阿維菌素研究進(jìn)展與產(chǎn)業(yè)綜述

緱仲軒 和鳳 李紫萱 鮑葉寧 張慶 程曦

摘要：阿維菌素是阿維鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的十六元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，主結(jié)構(gòu)與米爾貝霉素相似，用于農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)防治和動(dòng)物的殺蟲(chóng)殺螨，還具有抗病毒、抗腫瘤、抗菌、消炎和醒酒等功效。它通過(guò)抑制RNA復(fù)制酶，阻止病毒蛋白進(jìn)入細(xì)胞核以及封閉剌突蛋白等方式，阻止病毒的復(fù)制感染和傳播。已經(jīng)產(chǎn)生抗藥性的分枝桿菌和金黃色葡球菌也能被阿維菌素抑制。阿維菌素世界上年需求量為5000噸左右，基本由中國(guó)企業(yè)生產(chǎn)。本文回顧了阿維菌素在菌種技術(shù)、發(fā)酵技術(shù)、提取技術(shù)、制劑技術(shù)發(fā)展和組合生物學(xué)手段在本產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用，建議通過(guò)菌種篩選技術(shù)、胞壁通透性調(diào)整、途徑工程指導(dǎo)的基因改造、發(fā)酵過(guò)程的代謝流控制、氣升式發(fā)酵罐應(yīng)用及細(xì)胞融合育種來(lái)提高發(fā)酵水平，將阿維鏈霉菌與米貝霉素鏈霉菌細(xì)胞融合育種。

關(guān)鍵詞：阿維菌素；生物活性；產(chǎn)業(yè)；綜述

中圖分類號(hào)：R978.1+5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Research advances and the industry of avermectin

Gou Zhong-xuan1，2， He Feng1， Li Zi-xuan1， Bao Ye-ning1， Zhang Qing2， and Cheng Xi3

（1 Jiangsu Food & Pharmaceutical Science College， Huaian， 223003; 2 Hebei Veyong Biochemical Co.， Ltd， Shijiazhuang? 050011;

3 Hebei Xingbai Pharmaceutical Group Co. Ltd， Shijiazhuang 051530）

Abstract Avermectin is a kind of 16-member macrolide antibiotics produced by Streptomyces avermectin fermentation， and is widely used in agricultural pest control， animal insecticidal， and acaricidal. Structurally， it is glycosylated milbemycin，and their genes of PKS （polyketide synthase） are highly homologous. Recent studies have found that avermectin also has anti-virus， anti-tumor， antibacterial， anti-inflammatory， sobriety， and other effects. Ivermectin （IVM） is effective against both Mycobacterium and Staphylococcus aureus strains. By means of inhibiting RNA helicase， preventing virus protein from entering nucleus， blocking virus spike protein， it can be used to deal with many kinds of viruses such as HIV， DENV， NDV， and so on. China is a major producer and exporter of avermectin， and the annual output is about 5000 tons. This paper reviews the development and technical progress of avermectin in China， discusses the toxicology， pharmacology， application， and industrial development of avermectin， summarizes the mechanism， application， and progress of various efficacy of avermectin， investigates the present situation of industry， and prospects the future development. It is suggested that improving the fermentation level by the method of strain screening technology， adjustment of cell wall permeability， genetic modification guided by pathway engineering， metabolic flow control in fermentation process， and application of airlift fermenter and so on. The protoplast fusion breeding of Streptomyces avermitilis and Streptomyces milbemycin strains may improve the strain level and produce new antibiotics.

Key words Avermectin; Biological activity; Industry; Review

阿維菌素（avermectin）是一類由阿維鏈霉菌（Streptomyces avermitilis）發(fā)酵產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。1974 年日本北里研究所大村智從土壤樣品中分離得到一株放線菌，其發(fā)酵提取液具有殺滅線蟲(chóng)作用。在Merk公司的努力下，1981年實(shí)現(xiàn)了阿維菌素的產(chǎn)業(yè)化。因?yàn)榘⒕S菌素的發(fā)現(xiàn)，日本大村智與威廉·坎貝爾分享了2015年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)獎(jiǎng)金的1/2（中國(guó)科學(xué)家屠呦呦教授因發(fā)現(xiàn)抗瘧藥青蒿素而獲得獎(jiǎng)金的另1/2）。1984年上海市農(nóng)藥研究所分離出產(chǎn)阿維菌素的菌株，并在海門制藥廠產(chǎn)業(yè)化。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)1986 年開(kāi)始研究阿維菌素的研究，后與齊魯制藥廠合作實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化?，F(xiàn)在全球阿維菌素年需求量大約5000T，全部由中國(guó)企業(yè)生產(chǎn)。筆者自 2006 年起專注于阿維菌素研究，并綜述了當(dāng)時(shí)阿維菌素產(chǎn)業(yè)概況[1]。十余年來(lái)，阿維菌素技術(shù)發(fā)展迅速，許多新的生物活性也不斷地被發(fā)現(xiàn)。筆者在多年的研究的基礎(chǔ)上通過(guò)業(yè)內(nèi)調(diào)查與文獻(xiàn)調(diào)研，對(duì)阿維菌素的研究及產(chǎn)業(yè)進(jìn)行綜述。

1 阿維菌素家族

1.1 阿維菌素與殺蟲(chóng)抗螨類化合物

阿維菌素并不是最早發(fā)現(xiàn)的天然殺蟲(chóng)抗生素。1958年發(fā)現(xiàn)吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopius）產(chǎn)生的潮霉素B和1967年發(fā)現(xiàn)的米爾貝霉素（milbemycin）都具有殺蟲(chóng)與殺螨作用，阿維菌素閃亮登場(chǎng)之后，很快成為殺蟲(chóng)殺螨的主角。值得注意的是，米爾貝霉素結(jié)構(gòu)與阿維菌素高度相似（圖 1），阿維菌素可以說(shuō)是糖基化的米爾貝霉素[2]。近年來(lái)兩者的姻親關(guān)系受到關(guān)注，通過(guò)組合生物學(xué)，重組兩種菌的相關(guān)基因，可直接發(fā)酵生產(chǎn)依維菌素[3]。

1.2 阿維菌素系列產(chǎn)品

以阿維菌素為母體進(jìn)行修飾與改造，得了許多高效、低毒的產(chǎn)品。已經(jīng)商品化的產(chǎn)品有依普菌素（Eprinomectin，EPM）、?，斁兀‥mamectin，EMM）、道拉菌素（Doramectin，DRM）、依維菌素（Ivermectin，IVM）和 塞拉菌素（selamectin，SLM）等（圖2）。阿維菌素分子中齊墩果糖C4''位的改造產(chǎn)生了?，斁睾鸵榔站?。埃瑪菌素對(duì)溫血?jiǎng)游锏亩拘愿?，水溶性更好，?duì)鱗翅目害蟲(chóng)特效。C4''引入乙酰氨基，即為依普菌素，乙酰氨基引入后，改變了藥物在牛乳和血清中的分配比例，使得牛乳中的殘留更低，更安全。阿維菌素C22與23位雙鍵加氫即為依維菌素，依維菌素急性口服毒性更低、藥效期更長(zhǎng)、生物利用度更高、穩(wěn)定性更好、活性更強(qiáng)。道拉菌素是利用基因突變生物合成的，它在阿維菌素C25位連接了環(huán)己烷基，具有更廣的驅(qū)蟲(chóng)譜，對(duì)多種家畜寄生線蟲(chóng)有很高的防效，遠(yuǎn)優(yōu)于依維菌素。2014年，海正藥業(yè)對(duì)阿維菌素產(chǎn)生菌和米爾貝霉素生產(chǎn)菌基因改造，得到一株可發(fā)酵生產(chǎn)天維菌素（Tenvermectin）的新菌株。天維菌素對(duì)朱砂葉螨、小菜蛾、粘蟲(chóng)和松材線蟲(chóng)等的殺滅性更優(yōu)。以上的衍生物主要以阿維菌素B1a為出發(fā)化合物進(jìn)行的結(jié)構(gòu)改造，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)阿維菌素B2a的殺蟲(chóng)活性優(yōu)于B1a，且對(duì)溫血?jiǎng)游锏亩拘缘陀贐1a，因而進(jìn)行了農(nóng)藥登記[4]。

2 阿維菌素的生物活性研究

2.1 阿維菌素的殺蟲(chóng)抗螨活性

阿維菌素最初是以殺蟲(chóng)劑的形式商業(yè)化的，因產(chǎn)品由B1a（占80%）和B1b（占20%）構(gòu)成，故英文名稱為abamectin。與傳統(tǒng)農(nóng)藥相比，abamectin殺蟲(chóng)活力強(qiáng)，易于分解，農(nóng)藥殘留低，對(duì)環(huán)境的危害小。 阿維菌素家族中的依維菌素對(duì)服用者的急性口服毒性低、藥效期更長(zhǎng)，因而成為廣譜獸用殺蟲(chóng)劑與人用抗寄生蟲(chóng)藥。瘧疾是由蚊子攜帶的瘧原蟲(chóng)傳播的一種疾病，瘧原蟲(chóng)生活周期復(fù)雜，常常產(chǎn)生抗藥性。依維菌素可殺滅按蚊，阻止了瘧疾傳播[5]，它還能阻止寄生蟲(chóng)侵入肝臟，降低血液的瘧原蟲(chóng)濃度，用于瘧疾治療[6]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，依維菌素治療中會(huì)有輕微的神經(jīng)毒性反應(yīng)[7]。

2.2 阿維菌素的抗菌活性

過(guò)去認(rèn)為阿維菌素不過(guò)是一種殺蟲(chóng)劑，對(duì)微生物不起作用。2013年人們發(fā)現(xiàn)，阿維菌素居然對(duì)已產(chǎn)生抗藥性的兩種分枝桿菌有抑制作用[8]，其殺菌機(jī)理是通過(guò)分枝桿菌特殊的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)而起作用。阿維菌素的殺菌性能受到甘油的影響，有甘油存在的情況下，塞拉菌素、莫西菌素（moxidectin）和道拉菌素對(duì)分枝桿菌的活性大大地降低，而依維菌素受甘油的影響比較小[9]。菌膜的形成能夠增強(qiáng)金黃色葡萄球菌的耐藥性，對(duì)金黃色葡萄球菌引起的疾病治療帶來(lái)嚴(yán)重挑戰(zhàn)，而依維菌素對(duì)金黃色葡萄球菌菌膜有良好的殺滅作用[10]。青霉素是最古老的一種抗生素，由于長(zhǎng)期的使用，青霉素耐藥菌成為一個(gè)棘手的問(wèn)題，而依維菌素能抑制對(duì)甲氧基青霉素已有抗藥性的金黃色葡萄球菌[11]。這些發(fā)現(xiàn)有可能開(kāi)拓阿維菌素的臨床應(yīng)用，為新型抗菌藥開(kāi)發(fā)提供參考。

2.3 皮膚消炎活性

阿維菌素消炎活性研究最多的是依維菌素，它的消炎活性使得阿維菌素可能被開(kāi)發(fā)成為一種皮膚消炎藥。T細(xì)胞引起的皮膚發(fā)炎中，由于肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞釋放化學(xué)物質(zhì)，作用于附近的毛細(xì)血管，導(dǎo)致毛細(xì)血管擴(kuò)張，通透性增大，局部組織血流量增多，致使傷口周圍出現(xiàn)紅腫熱的現(xiàn)象，即炎癥反應(yīng)，而依維菌素能夠調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的免疫活性，消除炎癥反應(yīng)[12]。小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，外用依維菌素可以延緩皮膚粉塵螨導(dǎo)致的過(guò)敏炎癥的發(fā)生[13]。

2.4 抗病毒活性

阿維菌素的抗病毒機(jī)理（圖3）所示。阿維菌素能夠抑制RNA解旋酶，阻止了RNA病毒的復(fù)制，因而能夠用于治療許多RNA病毒相關(guān)的疾病。以黃熱病毒為例，它會(huì)引起登革熱、黃熱病和蜱型腦炎等疾病。為了篩選出對(duì)抗黃熱病毒的藥物，人們從Kunjing病毒NS3 helicase中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的解旋蛋白位點(diǎn)，而依維菌素恰恰能與這個(gè)位點(diǎn)結(jié)合，從而阻止了病毒 RNA 的復(fù)制[14]。病毒蛋白進(jìn)入細(xì)胞核是其感染復(fù)制的重要一環(huán)，依維菌素 能夠阻止病毒蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，因而抑制病毒的傳播。以HIV-1和登革熱病毒為例，依維菌素能夠抑制運(yùn)輸?shù)鞍爪?β介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致病毒蛋白滯留在細(xì)胞膜與核之間，從而抑制了HIV-1和登革熱病毒的復(fù)制[15]。新城雞瘟病毒（NDV）的防治中發(fā)現(xiàn)，50 μg/mL 的依維菌素就具有細(xì)胞毒性，而對(duì)病毒最有效的抑制濃度是100 μg/mL以上[16]，這意味著要用于NDV臨床，依維菌素還需要進(jìn)行某些改進(jìn)。對(duì)于登革熱病毒，依維菌素可以在任何一道傳播途徑上阻止蚊子來(lái)傳播病毒[17]，這使得依維菌素有可能成為一種有效預(yù)防與治療登革熱病的藥物。 SARS-CoV-2病毒能引起嚴(yán)重急性呼吸綜合癥（SARS），依維菌素有可能成為一種治療藥物[18]。2020年3月6日，法國(guó)一名66歲女士因疥瘡住院。醫(yī)院順理成章地使用了依維菌素（400和200 μg/kg的劑量）進(jìn)行治療。該患者3月25日SARS-CoV-2基因檢測(cè)為陽(yáng)性，4月7日就轉(zhuǎn)陰。SARS-CoV-2傳染性強(qiáng)，且60歲以上的老人為高危高死亡率人群，但該患者不僅自己很快地轉(zhuǎn)為陰性，且其密切接觸者均為陰性，這可能與她恰好使用依維菌素有關(guān)[19]。依維菌素具有廣譜抗病毒活性，可抑制SARS-CoV-2感染，把病毒的感染率降低5000倍[20]。依維菌素氣霧劑可能是一種治療與預(yù)防新冠病毒的新方法[21]。依維菌素抑制SARS-CoV-2的機(jī)理尚不明確，一種推測(cè)是依維菌素能阻止病毒蛋白進(jìn)入細(xì)胞核。大多數(shù)的RNA 病毒在感染時(shí)依賴于核質(zhì)運(yùn)輸載體IMPα/β，而依維菌素能阻止其進(jìn)入細(xì)胞核并啟動(dòng)抗病毒響應(yīng)。另一種機(jī)制是通過(guò)轉(zhuǎn)膜受體CD147起作用。CD147和ACE-2 是 SARS-CoV-2剌突蛋白結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)SARS-CoV-刺突蛋白結(jié)合到CD147與ACE-2靶點(diǎn)時(shí)依維菌素可以封閉住病毒的刺突蛋白，從而阻斷了病毒的感染[22]。

2.5 阿維菌素的抗腫瘤活性

抗腫瘤活性使得阿維菌素有可能重新定位為一種抗腫瘤藥[23]。實(shí)驗(yàn)表明，依維菌素對(duì)白血病、前列腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌和結(jié)腸癌等均有效果。阿維菌素的抗腫瘤機(jī)理是多樣的（表1）。 Didier等[24]發(fā)現(xiàn)依維菌素可以抑制MDR，從而幫助抗腫瘤藥物更好地發(fā)揮功效。另外，依維菌素在極低濃度下就可以誘導(dǎo)急性髓系白血病細(xì)胞的死亡，抑制了小鼠腫瘤的生長(zhǎng)。依維菌素的作用靶點(diǎn)是線蟲(chóng)的氯離子通道，因而Sharmeen等[22]研究了依維菌素對(duì)白血病細(xì)胞氯離子流的影響，發(fā)現(xiàn)依維菌素提高了胞間氯離子濃度，導(dǎo)致細(xì)胞膜的超極化，細(xì)胞變大。依維菌素能抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和HBMEC細(xì)胞Akt、mTOR 和核糖體S6的磷酸化， 說(shuō)明其在Akt/mTOR pathway 的失活過(guò)程中具有抑制作用。

2.6 解酒作用

阿維菌素家族中的塞拉菌素、阿維菌素B1a、依維菌素和莫西菌素均具有解酒作用[34]。它一是降低了酒精的吸收，二是降低了大腦中的酒精濃度。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，依維菌素在1.25～10 mg/kg的劑量可以減少酒精的吸收[35]。酒精濫用（alcohol use disorders， AUDs）在美國(guó)的致病率與致死率排名榜上排名第三，影響著180萬(wàn)人的健康，每年有10萬(wàn)人死于AUD，阿維菌素為這些癮君子帶來(lái)了健康的希望。

2.7 阿維菌素的毒性與副作用

與大多數(shù)藥物一樣，阿維菌素也存在副作用。研究依維菌素對(duì)肝巨噬細(xì)胞影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，伊維菌素對(duì)肝巨噬細(xì)胞的吞噬功能無(wú)影響，但阻斷了LPS誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子、NO和前列腺素E2的分泌，增加了細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度[36]。過(guò)量攝入阿維菌素會(huì)引起呼吸衰竭、血壓升高與昏迷，處理不及時(shí)則會(huì)引起死亡[37]。阿維菌素藥性發(fā)作時(shí)首先表現(xiàn)為過(guò)度興奮，肌肉與身體不受控制地抖動(dòng)，然后機(jī)能失調(diào)、昏迷。動(dòng)物的P-糖蛋白受損會(huì)增強(qiáng)AVM的毒性。阿維菌素中依維菌素的副作用最小，且持續(xù)時(shí)間短。慢性毒性試驗(yàn)研究表明阿維菌素B1a最小作用量為0.25 mg/kg，致畸率的最小作用劑量為0.4 mg/kg·d。依維菌素的神經(jīng)毒性在小鼠身上表現(xiàn)為代謝失調(diào)、行動(dòng)遲緩、眼瞼下垂，表現(xiàn)在狗身上是多涎、失調(diào)、失明、昏迷、呼吸受損、震顫、瞳孔散大、厭食和死亡。幼鼠對(duì)依維菌素的毒性更敏感，一是因?yàn)橛资蟮哪X血屏障弱，二是因?yàn)橛资笕鄙貾-糖蛋白。對(duì)狗而言，MDR1基因變異的狗對(duì)依維菌素的神經(jīng)毒性更敏感，因?yàn)樵摶虻淖儺悓?dǎo)致P-糖蛋白合成受到影響。

3 阿維菌素的生產(chǎn)技術(shù)

3.1 阿維菌素生物合成途徑

阿維菌素的生物合成機(jī)理已經(jīng)比較清晰，國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)也有很好的綜述[38]。簡(jiǎn)而言之，這是一個(gè)多步驟的酶促合成反應(yīng)，前體物質(zhì)是Val和Ile。其PKS的合成途徑與紅霉素、米爾貝霉素的合成過(guò)程非常相似，即首先在PKS酶催化下，乙酸鹽、丙酸鹽和支鏈脂肪酸起始單元依次聚合形成聚酮鏈，聚酮鏈內(nèi)酯鍵環(huán)化形成起始糖苷配基。再經(jīng)過(guò)一系列修飾轉(zhuǎn)化為阿維菌素糖苷配基。最后再經(jīng)糖基化修飾完成阿維菌素的生物合成。如圖4所示，阿維菌素生物合成基因簇全長(zhǎng)82 kb，共有18個(gè)開(kāi)放讀碼框，米爾貝霉素的合成基因短一些，排列方向也與阿維菌素不同。這些基因的基本功能已經(jīng)明確。aveA1-4 編碼 PKS酶，aveB1-8編碼糖基化相關(guān)的酶。米爾貝霉素沒(méi)有糖基化，因而也沒(méi)有B基因。阿維菌素起始酰基轉(zhuǎn)移酶（AveAT0）能夠以2-甲基丁酰-輔酶A和異丁酰-CoA作為起始單元分別合成“a”系列或“b”系列的阿維菌素。不同的起始?；D(zhuǎn)移酶識(shí)別不同的底物，通過(guò)這些酰基轉(zhuǎn)移酶序列比對(duì)，找到了AveAT0底物結(jié)合重要的氨基酸，為改造阿維菌素聚酮合酶?；D(zhuǎn)移酶提供了依據(jù)[39]。

3.2 菌種技術(shù)

利用自然育種與誘變育種推動(dòng)阿維菌素菌種進(jìn)步的工作一直都在進(jìn)行，誘變方法有NTG、紫外線、太空誘變[40]、重離子束、Co60-γ射線[41]等。邢新會(huì)教授研發(fā)的常壓常溫等離子體（ARTP）誘變技術(shù)也在阿維菌素育種中進(jìn)行了應(yīng)用[42]。江南大學(xué)集成 Qpix420微生物篩選系統(tǒng)、自動(dòng)化移液工作站和酶標(biāo)儀多孔板檢測(cè)等技術(shù)，建立了高通量篩選方法[43]，值得關(guān)注。高弘等[44]用96孔板代替搖瓶進(jìn)行菌株的快速篩選與發(fā)酵，提高了篩選效率。在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)鏈霉菌時(shí)，抗生素開(kāi)始大量合成發(fā)生在從基質(zhì)菌絲向氣生菌絲生長(zhǎng)階段；而在液體培養(yǎng)中抗生素合成則發(fā)生在從指數(shù)生長(zhǎng)期過(guò)渡到穩(wěn)定生長(zhǎng)期階段。程曦通過(guò)HPLC測(cè)定了平板上的菌落效價(jià)與搖瓶效價(jià)，發(fā)現(xiàn)二者高度相關(guān)，并建立了快速篩選方法[45]。鏈霉菌次級(jí)代謝產(chǎn)生抗生素的過(guò)程，受到了一系列外界營(yíng)養(yǎng)環(huán)境信號(hào)和生理信號(hào)的復(fù)雜調(diào)控。阿維菌素的合成基因受aveR的調(diào)控，而aveR則被σhrdB識(shí)別與激活，將hrdB基因進(jìn)行反向生物工程，成功地提高了阿維菌素產(chǎn)量[46]。

依維菌素傳統(tǒng)工藝是將阿維菌素B1a精品在反應(yīng)釜中催化加氫而產(chǎn)生的，現(xiàn)在通過(guò)組合生物合成技術(shù)學(xué)，可直接由鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生依維菌素。2003年Gaisser等[47]最早報(bào)道了工程設(shè)計(jì)PKS的重組菌株具有直接合成依維菌素的能力，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)用不同的技術(shù)路線也構(gòu)建了直接合成依維菌素的菌株[3]。米爾貝霉素是與阿維菌素結(jié)構(gòu)類似的殺蟲(chóng)藥物，用來(lái)自冰城鏈霉菌米爾貝霉素PKS模塊2的DH-ER-KR替換aveDH2-KR2的新菌株可直接發(fā)酵生產(chǎn)依維菌素，其效價(jià)可達(dá)3450 μg/mL[2]。

3.3 發(fā)酵技術(shù)

阿維菌素的發(fā)酵進(jìn)展主要體現(xiàn)在發(fā)酵品種增加、

發(fā)酵效價(jià)提高，發(fā)酵罐容積擴(kuò)大，其核心是提高產(chǎn)能，降低成本。阿維菌素剛剛投入生產(chǎn)時(shí)，發(fā)酵后提取的也是阿維菌素8種成份的混和物，當(dāng)時(shí)也是用總效價(jià)來(lái)衡量發(fā)酵水平。20多年來(lái)，發(fā)酵罐容積從70 t發(fā)展到500 t，發(fā)酵單位從200單位到6000單位，發(fā)酵時(shí)間從當(dāng)初的50 h發(fā)展到360 h。阿維菌素發(fā)酵使用的是機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐，LIGHGTINA315 和CD-6的組合攪拌裝置最有利于菌體形成致密的菌絲團(tuán)，利于阿維菌素的發(fā)酵[48]。阿維鏈霉菌的生長(zhǎng)溫度與產(chǎn)素溫度并不完全相同，趙樂(lè)等[49]采用變溫控制來(lái)改善發(fā)酵效率，結(jié)果發(fā)酵液平均效價(jià)提高18.7%。阿維菌素發(fā)酵過(guò)程存在著泡沫問(wèn)題，影響裝液量，并可能造成染菌。企業(yè)常用的消泡方法是化學(xué)法（豆油或泡敵等）和物理法（耙式消泡槳）。一種基于泡沫旋風(fēng)分離與發(fā)酵尾氣再回收相結(jié)合原理的新型阻沫回收分離器的應(yīng)用，使得裝料體積增加22.47%[50]。程曦等[51]研究了生產(chǎn)線上發(fā)酵罐的最佳液位，發(fā)現(xiàn)液位控制在96%，并控制好合適的風(fēng)量，發(fā)酵效價(jià)最高可達(dá)6758 μg/g。通過(guò)補(bǔ)料技術(shù)控制pH與糖濃度可以提高發(fā)酵的水平，李永亮[52]優(yōu)化了補(bǔ)料技術(shù)，使產(chǎn)能提高了28%以上。阿維菌素發(fā)酵過(guò)程中還常常采用帶放工藝，它提高了設(shè)備產(chǎn)能，增加阿維菌素發(fā)酵放罐體積[34]。筆者曾在某企業(yè)偶遇發(fā)酵罐軸故障。該罐僅靠無(wú)菌空氣來(lái)維持傳質(zhì)，但其發(fā)酵單位并不低于其它正常攪拌的發(fā)酵罐，因而氣升式發(fā)酵罐可能更適合于阿維菌素的發(fā)酵。

3.4 提取純化技術(shù)

阿維菌素發(fā)酵結(jié)束后，經(jīng)過(guò)升溫滅活、過(guò)濾、閃蒸、浸提、濃縮、高溫水洗殘?zhí)?、活性碳脫色、結(jié)晶等步驟，最后得到阿維菌素B1a的粗品（圖5）。阿維菌素菌絲體提取過(guò)程中也有用超聲波來(lái)提高浸提效率的研究，超聲波循環(huán)提取設(shè)備的一次提取率可高達(dá)96％以上[54]。也有改進(jìn)溶劑用超聲波輔助直接從濕菌絲體浸提阿維菌素的新工藝[55]，但未見(jiàn)投入應(yīng)用。粗品二次溶解后，再結(jié)晶得到阿維菌素的精品。二次晶的質(zhì)量直接決定著最終產(chǎn)品的質(zhì)量，企業(yè)對(duì)于這一步工藝實(shí)行嚴(yán)格的保密措施，因而重結(jié)晶技術(shù)的公開(kāi)報(bào)道并不多見(jiàn)。中科院過(guò)程所分離科學(xué)與工程實(shí)驗(yàn)室曾公開(kāi)報(bào)道了阿維菌素重結(jié)晶技術(shù)研究成果，值得借鑒與參考[56]。

4 阿維菌素的應(yīng)用

4.1 農(nóng)藥的應(yīng)用

阿維菌素是高毒農(nóng)藥，無(wú)致畸、致癌、致突變作用，內(nèi)吸性不佳，觸殺毒性一般。好在它對(duì)葉片具有很強(qiáng)的滲透性，噴灑到植物上后，作物會(huì)吸收藥劑，使藥液遍布整株作物。這樣害蟲(chóng)吃后會(huì)中毒死亡，同時(shí)它還能抑制新生的幼蟲(chóng)潛入葉內(nèi)。現(xiàn)主要用于蔬菜、水稻、棉花、茶樹(shù)、果樹(shù)以及園林花卉的殺蟲(chóng)、殺螨。隨著阿維菌素的應(yīng)用，害蟲(chóng)的抗藥性隨之產(chǎn)生，因而建議聯(lián)合用藥。制劑技術(shù)可以提高阿維菌素的藥效，制劑的發(fā)展方向是水基化、超微化、無(wú)粉塵、控制釋放。

阿維菌素對(duì)哺乳動(dòng)物的繁殖能力具有毒性作用，中毒后沒(méi)有特效解毒藥物，只能采取吸氧、洗胃、補(bǔ)液、利尿等措施。因而，國(guó)際上對(duì)阿維菌素的 MRL（maximum residue limit）要求非常嚴(yán)格。阿維菌素對(duì)光敏感，C8-C9和C10-C11位的雙鍵會(huì)吸收紫外線能量而分解破壞。阿維菌素還易于被土壤吸附，不易被雨水沖刷和下滲，因而對(duì)水質(zhì)影響不大。

4.2 獸藥的應(yīng)用

1981年美國(guó)Merk公司把阿維菌素作為獸藥投入市場(chǎng)，用做家畜驅(qū)蟲(chóng)劑與寵物用藥，治療多種家畜體內(nèi)外寄生蟲(chóng)病。阿維菌素是脂溶性藥物，無(wú)論是口服、皮下注射、還是腸道給藥，均吸收良好，并分布至全身各組織，能充分地發(fā)揮其驅(qū)蟲(chóng)殺蟲(chóng)效果。單就吸收速率而言，口服效果明顯比皮下注射快。但皮下注射在體內(nèi)持效時(shí)間長(zhǎng)，所以生物利用度比口服高。常用的有依維菌素、道拉菌素和乙酰氨基阿維菌素等[57]。由于阿維菌素的脂溶性，在動(dòng)物體內(nèi)存留時(shí)間長(zhǎng)，使用阿維菌素產(chǎn)品的肉食飼養(yǎng)動(dòng)物屠宰前的休藥期更長(zhǎng)。

4.3 人用藥的應(yīng)用

阿維菌素的殺蟲(chóng)殺螨功能在人用藥方面已有應(yīng)用。依維菌素在1988年首先成功地用于治療盤尾蟲(chóng)病和淋巴絲蟲(chóng)病[58]，后來(lái)還用于治療線蟲(chóng)感染、蛔蟲(chóng)和皮膚寄生蟲(chóng)病。對(duì)登革熱、瘧疾疫區(qū)而言，阿維菌素是一種有效的藥物[59]。因?yàn)樗目鼓[瘤、消炎、抗病毒作用，未來(lái)有可能以阿維菌素為先導(dǎo)化合物，開(kāi)發(fā)出更多的抗腫瘤藥物、皮膚過(guò)敏消炎藥物、抗病毒藥物等，可能會(huì)推動(dòng)基于阿維菌素的SARS-CoV-2的抑制藥物的研發(fā)。由于阿維菌素對(duì)HIV的抑制作用，也可能應(yīng)用于艾滋病雞尾酒療法中。

5 阿維菌素的產(chǎn)業(yè)展望

5.1 生產(chǎn)企業(yè)與產(chǎn)能

阿維菌素主要產(chǎn)自中國(guó)。中國(guó)現(xiàn)在有10余家企業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)阿維菌素，產(chǎn)能充足。2010 年4月，中國(guó)13家阿維菌素生產(chǎn)企業(yè)成立了阿維菌素產(chǎn)業(yè)聯(lián)盟，希望通過(guò)產(chǎn)能控制與技術(shù)協(xié)作來(lái)保護(hù)阿維菌素產(chǎn)業(yè)，相約輪流做東每年召開(kāi)一次年會(huì)，遺憾的是該年會(huì)只持續(xù)了兩屆。阿維菌素產(chǎn)品協(xié)作組是由中國(guó)農(nóng)藥工業(yè)協(xié)會(huì)組織的，一直在運(yùn)轉(zhuǎn)與協(xié)作交流。主要的阿維菌素生產(chǎn)企業(yè)如表2所示，阿維菌素原藥主要來(lái)自于表2中的前五家。2018年12月，河北省批準(zhǔn)成立了河北省阿維菌素生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，依托單位是河北興柏農(nóng)業(yè)科技有限公司，相信在科技的支持下，阿維菌素產(chǎn)業(yè)會(huì)不斷地茁壯成長(zhǎng)。

5.2 市場(chǎng)需求與價(jià)格

阿維菌素B1a原料一部分用于依維菌素、甲維鹽的合成，一部分用于農(nóng)藥制劑的配制。其價(jià)格受市場(chǎng)與病蟲(chóng)害的影響很大，阿維菌素B1a精品一般在500～1200 元/kg之間，最低價(jià)500元基本是企業(yè)的保本線。國(guó)內(nèi)阿維菌素產(chǎn)品的第一出口國(guó)是美國(guó)，占出口量的30%以上。阿維菌素的需要量受自然因素影響比較大，即使在避光的情況下，阿維菌素原料藥長(zhǎng)期貯存過(guò)程中也會(huì)緩慢分解，影響產(chǎn)品質(zhì)量。因而，阿維菌素企業(yè)不可能通過(guò)大量地生產(chǎn)與貯存阿維菌素來(lái)對(duì)抗市場(chǎng)風(fēng)險(xiǎn)，現(xiàn)行的做法是生產(chǎn)其它的發(fā)酵品種來(lái)抵御市場(chǎng)風(fēng)險(xiǎn)。

5.3 展望與研究建議

放線菌所產(chǎn)抗生素的90%由鏈霉菌產(chǎn)生，鏈霉菌中研究最為透徹的菌株是天藍(lán)色鏈霉菌、灰色鏈霉菌和阿維鏈霉菌，這3株菌的全基因組測(cè)序已經(jīng)完成，為后續(xù)的基因改造鋪平了道路。預(yù)計(jì)未來(lái)阿維鏈霉菌可作為一個(gè)宿主菌來(lái)生產(chǎn)越來(lái)越多的抗生素。例如端粒酶抑素是一種抗腫瘤物質(zhì)，本由 Streptomyces annulatusv發(fā)酵生產(chǎn)，2017年通過(guò)轉(zhuǎn)基因改造后，由Streptomyces avermitilis生產(chǎn)[60]。

對(duì)于阿維菌素發(fā)酵技術(shù)的提升給出以下建議： ①改變細(xì)胞通透性來(lái)提高阿維菌素物發(fā)酵水平。阿維菌素是一種胞內(nèi)產(chǎn)物，大量積累會(huì)反饋影響發(fā)酵水平。通過(guò)特殊控制方法來(lái)改變細(xì)胞通透性，使阿維菌素部分分泌到細(xì)胞外，消除反饋抑制，很有可能提高阿維菌素的產(chǎn)量。②在菌種的篩選過(guò)程中，向固體培養(yǎng)基中加入阿維菌素，篩選耐受高濃度阿維菌素的菌株。加入阿維菌素發(fā)酵液，篩選對(duì)阿維菌素代謝產(chǎn)物有耐受性的菌株。通過(guò)加入阿維菌素前體來(lái)推理育種，篩選高產(chǎn)菌株。③借鑒天藍(lán)色鏈霉菌的次級(jí)代謝調(diào)控研究成果[61]，對(duì)阿維鏈霉菌進(jìn)行基因改造。鏈霉菌次級(jí)代謝具有一定的復(fù)雜性，簡(jiǎn)單的代謝途徑基因改造往往不能奏效。以天藍(lán)色鏈霉菌為對(duì)象的次級(jí)代謝調(diào)控取得了很多的進(jìn)展，借鑒這些調(diào)控機(jī)制來(lái)改造阿維鏈霉菌基因可能會(huì)事半而功倍。④利用多參數(shù)在線傳感器監(jiān)控代謝過(guò)程的代謝流的變化，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)成份與理化指標(biāo)的控制來(lái)調(diào)整代謝流，提升阿維菌素的產(chǎn)量。⑤在發(fā)酵設(shè)備上，建議研究氣升式發(fā)酵設(shè)備進(jìn)行阿維菌素的生產(chǎn)。阿維鏈霉菌對(duì)剪切力敏感，機(jī)械攪拌對(duì)菌絲球破壞較大，而氣升式發(fā)酵罐剪切力小，可能更適合阿維鏈霉菌發(fā)酵。⑥化學(xué)結(jié)構(gòu)上米爾貝霉素與阿維菌素高度相似，也都是鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)的。因此建議把阿維鏈霉菌與Streptomyces milbemycinicus進(jìn)行細(xì)胞融合育種，這樣有可能提高阿維菌素或米爾貝霉素的產(chǎn)量，也有可能篩選出新的抗生素品種。

阿維菌素的替代品種是多殺菌素，由美國(guó)陶氏益農(nóng)公司生產(chǎn)，與阿維菌素相比，多殺菌素是低毒的生物殺蟲(chóng)劑，適合無(wú)公害蔬菜、水果生產(chǎn)應(yīng)用，目前還不能完全取代阿維菌素。而阿維菌素在抗腫瘤、抗菌、抗病毒等活性的發(fā)現(xiàn)必然促使阿維菌素的重新定位，相信未來(lái)的阿維菌素產(chǎn)品會(huì)更豐富，應(yīng)用會(huì)更廣泛。

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