白鮮皮多糖的提取及分子特性研究

曹榮安，李良玉，林劍，瞿東楊，張邢晨，賈建

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院，大慶163319；2.國家雜糧工程技術(shù)研究中心/黑龍江八一農(nóng)墾大學；3.龍游伊利乳業(yè)有限責任公司）

白鮮皮多糖的提取及分子特性研究

曹榮安1，李良玉2，林劍3，瞿東楊1，張邢晨1，賈建1

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院，大慶163319；2.國家雜糧工程技術(shù)研究中心/黑龍江八一農(nóng)墾大學；3.龍游伊利乳業(yè)有限責任公司）

以白鮮皮為原料提取多糖，優(yōu)化提取參數(shù)，分析其分子特性。首先在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化白鮮皮多糖的提取參數(shù)，最佳參數(shù)為液料比23.87（mL：g）、溫度87.71℃、提取時間2.38 h，多糖得率為7.1%。白鮮皮多糖的化學組成為86.1%總糖、9.2%蛋白質(zhì)和7.1%糖醛酸，單糖組成主要為85.5%葡萄糖，同時還含有5.2%半乳糖、4.7%阿拉伯糖、2.0%木糖、1.4%鼠李糖、1.1%甘露糖和0.1%巖藻糖。分子質(zhì)量和分子質(zhì)量分布情況研究表明，在RI色譜圖洗脫時間44～53 min白鮮皮多糖存在一個對稱峰，其分子質(zhì)量為369.9×103u，回轉(zhuǎn)半徑為250.0 nm。

白鮮皮；多糖；提??；分子特性

白鮮（Dictamnus L.）是蕓香科白鮮屬多年生草本植物，有濃烈的特殊氣味，主要分布在亞洲大陸，約有五種，我國有白鮮（Dictamnus L.）和新疆白鮮（Dictamnus angustifolius G.Don.）兩種［1］。白鮮皮（Dictamnus dasycarpus Turcz）為白鮮的干燥根皮，為我國傳統(tǒng)中草藥，其味苦、性寒?！端幮哉摗分性?jīng)記載，白鮮皮治一切熱毒風、惡風、風瘡、疥癬赤爛、眉發(fā)脫脆、皮肌急、壯熱惡寒，主解熱黃、酒黃、急黃、谷黃、勞黃等?！吨袊幍洹肥蛰d記錄其功能主治有清熱燥濕、祛風解毒，用于濕熱瘡毒、黃水淋漓、濕疹、風疹、疥癬瘡癩、風濕熱痹、黃疸尿赤［2］?，F(xiàn)代研究表明白鮮皮的藥理作用有抗氧化、抗菌、抗炎、抗癌、抗內(nèi)毒素、抗過敏、殺蟲、止血、保護神經(jīng)和肝臟等作用［3-16］，臨床上主要用于治療慢性支氣管炎、皮膚脫皮癥、風濕性關(guān)節(jié)炎、外出血、蕁麻疹、濕疹等［17-18］。目前，從白鮮皮中分離得到的化學成分包括生物堿類、檸檬苦素類、倍半萜及其倍半萜昔類、香豆素類、黃酮類、揮發(fā)油類、甾體類及多糖化合物等［19-25］，但對白鮮皮多糖的研究報道很少。試驗以白鮮皮為原料提取多糖，研究提取參數(shù)，之后分析化學成分、單糖組成和分子量，為白鮮皮多糖的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白鮮皮（市購，產(chǎn)地黑龍江），蛋白質(zhì)定量試劑盒（DC protein assay kit）購自美國Bio-Rad公司，單糖標準品、牛血清蛋白、明膠、葡萄糖醛酸購自美國Sigma-Aldrich公司，其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

3802 UV/VZS分光光度計，美國Unico公司；TSK Gel色譜柱，日本TOSOH公司；2487紫外檢測器，美國Waters公司；DAWN HELEOS多角度激光光散射檢測器，美國Wyatt公司；2414示差折光檢測器，美國Waters公司；6890N/MSD5973氣質(zhì)聯(lián)用儀（GC-MS），美國Agilent公司。

1.3 白鮮皮多糖提取參數(shù)研究

1.3.1 提取工藝

原料挑選除雜烘干后研磨過40目篩，加入85%乙醇70℃加熱回流攪拌2 h后室溫攪拌12 h，離心后沉淀加入無水乙醇室溫攪拌，離心去上清液后沉淀自然干燥。加入蒸餾水進行浸提，離心后收集提取液，殘渣按照相同程序再提取一次，合并兩次的提取液，真空濃縮后加入乙醇使最終乙醇的體積分數(shù)為80%，攪拌10 min后放入4℃冰箱中靜置12 h，離心后棄去上清液，沉淀加入無水乙醇洗滌兩次，離心后沉淀室溫干燥。稱重計算多糖得率，公式為：多糖得率/%=（提取得到的多糖質(zhì)量/水提時原料質(zhì)量）×100。

1.3.2 單因素試驗

1.3.2.1液料比對多糖得率的影響：選取液料比分別為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL∶g），提取溫度85℃，提取時間2 h，進行多糖的提取，研究液料比對多糖得率的影響。1.3.2.2提取溫度對多糖得率的影響：液料比15∶1（mL∶g），選取提取溫度分別為75、80、85、90、95℃，提取時間2 h，進行多糖的提取，研究提取溫度對多糖得率的影響。

1.3.2.3提取時間對多糖得率的影響：液料比15∶1（mL∶g），提取溫度85℃，選取提取時間分別為1、1.5、2、2.5、3 h，進行多糖的提取，研究提取時間對多糖得率的影響。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗方法

在單因素試驗基礎(chǔ)上，根據(jù)二次回歸組合試驗設(shè)計原理，以多糖得率為響應(yīng)值，設(shè)計液料比、提取溫度、提取時間三個因素的響應(yīng)面分析試驗，對提取參數(shù)進行優(yōu)化。

1.4 化學成分分析

總糖含量測定參照Dubois等人的苯酚-硫酸法［26］，葡萄糖為標準品；蛋白質(zhì)含量測定采用Lowry法（福林酚法）［27］，使用的是蛋白質(zhì)定量試劑盒，牛血清蛋白為標準品；硫酸根含量測定采用Dodgson和Price的氯化鋇-明膠濁度法［28］，硫酸鉀為標準品；糖醛酸含量測定采用Filisetti-Cozzi和Carpita的間羥基聯(lián)苯法［29］，葡萄糖醛酸為標準品。

1.5 單糖組成分析

參考Ciucanu的方法并稍作改動［30］，樣品和七種單糖標準品（鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖）分別加入三氟乙酸，100℃水解6 h，經(jīng)過還原和乙酰化制得相應(yīng)的糖醇乙酸酯衍生物。注入1 μL到GC-MS中進行分析，采用的是HP-5MS石英毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為氦氣，流速為1.2 mL·min-1。升溫程序為160～210℃（10 min之內(nèi)），之后10 min升溫到240℃，速度為5℃·min-1，保持在250℃，進樣口溫度也保持在250℃。用電子轟擊源分析，電子能量為70 eV，質(zhì)量掃描范圍為35～450 m·z-1。根據(jù)氣譜出峰時間和質(zhì)譜的離子峰與單糖標準品進行對比從而確定單糖組成。

1.6 分子質(zhì)量和分子質(zhì)量分布測定

多糖配置成質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1的溶液，60℃加熱溶解，膜過濾后注入高效尺寸排阻色譜-紫外檢測器-多角度激光光散射儀-示差折光檢測器聯(lián)用（HPSEC-UV-MALLS-RI）系統(tǒng)中檢測，結(jié)果分析采用ASTRA 6.1軟件（Wyatt Technology Corp）。

1.7 數(shù)據(jù)分析

試驗重復三次，數(shù)據(jù)采用M±SD表示，采用Sigmaplot 12.0作圖。應(yīng)用SAS 8.2軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，各試驗組之間的顯著性差異分析采用單因素方差分析（one-way ANOVA）和鄧肯氏復極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 白鮮皮多糖提取參數(shù)

2.1.1 單因素試驗結(jié)果分析

對影響白鮮皮多糖得率的三個因素液料比、提取溫度、提取時間進行單因素試驗，結(jié)果見圖1。可知在液料比10∶1～25∶1（mL∶g）范圍內(nèi)，隨著液料比的增大多糖得率呈顯著上升趨勢（P＜0.05），當液料比為25∶1（mL∶g）時多糖得率最高為6.69%，之后隨著液料比的升高，多糖得率呈現(xiàn)下降趨勢，因此，實驗選擇響應(yīng)面優(yōu)化液料比范圍為以25∶1為中心，20∶1到30∶1之間。在提取溫度75～90℃范圍內(nèi)，隨著溫度升高多糖得率顯著增加（P＜0.05），當提取溫度為90℃時多糖得率最高為6.72%，之后提取溫度升高到95℃，多糖得率呈現(xiàn)下降趨勢，因此，實驗選擇響應(yīng)面優(yōu)化提取溫度范圍為以90℃為中心，85℃到90℃之間。而提取時間對于多糖得率的影響呈現(xiàn)不同的趨勢，在1.0～3.0 h范圍內(nèi)，多糖得率一直升高，2.5 h后趨于平穩(wěn)，實驗選擇響應(yīng)面優(yōu)化提取時間范圍為以2 h為中心，1.5 h到3 h之間。

圖1 單因素試驗結(jié)果Fig.1The results of single factor experiment

2.1.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

基于單因素試驗結(jié)果確定的取值范圍，以液料比、提取溫度和提取時間這三個因素為自變量（分別以X1、X2、X3表示），以多糖得率為響應(yīng)值設(shè)計3因素共17個試驗點的三元二次回歸旋轉(zhuǎn)組合試驗，保證實驗點最少前提下提高多糖得率。因素水平編碼表見表1，試驗結(jié)果見表2。

表1 因素水平編碼表Table1Coding table of factor levels

表2 試驗安排表以及試驗結(jié)果Table 2Scheme and results of regression orthogonal rotary design

續(xù)表2試驗安排表以及試驗結(jié)果Continued table 2Scheme and results of regression orthogonal rotary design

2.1.2.1 多因素組合優(yōu)化試驗分析

對優(yōu)化試驗進行響應(yīng)面回歸分析（RSREG），回歸方程以及回歸方程各項的方差分析結(jié)果見表3，二次回歸參數(shù)模型數(shù)據(jù)見表4。

表3 回歸方程的方差分析表Table 3The ANOVA of regession equation

由表3可知，二次回歸模型的F值為25.83，P＜0.05，大于在0.05水平上的F值，而失擬項的F值為0.83，小于在0.05水平上的F值，說明該模型擬和結(jié)果好。一次項、二次項和交互項的F值均大于0.05水平上的F值，說明其對多糖得率影響顯著。根據(jù)表4的參數(shù)，以多糖得率為Y值，得出液料比、提取溫度、提取時間的編碼值為自變量的三元二次回歸方程為：

表4 二次回歸模型參數(shù)表Table 4The parameters of quadratic regression

2.1.2.2 最優(yōu)提取條件確定

為了進一步確證最佳點的值，對試驗模型進行響應(yīng)面典型分析，以獲得最大得率時的條件，結(jié)果見表5。

表5 最優(yōu)提取條件及多糖得率Table 5The optimization extraction condition and yield

由表5可以看出，液料比為23.87、溫度87.71℃、提取時間2.38 h，多糖的得率最大，理論最大得率為7.2%。

2.1.2.3 驗證試驗

按照最優(yōu)提取條件進行試驗，重復三次，白鮮皮多糖得率為7.1±0.4%，試驗值與模型的理論值非常接近，試驗條件重現(xiàn)性良好，該模型可以較好的反映出提取白鮮皮多糖的條件。李淑惠等報道的白鮮皮粗多糖收率為9.7%，高于實驗的多糖得率，其總糖含量為79.20%，而實驗提取的多糖總糖含量為86.1%，同時多糖得率的差異也與選取的原材料和提取參數(shù)不同有關(guān)［25］。同時也有利用響應(yīng)面法優(yōu)化蒲公英多糖工藝研究，提高了提取率［31］。

2.2 白鮮皮多糖的化學成分和單糖組成

對白鮮皮多糖的化學成分和單糖組成進行了測定，結(jié)果見表6。白鮮皮多糖主要由86.1%總糖、9.2%蛋白質(zhì)和7.1%糖醛酸組成，同時未檢測出硫酸根。李淑惠等報道的白鮮皮粗多糖中總糖含量為79.20%［25］，低于本實驗的總糖含量，這也是為何本實驗的多糖得率低于其多糖得率的原因。同時由圖2和表6可知，白鮮皮多糖的主要單糖為葡萄糖（85.5%），還含有少量的半乳糖（5.2%）、阿拉伯糖（4.7%）、木糖（2.0%）、鼠李糖（1.4%）、甘露糖（1.1%）和微量的巖藻糖（0.1%）。

圖2 白鮮皮多糖糖醇乙酸酯衍生物的總離子流色譜圖Fig.2Chromatogram of total ion current spectra for the alditol acetates derivatives of polysaccharides from Dictamnus dasycarpus Turcz

表6 白鮮皮多糖的化學成分和單糖組成Table 6Chemical and monosaccharide compositions of the polysaccharide from Dictamnus dasycarpus Turcz

2.3 白鮮皮多糖的分子質(zhì)量和分子質(zhì)量分布

采用HPSEC-UV-MALLS-RI聯(lián)機系統(tǒng)對白鮮皮多糖的分子質(zhì)量和分子質(zhì)量分布情況進行了研究，RI和UV色譜圖見圖3。白鮮皮多糖RI檢測曲線在洗脫時間44～53 min存在一個峰形對稱的峰，說明其是均一多糖。同時也存在較小的UV檢測峰，這與前面化學組成中蛋白質(zhì)含量是相互吻合的。同時利用ASTRA 6.1軟件進行分析，得到分子質(zhì)量（Mw）和回轉(zhuǎn)半徑（Rg）的數(shù)值，由表7可知Mw為369.9×103μ，Rg為250.0 nm。

圖3 白鮮皮多糖的RI和UV色譜圖Fig.3RI and UV chromatograms of the polysaccharide from Dictamnus dasycarpus Turcz

表7 白鮮皮多糖的分子質(zhì)量和回轉(zhuǎn)半徑Table 7Molecular weight and radius of gyration for thepolysaccharide from Dictamnus dasycarpus Turcz

3 結(jié)論

通過響應(yīng)面法優(yōu)化了白鮮皮多糖的提取條件，最佳提取參數(shù)為液料比23.87（mL∶g）、溫度87.71℃、提取時間2.38 h，多糖的得率為7.1%。之后對提取得到的白鮮皮多糖進行了分子特性研究，其總糖含量為86.1%，同時含有一定量的蛋白質(zhì)和糖醛酸，單糖組成主要為葡萄糖，同時還含有少量的其他單糖。在RI色譜圖中存在一個對稱峰，分子質(zhì)量和回轉(zhuǎn)半徑分別為369.9×103μ和250.0 nm。通過研究明確了白鮮皮多糖的提取參數(shù)和分子特性，這為下一步的純化和生物活性研究奠定了基礎(chǔ)。

［1］中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志［M］.北京：科學出版社，1997.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京：中藥醫(yī)藥科技出版社，2010.

［3］張紅晶.白鮮皮中化學成分的提取分離及活性評價研究［D］.長春：吉林農(nóng)業(yè)大學，2011.

［4］Wu X X，Wu L M，F(xiàn)an J J，et al.Cortex Dictamni extract induces apoptosis of activated hepatic stellate cells via STAT1 and attenuates liver fibrosis in mice［J］.Journal of Ethnopharmacology，2011，135（1）：173-178.

［5］艾丹.白鮮皮抗炎有效部位的研究［D］.哈爾濱：黑龍江中醫(yī)藥大學，2010.

［6］Yoon J S，Jeong E J，Yang H，et al.Inhibitory alkaloids from Dictamnus dasycarpus root barks on lipopolysaccharide-induced nitric oxide production in BV2 cells［J］. Journal of Enzyme Inhibition&Medicinal Chemistry，2012，27（4）：490-494.

［7］趙青青.中藥白鮮皮中化學成分的分離與結(jié)構(gòu)鑒定［D］.西安：西北大學，2015.

［8］郭毅斌.白鮮皮抗內(nèi)毒素的物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機制研究［D］.重慶：第三軍醫(yī)大學，2007.

［9］唐忠芬.白鮮皮提取物抗過敏作用的實驗研究以及在濕疹中的運用［D］.成都：成都中醫(yī)藥大學，2006.

［10］Jiang S，Nakano Y，Rahman M R，et al.Effects of a Dictamnus dasycarpus T.extract on allergic models in mice［J］.Bioscience Biotechnology&Biochemistry，2008，72（3）：660-665.

［11］郭靜.白鮮皮提取物止血作用及其機理研究［D］.成都：成都中醫(yī)藥大學，2006.

［12］徐明亮，王麗麗，李琳，等.白鮮皮水提物對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用［J］.中國實驗動物學報，2013，21（1）：47-52.

［13］楊東，張瑛，鄭新川，等.白鮮皮生物堿抗內(nèi)毒素活性的研究［J］.第三軍醫(yī)大學學報，2012，34（20）：2097-2100.

［14］叢歡，郭麗娜，楊瑩.白鮮皮化學成分分離及其抑菌活性實驗［J］.齊齊哈爾醫(yī)學院學報，2013，34（6）：853-854.

［15］王殷東，孫璐，范佳紅，等.白鮮皮提取物外用抗炎作用實驗研究［J］.遼寧中醫(yī)藥大學學報，2015，17（6）：50-53.

［16］王麗麗，呂新勇，李琳，等.白鮮皮水提物對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化晚期病變形成的影響［J］.中國藥理學通報，2014，30（3）：64-69.

［17］白媛媛，唐文照，王曉靜.白鮮皮化學成分研究［J］.中藥材，2014，37（2）：93-95.

［18］張文娟.白鮮皮提取物治療慢性濕疹的實驗研究［D］.長沙：湖南中醫(yī)藥大學，2011.

［19］Zhao W，Wolfender J L，Hostettmann K，et al.Antifungal alkaloids and limonoid derivatives from Dictamnus dasy－carpus［J］.Phytochemistry，1998，47（1）：7-11.

［20］Chen J，Tang J S，Tian J，et al.Dasycarine，a new quinoline alkaloid from Dictamnus dasycarpus［J］.Chinese Chemical Letters，2000，11（8）：707-708.

［21］么乃琦.白鮮皮的保肝活性成分研究［D］.延邊：延邊大學，2012.

［22］多力坤·克尤木，杜平，張軍.HPLC-MSMS測定白鮮皮中酮的含量［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工：學刊，2010（7）：96-97.

［23］Souleles C.Flavonoids from Dictamnus albus［J］.Planta Medica，1989，55（4）：402.

［24］李翔，鄧赟，唐燦，等.GC-MS分析白鮮皮的揮發(fā)油成分［J］.華西藥學雜志，2006，21（6）：556-558.

［25］李淑惠，紀耀華，崔玉輝，等.白鮮皮粗多糖提取與總糖含量測定［J］.時珍國醫(yī)國藥，2000，11（1）：14.

［26］Dubois M，Gilles K A，Hamilton J K，et al.Colorimetric method for determination of sugars and related substances［J］.Analytical Chemistry，1956，28（3）：350-356.

［27］Lowry O H，Rosebrough N J，F(xiàn)arr A L，et al.Protein measurement with the folin phenol reagents［J］.The Journal of Biological Chemistry，1951，193：265-275.

［28］Dodgson K S，Price R G.A note on the determination of the ester sulphate content of sulphated polysaccharides［J］.Biochemical Journal，1962，84：106-110.

［29］Filisetti-cozzi T M C C，Carpita N C.Measurement of uronic acids without interference from neutral sugars［J］. Analytical Biochemistry，1991，197：157-162.

［30］Ciucanu I，Kerelk F.A simple and rapid method for the permethylation of carbohydrates［J］.Carbohydrate Research，1984，131：209-217.

［31］郭希娟，馬萍，劉遠洋.響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取蒲公英多糖工藝的研究［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學學報，2014，26（3）：40-44.

Extraction and Molecular Characterization Research of the Polysaccharide from Dictamnus dasycarpus Turcz

Cao Rong’an1，Li Liangyu2，Lin Jian3，Qu Dongyang1，Zhang Xingchen1，Jia Jian1
（1.College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.National Coarse Cereals Engineering Research Center，Heilongjiang Bayi Agricultural University；3.Longyou Yili Dairy CO.，LTD）

DictamnusdasycarpusTurczasasrawmaterials，theoptimizationoftheextractionparametersandmolecular characterization of the polysaccharide were investigated.The extraction parameter were as follows，the ratio of liquid to material 23.87（mL：g），temperature 87.71℃，extraction time 2.38 h，with the yield of 7.1%，which was analyzed by the response surface experiments on basis of the results of single factor experiment.The chemical composition of the polysaccharide was mainly composed of 86.1%total carbohydrate，9.2%protein and 7.1%uronic acid.The major monosaccharide of the polysaccharide was glucose（85.5%），along with limited amounts of galactose（5.2%），arabinose（4.7%），xylose（2.0%），rhamnose（1.4%），mannose（1.1%）and fucose（0.1%）.According to the analysis of molecular weight and molecular weight distribution，there was a symmetrical peak during the elution time of 44～53 min in the RI chromatogram with the molecular weight 369.9×103u and radius of gyration 250.0 nm.

Dictamnus dasycarpus turcz；polysaccharide；extraction；molecular characterization

TS201.1

A

1002-2090（2016）04-0065-07

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.04.015

2015-04-20

黑龍江八一農(nóng)墾大學學成、引進人才科研啟動計劃（XDB2015-30）；黑龍江八一農(nóng)墾大學2014年度校內(nèi)培育課題（XZR2014-08）；2015年黑龍江省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201510223010）。

曹榮安（1980-），男，講師，韓國江陵原州大學畢業(yè)，現(xiàn)主要從事生物活性天然產(chǎn)物方面的研究工作。