UPLC-MS聯(lián)用同時測定建澤瀉中8種三萜類化學(xué)成分

吳雙雙 孫鳳靈 秦霞文 香月 張亞敏 徐小妹 盧雪花 李麗莎 林文津 徐榕青

【摘要】目的：建立建澤瀉中澤瀉醇A等8種三萜類成分含量的UPLC-MS聯(lián)用測定方法。方法：WatersCORTECSC18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.6 μm），流動相0.1%甲酸水-乙腈，流速0.25 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量2μL，梯度洗脫;質(zhì)譜條件采用電噴霧正離子模式，毛細管電壓3.50kV，脫溶劑氣流氮氣800 L/h，脫溶劑溫度500 ℃，錐孔氣流氮氣150 L/h，離子源溫度150 ℃，二級錐孔萃取電壓3.00 V，碰撞氣體氬氣。結(jié)果：澤瀉醇A等8種三萜類成分在0.01～10.0 mg/L范圍內(nèi)，待測成分峰面積/內(nèi)標物質(zhì)甘草次酸峰面積比值與濃度線性關(guān)系良好，澤瀉中23乙酰澤瀉醇B含量最高（0.5182～1.2836 mg/g），澤瀉醇A含量最低（0.0076～0.0078 mg/g）。結(jié)論：方法準確靈敏、簡便可靠，可為建澤瀉品質(zhì)評價提供新的分析手段。

【關(guān)鍵詞】澤瀉;三萜類成分;UPLC-MS聯(lián)用

【中圖分類號】R284.1【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2022）04-0043-05

澤瀉始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性寒味甘，有泄熱、利水滲濕、化濁降脂的功效，主要用于高脂血癥、小便不利、泄瀉尿少、水腫脹滿、痰飲眩暈等[1]。澤瀉為常見大宗中藥材，其中產(chǎn)于福建建甌、建陽等地的澤瀉習稱“建澤瀉”。三萜類成分是澤瀉的主要成分，具有降血脂、降血糖、抗癌、抗菌等一系列藥理活性，是澤瀉發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)[2-5]。澤瀉中三萜類成分的常用測定方法有HPLC等[6-7]，同時檢測多種三萜類成分往往用時較長，影響分析效率。UPLC-MS具有分析時間短、分析效率和分析靈敏度高的特點，尤其在同時測定中藥復(fù)雜組分方面具有明顯優(yōu)勢。本文采用UPLC-MS聯(lián)用方法同時測定建澤瀉中澤瀉醇A等8種三萜類成分含量，旨在為建澤瀉品質(zhì)評價提供更準確、靈敏、簡便、可靠的分析手段。

1材料、儀器與試劑

1.1材料建澤瀉植物樣本（采自福建建甌吉陽鎮(zhèn)），液氮凍存，洗凈，60 ℃烘干后磨粉待用。采集樣本經(jīng)福建省建甌市吉陽鎮(zhèn)農(nóng)技站呂竹清鑒定為澤瀉科植物澤瀉Alisma orientale（sam）juzep.的植株。

1.2儀器ACQUITY UPLC I-Class超高效液相色譜儀（美國Waters公司）;Xevo TQS三重四級桿質(zhì)譜（美國Waters公司）;電子分析天平（AL204，METTLER TOLEDO（上海））;超聲波清洗器（KQ3200B，昆山市超聲儀器有限公司）;電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG- 9070A，上海精宏實驗設(shè)備有限公司）;高速多功能粉碎機（TYSP-100，永康市紅太陽機電有限公司）;艾科浦超純水系統(tǒng)（ABZ1-0501-P，頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司）。

1.3試劑23-乙酰澤瀉醇B（111846-201504）、甘草次酸（110723-201514）購自中國食品藥品鑒定研究院;澤瀉醇A（19885-10-0）、澤瀉醇B（18649-93-9）、澤瀉醇F（155521-45-2）、澤瀉醇G（155521-46-3）、23-乙酰澤瀉醇C（26575-93-9）、24-乙酰澤瀉醇A（18674-16-3）、24-乙酰澤瀉醇F（443683-76-9）購自成都曼思特生物科技有限公司;乙腈（色譜純）購自德國 Merck 公司;水為超純水;甲酸為國產(chǎn)分析純。

2實驗方法與結(jié)果

2.1色譜條件采用WatersCORTECSC18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.6 μm），流動相0.1%甲酸水-乙腈，流速0.25 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量2 μL。梯度洗脫方法為（以乙腈為標準）：1～1.5 min，30%～55%;1.5～5.5 min，55%～75%;5.5～7.5 min，75%～90%;7.5～8.5 min，90%;8.5～8.6 min，90%～30%;8.5～10 min，30%。

2.2質(zhì)譜條件采用電噴霧正離子模式;毛細管電壓3.50 kV;脫溶劑氣流：氮氣800 L/h;脫溶劑溫度500 ℃;錐孔氣流：氮氣150 L/h;離子源溫度：150 ℃;二級錐孔萃取電壓：3.00 V;碰撞氣體：氬氣。

2.3溶液制備

2.3.1混合標準品儲備液制備精密稱取各標準品適量，置于25 mL容量瓶中，加入色譜純乙腈溶液定容，配置成濃度分別為：澤瀉醇A 490 mg/L、澤瀉醇B 520 mg/L、澤瀉醇F 500 mg/L、澤瀉醇G 500 mg/L、23-乙酰澤瀉醇B 490 mg/L、23-乙酰澤瀉醇C 520 mg/L、24-乙酰澤瀉醇A 510 mg/L、24-乙酰澤瀉醇F 530 mg/L混合標準品儲備液。

2.3.2內(nèi)標溶液制備精密稱取甘草次酸標準品，置于25 mL容量瓶中混勻定容成510 mg/L內(nèi)標儲備液。

2.3.3樣品溶液制備稱取建澤瀉樣品粉末約0.5 g置于50 mL錐形瓶中，精密加入乙腈25 mL并稱重，超聲30 min后冷卻至室溫，稱重并用乙腈補足失重。吸取上清并用0.22 μm的微孔濾膜過濾，將濾液稀釋20倍后與5.1 mg/L的甘草次酸內(nèi)標溶液1∶1混合得樣品溶液。

2.4質(zhì)譜測定方法本實驗采用正離子多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）定量模式測定各成分含量，8個分析物及內(nèi)標的具體質(zhì)譜分析條件見表1，在對應(yīng)參數(shù)下標準品及樣品中的8個待測成分的出峰情況如圖1所示。

2.5標準曲線繪制吸取混合標準品儲備液和內(nèi)標儲備液各5 mL于50 mL容量瓶中，加入乙腈定容。分別吸取上述溶液2 μL、100 μL、200 μL、1 mL、2 mL于10 mL容量瓶中，加乙腈定容，配成5種含內(nèi)標系列對照品混合溶液，澤瀉醇A濃度分別為0.0098、0.49、0.98、4.90、9.80 mg/L，澤瀉醇B濃度分別為0.0104、0.52、1.04、5.20、10.40 mg/L，澤瀉醇F濃度分別為0.01、0.50、1.00、5.00、10.00 mg/L，澤瀉醇G濃度分別為0.01、0.50、1.00、5.00、10.00 mg/L，23-乙酰澤瀉醇B濃度分別為 0.0098、0.49、0.98、4.90、9.80 mg/L，23-乙酰澤瀉醇C濃度分別為0.0104、0.52、1.04、5.20、10.40 mg/L，24-乙酰澤瀉醇A濃度分別為0.0102、0.51、1.02、5.10、10.20 mg/L，24-乙酰澤瀉醇F濃度分別為0.0106、0.53、1.06、5.3、10.6 mg/L。按上述色譜條件、質(zhì)譜條件及測定方法對含內(nèi)標系列對照品混合溶液進行測定，并記錄峰面積。以待測成分峰面積與內(nèi)標物質(zhì)甘草次酸的峰面積比值（Y）對待測成分濃度（X）作線性回歸，結(jié)果如圖2所示，R2均大于0.99。

2.6方法學(xué)考察

2.6.1精密度試驗精密吸取同一份對照品混合溶液2 μL，在上述色譜質(zhì)譜條件下連續(xù)進樣6次，記錄澤瀉醇A、澤瀉醇B、澤瀉醇F、澤瀉醇G、23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、24-乙酰澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇F與內(nèi)標物的峰面積比值，RSD計算結(jié)果見表2，表明精密度良好。

2.6.2重復(fù)性試驗精密稱取同一批澤瀉樣品6份，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，進樣分析，記錄澤瀉醇A、澤瀉醇B、澤瀉醇F、澤瀉醇G、23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、24-乙酰澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇F與內(nèi)標物的峰面積比值并計算含量，RSD計算結(jié)果見表2，表明重復(fù)性良好。

2.6.3穩(wěn)定性試驗按“2.3.3”項下方法制備1份澤瀉供試品溶液，分別于0、2、6、10、12和24 h進樣分析，記錄澤瀉醇A、澤瀉醇B、澤瀉醇F、澤瀉醇G、23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、24-乙酰澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇F與內(nèi)標物的峰面積比值并計算含量，RSD計算結(jié)果見表2，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.4加樣回收率精密稱取已知含量的澤瀉樣品6份，每份0.25 g，置于50 mL錐形瓶中，分別精密加入接近等量8種對照品，精密加入乙腈25 mL并稱重，超聲30 min后冷卻至室溫，稱重并用乙腈補足失重，制備供試溶液。按前述方法測定含量并計算回收率。結(jié)果見表3。

2.7樣品含量測定按上述液相及質(zhì)譜條件對3批澤瀉塊莖樣品進行測定，并根據(jù)回歸方程計算8種待測成分的含量，每批測定3次。結(jié)果見表4。

3討論

三萜類成分是澤瀉的主要成分，具有降脂降糖等多種活性，現(xiàn)行版中國藥典以23-乙酰澤瀉醇B和23-乙酰澤瀉醇C為含量測定指標。澤瀉多種三萜類成分均為澤瀉發(fā)揮藥效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，但不同產(chǎn)地、不同采收期、不同部位及不同炮制方法，澤瀉中三萜類成分有較大差異[7-10]。廣澤瀉中澤瀉醇A和24-乙酰澤瀉醇A的含量顯著高于建澤瀉和川澤瀉，川澤瀉中澤瀉醇B、澤瀉醇C等成分的含量顯著高于建澤瀉[11]。以澤瀉醇A24-乙酸酯峰為參照，HPLC指紋圖譜顯示不同產(chǎn)地澤瀉藥材的質(zhì)量有差異，所含成分的種類與量不完全一致[12]。不同育苗期、移栽期和采收期對川澤瀉三萜類成分均有顯著影響[13]。清炒、麩炒、鹽炙3種炮制方法對澤瀉中澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇A、澤瀉醇B和23-乙酰澤瀉醇B含量均有不同程度影響[14]。以個別的三萜成分為指標評價澤瀉質(zhì)量具有較大的局限性，同時采用多個三萜類成分作為指標控制澤瀉藥材質(zhì)量十分必要。

與HPLC相比，UPLC具有更高的柱效，并且在更寬的線速度范圍內(nèi)保持柱穩(wěn)定，有利于提高流動相速度，縮短分析時間，提高分析通量。UPLC-MS聯(lián)用在同時測定中藥復(fù)雜多組分方面具有獨特優(yōu)勢，并已得到日益廣泛的應(yīng)用。本實驗建立了同時測定澤瀉中澤瀉醇A、澤瀉醇B、澤瀉醇F、澤瀉醇G、23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、24-乙酰澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇F等8種三萜成分的UPLC-MS方法，簡便快捷，靈敏度高，具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，結(jié)果準確可靠，為澤瀉品質(zhì)評價及藥材質(zhì)量控制提供新的分析手段。

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（收稿日期：2021-07-02編輯：陶希睿）