63%，重復性溶液穩(wěn)定性良好。

2.10 加樣回收率試驗

取同一批次硫酸慶大霉素滴眼液9瓶，分別稱取8 g置具塞試管中，再分別精密加入“2.2”中混合對照品溶液（8 μg/mL）、混合對照品溶液（10 μg/mL）和混合對照品溶液（12 μg/mL）各2.0 mL，渦旋振蕩2 min后靜置2 min，取正己烷層作為加樣回收率溶液。（各濃度平行配制3份，共9份）。按“2.1” 方法進樣測定，各抗氧劑的平均回收率在91.9%～102.2%，RSD在0.30%～1.41%，回收率良好，結(jié)果見表5。

2.11 耐用性

取“2.2”中混合對照品溶液6，以8種抗氧劑的保留時間和各峰之間的分離度為指標，采用不同色譜柱、不同柱溫、不同流速考察方法耐用性。

（1）色譜柱

選用品牌、內(nèi)徑、柱長和粒徑不同的C18色譜柱，色譜柱信息見表6，不同色譜柱系統(tǒng)適用性溶液色譜圖見圖4，結(jié)果顯示優(yōu)先選擇內(nèi)徑4.6 mm、柱長100 mm或150 mm、填料粒徑3 μm的色譜柱，8種抗氧劑色譜峰能在分析時間內(nèi)全部出峰并達到良好的分離效果。

（2）柱溫

采用Inertsil ODS-3（4.6 mm×100 mm，3 μm）色譜柱，柱溫分別為30℃、35℃和40℃，其他色譜條件相同。精密量取系統(tǒng)適用性溶液分別進樣測定，結(jié)果表明不同的柱溫條件下，系統(tǒng)適用性溶液中8種抗氧劑各峰之間的分離度均大于1.5。但柱溫為30℃時，抗氧劑168出峰較晚（接近50 min），因此建議柱溫應(yīng)高于30℃。

（3）流速

采用Inertsil ODS-3（4.6 mm×100 mm， 3 μm）色譜柱，流速分別為0.8、1.0和1.2 mL/min，其他色譜條件相同。精密量取系統(tǒng)適用性溶液分別進樣測定，結(jié)果表明不同的流速條件下，系統(tǒng)適用性溶液中8種抗氧劑各峰之間的分離度均大于1.5。但流速為0.8 mL/min時，抗氧劑168出峰較晚（接近50 min），因此建議流速應(yīng)大于0.8 mL/min。

3 樣品測定

3.1 硫酸慶大霉素滴眼液測定

按建立的方法對本次國家藥品抽檢23批次和企業(yè)調(diào)研3批次硫酸慶大霉素滴眼液樣品及日本、美國2批次對照制劑中8種抗氧劑的含量進行測定，供試品溶液典型色譜圖見圖3，按“2.6”中線性方程計算各批次樣品中8種抗氧劑的含量。結(jié)果為兩家企業(yè)共26批次樣品及日本、美國2批次對照制劑中8種抗氧劑的含量均低于檢測限，均未檢出。根據(jù)參考文獻[3-4]及毒性數(shù)據(jù)庫的相關(guān)資料，獲知抗氧劑BHT、3114、1010、1076、168的PDE（每日允許最大暴露量）分別為0.15、25、10、0.3和2.5 mg/d，抗氧劑BHA、XH-245和330根據(jù)結(jié)構(gòu)類似，毒性類似的原則，分別參考BHT、1076和3114的PDE值，推定其PDE值分別為0.15、0.3和25 mg/d用于安全評估。由本品說明書推算本品單眼每日最大使用量為10滴，約相當于0.5 g/d，假設(shè)8種抗氧劑按照PDE的全量遷移至藥液中，推算8種抗氧劑的分析評價閾值（AET）=PDE×天數(shù)（1）÷藥液重量（0.5 g）范圍為：0.3～50 mg/g。本次國家藥品抽檢樣品中均未檢出8種抗氧劑，表明本品由8種抗氧劑帶來的安全風險較低。

3.2 原輔料測定

按“2.3”中配制原料溶液和輔料溶液，按建立的方法進行測定，按“2.6”中線性方程計算原輔料中8種抗氧劑的含量，結(jié)果為2家制劑生產(chǎn)企業(yè)提供的原輔料中8種抗氧劑的含量均低于檢測限，均未檢出。

3.3 包材測定

取包材10套，剪至大小約為0.2 cm×0.2 cm的單個碎片，混勻。精密稱取包材碎片約2 g，分別用正己烷20 mL煮沸回流4 h提取、乙腈20 mL煮沸回流4 h[5]提取、異丙醇超聲4 h后浸泡過夜提取[6]3種方式提取包材中的8種抗氧劑，按建立的方法進行測定，按“2.6”中線性方程計算。結(jié)果：①2家生產(chǎn)企業(yè)提供的包材中均檢出BHT，而硫酸慶大霉素滴眼液中未檢出，表明包材中BHT未遷移入樣品中，分析為8種抗氧劑在水中不溶或微溶，因此不易遷移入藥液中。②對比提取結(jié)果，可知用正己烷提取包材中8種抗氧劑，檢出BHT含量較高，提取效果好。分析為用乙腈或異丙醇提取時，包材無形態(tài)變化，提取溶液澄清。而用正己烷提取時，包材被正己烷溶解破壞，發(fā)生形態(tài)變化，抗氧劑易于提取到正己烷中，提取溶液為白色渾濁溶液，因此用正己烷提取包材中抗氧劑效果好，結(jié)果見表7包材測定結(jié)果。

3.4 影響因素試驗樣品測定

取2家生產(chǎn)企業(yè)的硫酸慶大霉素滴眼液各1批次和日本、美國對照制劑分別置高溫（60℃）、高濕（25℃，硝酸鉀飽和溶液，相對濕度：92.5%）和強光（照度：4500 Lx）環(huán)境下，置高溫條件下的樣品在0、5、10和30 d時分別取樣，置高濕和強光條件下樣品在0、5和10 d時分別取樣。按“2.3”中方法配制相應(yīng)的供試品溶液，按建立的方法進行測定，按“2.6”中線性方程計算。結(jié)果為2家生產(chǎn)企業(yè)的硫酸慶大霉素滴眼液和日本、美國的對照制劑，供試品溶液中8種抗氧劑的含量均低于檢測限，均未檢出，不受高溫、高濕和強光照射的影響。

4 討論

4.1 提取溶劑的選擇

根據(jù)抗氧劑BHA、抗氧劑XH-245、抗氧劑BHT、抗氧劑1010、抗氧劑330、抗氧劑1076和抗氧劑168均不溶于水，抗氧劑3114微溶于水，但在有機溶劑中均有一定的溶解性的特點。分別稱取8種抗氧劑適量，用乙腈、異丙醇和正己烷進行溶解度試驗，觀察溶解情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)8種抗氧劑在乙腈中溶解性最好，異丙醇和正己烷次之，擬選乙腈為溶劑。

4.2 提取方式的選擇

本品為硫酸慶大霉素的水溶制劑，8種抗氧劑不溶或微溶于水，需經(jīng)有機溶劑提取后方可測定，對提取方式進行了考察。

4.2.1 固相萃取

選用乙腈為溶劑時，因乙腈與水互溶，需用固相萃取小柱對樣品的抗氧劑進行富集后，用乙腈洗脫，并收集洗脫液作為供試品溶液；對照品用乙腈溶解并稀釋配制成混合對照品溶液[7]。

4.2.2 正己烷提取

選用正己烷為溶劑時，正己烷和水不互溶，可利用抗氧劑不溶于水或微溶于水，可溶于正己烷的特點，將樣品中的抗氧劑提取至正己烷層，取正己烷層作為供試品溶液；對照品用正己烷溶解并稀釋配制成混合對照品溶液（注：抗氧劑XH-245在正己烷中溶解度較差，因此配制對照品貯備液時需先加入適量乙腈助溶）。

精密量取以上兩種提取方式配制的混合對照品溶液和供試品溶液進樣，結(jié)果顯示，用乙腈和正己烷分別配制的混合對照品溶液的色譜圖中，8種抗氧劑的保留時間和峰形基本一致，分離度均符合要求。兩種提取方式所得供試品溶液測定結(jié)果一致。但采用固相萃取提取方式時，需先對萃取小柱進行活化，且富集樣品耗時長，而采用正己烷提取時，供試品溶液制備方法簡單快速。為了快速高效地完成試驗，本試驗選用正己烷提取的方式制備供試品溶液。

4.3 檢測波長的選擇

精密量取系統(tǒng)適用性溶液，采用二極管陣列檢測器進行采集，8種抗氧劑均在200 nm波長處有較大吸收，峰響應(yīng)好，因此選用200 nm為檢測波長。

參 考 文 獻

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