有效積溫對建澤瀉和川澤瀉抗氧化酶活性及功效物質(zhì)的影響

郎培蕾，韓 赟，田 榮，谷 巍,3*，邱蓉麗，馬奇翰，吳文慶，劉夢雪，鞠瑞鑫

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023；2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 蘇州 215000；3. 江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023)

澤瀉(Alismatis rhizoma)為澤瀉科植物東方澤瀉Alismaorientale或澤瀉A.plantago-aquatica的干燥塊莖[1]，分別習(xí)稱為“建澤瀉”與“川澤瀉”，傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)分別為福建建甌和四川彭山。澤瀉的活性成分以原萜烷型三萜為主[2]，其中23-乙酰澤瀉醇B 具有利尿、降血脂、保肝和抗腫瘤等生物活性[3—5]，23-乙酰澤瀉醇C 除利尿、降血脂作用外還具有抗骨質(zhì)疏松的功效[6]，二者均被2020 版《中國藥典》規(guī)定為澤瀉質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分[1]。有研究表明，澤瀉品質(zhì)受環(huán)境因素影響，其功效物質(zhì)具有明顯的產(chǎn)地特異性[7]，而功效物質(zhì)種類和含量差異均會影響臨床療效[8—9]。

生態(tài)因子是影響道地藥材生長的主導(dǎo)因素[10]。有效積溫是植物生育期內(nèi)有效溫度(日平均溫度與生物學(xué)下限溫度的差值)的總和[11]，可反映植物生長發(fā)育對熱量的需求，是影響植物生長發(fā)育的重要生態(tài)因子[12]。在長期進(jìn)化過程中，植物通過調(diào)整抗氧化酶活性和次生代謝產(chǎn)物以適應(yīng)環(huán)境變化[13—14]，而對產(chǎn)地環(huán)境的適應(yīng)正是道地藥材形成的生態(tài)學(xué)機(jī)制之一[15]。相關(guān)研究表明，不同產(chǎn)地的藥材其功效物質(zhì)含量存在顯著差異，且其含量與藥材生育期內(nèi)有效積溫顯著相關(guān)[16]。在不同有效積溫條件下，植物體內(nèi)的抗氧化酶活性也存在差異[17]。明確有效積溫對不同基原澤瀉抗氧化能力及功效物質(zhì)積累的影響對闡述其道地性成因具有重要意義，但目前相關(guān)研究未見報道。本文通過分析建澤瀉和川澤瀉主產(chǎn)地近40 年氣象數(shù)據(jù)，統(tǒng)計兩地澤瀉大田生長期有效積溫數(shù)據(jù)并進(jìn)行模擬研究，分析有效積溫對建澤瀉和川澤瀉的抗氧化能力與功效物質(zhì)積累的影響差異，明確有利于兩者功效物質(zhì)積累的有效積溫，為探究澤瀉道地性成因以及規(guī)范化栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料為采自福建建甌的建澤瀉和四川彭山的川澤瀉，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)谷巍教授鑒定分別為澤瀉科植物東方澤瀉和澤瀉。

實驗于南京中醫(yī)藥大學(xué)人工氣候室進(jìn)行，將建澤瀉和川澤瀉幼苗在大田栽培一周后，選取生長良好，長勢一致的幼苗，栽植于盆高30 cm、上口徑33 cm、下口徑20 cm 的塑料盆內(nèi)，每盆定苗3 株，置于人工氣候室中緩苗10 d 后開始實驗處理。

1.2 實驗設(shè)計

將適應(yīng)性培養(yǎng)后的建澤瀉和川澤瀉幼苗分別放置在2 間人工氣候室中，按照兩地建澤瀉和川澤瀉生長發(fā)育規(guī)律及其有效積溫分析結(jié)果，設(shè)置整體處理時間為120 d。具體實驗分組和各組有效積溫見表1。

表1 建澤瀉和川澤瀉實驗分組Table 1 Experimental grouping of Jian Zexie and Chuan Zexie

除溫度外，兩間人工氣候室其他實驗條件均一致，光照強(qiáng)度300 μmol·m–2·s–1，光照周期為12 h(08:00～20:00)，相對濕度80%，按照規(guī)范化種植進(jìn)行栽培管理。

從進(jìn)行溫度處理的當(dāng)天開始取樣，隨后每隔15 d 取樣一次，共取樣9 次；每組指標(biāo)均進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)，結(jié)果取平均值。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 有效積溫計算

利用Wheat A(http://www.wheata.cn/)提取福建建甌和四川彭山兩地1982～2021 年近40 年建澤瀉與川澤瀉大田期(8 月下旬～12 月下旬)的逐日氣溫資料，計算統(tǒng)計期間各年份建澤瀉與川澤瀉大田生長期≥10 ℃有效積溫(GDD)，計算公式如下：

式中，n 為統(tǒng)計階段連續(xù)天數(shù)(i=1，2，3....，n)；當(dāng)天有效積溫ei計算方式如下：

式中，ti表示日均溫，Tb(生物學(xué)零度)定為10 ℃。

第一，淘汰落后產(chǎn)能。煉油行業(yè)要認(rèn)識到產(chǎn)能過剩的嚴(yán)峻性，推進(jìn)部分產(chǎn)能退出或者企業(yè)轉(zhuǎn)型，淘汰落后產(chǎn)能不是行政命令，而是市場選擇。山東省公布了《關(guān)于加快七大高耗能行業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的實施方案》，推進(jìn)全省500萬噸/年及以下地方煉油企業(yè)煉油產(chǎn)能減量整合，規(guī)劃建設(shè)產(chǎn)能為3000萬噸/年的煉化一體化項目，實現(xiàn)規(guī)模集約化、園區(qū)化發(fā)展；同時形成“油頭化尾”一體化產(chǎn)業(yè)模式，實現(xiàn)煉油與下游高端石化產(chǎn)品生產(chǎn)的平衡發(fā)展。未來我國煉油業(yè)要構(gòu)建“沿海戰(zhàn)略（七大煉化基地）+西部油田周邊煉廠”格局。

1.3.2 保護(hù)酶與丙二醛活性測定

選取澤瀉從內(nèi)向外第三片完全展開功能葉，除去葉脈，剪碎混勻，精確稱量1.0 g 置于預(yù)冷的研缽中，加入2 mL 磷酸緩沖液(pH 7.0)和石英砂在冰浴下研磨勻漿后，在4 ℃下15 000 r·min-1離心15 min，收集上清液待用。以愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶(POD)活性[18]、紫外吸收法測定過氧化氫酶(CAT)活性[18]、總超氧化物歧化酶(T-SOD)測試盒測定超氧化物歧化酶(SOD)活性。

精確稱取葉片1.0 g 置于預(yù)冷的研缽中，加入10% TCA 10 mL，研磨后將所得勻漿于4000 r·min-1離心10 min 后收集上清液備用。采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法測定丙二醛(MDA)含量[18]。

1.3.3 功效物質(zhì)含量測定

于各時間點取澤瀉塊莖，洗去表面泥土，于60 ℃下烘干并研磨成粉(過5 號篩)，按《中國藥典》(2020 年版)方法測定23-乙酰澤瀉醇B 和23-乙酰澤瀉醇C 含量[1]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excle 2019、SPSS 24.0 等軟件進(jìn)行圖表繪制和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 近40 年建澤瀉與川澤瀉大田生長期有效積溫及其差異分析

通過分析近40 年建澤瀉和川澤瀉大田生長期有效積溫，發(fā)現(xiàn)建澤瀉大田生長期有效積溫范圍在1044～1340 ℃·d 之間；川澤瀉大田生長期有效積溫范圍在602～962 ℃·d 之間，二者有效積溫具有顯著差異(P< 0.05)(圖1)。建澤瀉與川澤瀉在各生長階段所需有效積溫不同，兩者地上部分生長期為8 月下旬至10月，有效積溫分別在815～1103 ℃·d 和539～784 ℃·d 之間，塊莖積累期在11 月至12 月下旬，有效積溫范圍分別為96～285 ℃·d 和30～158 ℃·d 。

圖1 近40 年建澤瀉與川澤瀉大田生長期有效積溫分布趨勢Fig. 1 The GDD trends in Jian’ou and Pengshan in recent 40 years

根據(jù)近40 年建澤瀉與川澤瀉大田期每日平均溫度和有效積溫范圍，分別設(shè)置福建組(J)和四川組(C)溫度處理，即依據(jù)兩地晝夜溫差平均值，兩組處理的晝夜溫差均設(shè)為8 ℃(圖2)。

圖2 實驗期間福建組、四川組每日平均溫度設(shè)置及有效積溫變化Fig. 2 Variation of daily mean temperature and effective accumulated temperature in Fujian and Sichuan formations during the experiment

2.2 在不同有效積溫條件下澤瀉保護(hù)酶活性差異

建澤瀉和川澤瀉SOD、POD 和CAT 酶活性變化趨勢均呈“M”型(圖3)。其中SOD 在處理期間變化平穩(wěn)，川澤瀉和建澤瀉SOD 活性第二次升高后變化趨勢略有不同，四川組川澤瀉(CAp) SOD 活性第二次升高的最高點出現(xiàn)在105 d，隨后快速下降，福建組川澤瀉(JAp) SOD活性則在75 d時達(dá)到高點，隨后緩慢降低。福建組建澤瀉(JAo)和四川組建澤瀉(CAo) SOD 活性分別在105 d 和90 d 時到達(dá)最高點，隨后快速下降(圖3A)。

圖3 不同有效積溫條件下建澤瀉和川澤瀉抗氧化酶活性Fig. 3 Effect of GDD on the activities of protective enzymes in Jian Zexie and Chuan Zexie

在整個處理期間，建澤瀉和川澤瀉POD 酶活性均在道地產(chǎn)區(qū)有效積溫條件下較高(圖3B)。兩組澤瀉POD 酶活性升至最高的時間點也略有差異，其中福建組建澤瀉(JAo)和川澤瀉(JAp)及四川組川澤瀉(CAp)葉片中POD 活性均在105 d 時增至最大，而四川組建澤瀉(CAo)葉片POD 活性在90 d 升至最高，隨后降低。

建澤瀉和川澤瀉CAT 活性有初始差異，但在處理60 d 時兩組澤瀉的CAT 酶活性均下降至最低值，隨著處理時間的延長和溫度降低，CAT 活性在90 d達(dá)到最高，此時在道地產(chǎn)區(qū)有效積溫條件下的建澤瀉和川澤瀉中CAT 活性分別較四川組建澤瀉(CAo)和福建組川澤瀉(JAp)高19.86%和30.01%，隨后在處理末期降至最低。在整個實驗期間建澤瀉和川澤瀉CAT 酶活性均在道地產(chǎn)區(qū)有效積溫條件下較高(圖3C)。

2.3 不同有效積溫條件下澤瀉MDA 含量差異

建澤瀉和川澤瀉中MDA 含量均呈先上升后下降再上升的變化趨勢，但變化幅度隨品種和有效積溫的不同而略有差異。福建組建澤瀉(JAo)與四川組川澤瀉(CAp)中MDA 含量變化較為平穩(wěn)，而四川組建澤瀉(CAo)和福建組川澤瀉(JAp)中MDA 含量變化幅度較大，其中兩組中的建澤瀉MDA 活性在0～45 d 的變化幅度一致，在75 d 后兩者差距增大，此時四川組建澤瀉(CAo) 有效積溫為770 ℃·d ，福建組建澤瀉(JAo)有效積溫為1028 ℃·d 。在處理末期，四川組建澤瀉(CAo) MDA 含量較福建組建澤瀉(JAo)高158.48%。

而福建組川澤瀉(JAp)在生長前期受有效積溫影響較大，其MDA 含量在0～30 d 快速上升，且在第30 天達(dá)最大值，此時MDA 含量較四川組川澤瀉(CAp)高73.07%；在此期間四川組川澤瀉(CAp)有效積溫為400 ℃·d ，而福建組川澤瀉(JAp)有效積溫達(dá)511 ℃·d 。隨后福建組川澤瀉(JAp) MDA 含量在45～90 d 逐漸下降后趨于平穩(wěn)；在采收期兩組川澤瀉MDA 含量變化趨勢一致。整個處理期內(nèi)，建澤瀉與川澤瀉MDA 含量均在道地產(chǎn)區(qū)有效積溫條件下保持較低水平(圖4)。

圖4 不同有效積溫對建澤瀉和川澤瀉MDA 含量的影響Fig. 4 Effect of GDD on the contents of MDA in Jian Zexie and Chuan Zexie

2.4 不同有效積溫條件下澤瀉功效物質(zhì)含量差異

不同有效積溫處理下的建澤瀉和川澤瀉功效物質(zhì)含量呈現(xiàn)不同變化趨勢，其中福建組建澤瀉(JAo)和四川組川澤瀉(CAp)中23-乙酰澤瀉醇B 和23-乙酰澤瀉醇C 含量均隨生長時間延長而增加；福建組川澤瀉(JAp)呈上升–下降–上升–下降–上升的趨勢，而四川組建澤瀉(CAo)呈上升–下降–上升的趨勢(圖5)。

圖5 有效積溫對建澤瀉和川澤瀉功效物質(zhì)積累的影響Fig. 5 Effects of GDD on active ingredient contents of Jian Zexie and Chuan Zexie

福建組建澤瀉(JAo)和四川組川澤瀉(CAp)的23-乙酰澤瀉醇B 快速積累期均出現(xiàn)在處理105～120 d，此時兩者有效積溫(日均溫度)分別為1185 ℃· d (10～12 ℃)、843 ℃· d (7～9 ℃)，且在整個處理期間，23-乙酰澤瀉醇C 含量增長均較為平穩(wěn)。四川組建澤瀉(CAo)與福建組川澤瀉(JAp) 23-乙酰澤瀉醇B 與23-乙酰澤瀉醇C 的積累則呈不規(guī)律變化。四川組建澤瀉(CAo)中23-乙酰澤瀉醇B 的快速積累期出現(xiàn)在處理90～105 d，此時其有效積溫(日均溫度)為830～843 ℃· d (10～12 ℃)，隨著處理溫度的下降，在105～120 d，日均溫為7～9 ℃條件下，四川組建澤瀉(CAo)中23-乙酰澤瀉醇B 未見顯著變化，而23-乙酰澤瀉醇C 含量顯著增加。福建組川澤瀉(JAp)中23-乙酰澤瀉醇B 的快速積累期出現(xiàn)在處理45～60 d (有效積溫720～893 ℃· d)和75～90 d (有效積溫1028～1126℃· d)，而在90～120 d(塊莖積累期)，其23-乙酰澤瀉醇B 含量未見明顯增長，而23-乙酰澤瀉醇C 含量在75～90 d (有效積溫1028～1126 ℃· d)快速升高，隨后呈現(xiàn)先降低后升高的規(guī)律。

在采收期，福建組建澤瀉(JAo)和四川組川澤瀉(CAp)塊莖中23-乙酰澤瀉醇B 含量分別較四川組建澤瀉(CAo)和福建組川澤瀉(JAp)增加 60.56%和19.81%，但23-乙酰澤瀉醇C 含量卻分別降低47.22%、37.73%。

3 討論

有效積溫作為反映植物生長發(fā)育對熱量需求的指標(biāo)[19]，其不足或過高均會影響植物生長及其品質(zhì)[20]，如有效積溫不足會導(dǎo)致魔芋Amorphophalluskonjac球莖膨大期生長時間縮短，發(fā)育受抑制[21]，而有效積溫過高會導(dǎo)致丹參Salviamiltiorrhiza中功效物質(zhì)含量顯著降低[22]。低溫脅迫作為影響植物生存的最重要限制因子之一，能誘導(dǎo)植物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物特別是萜類物質(zhì)的變化[23]，但過度脅迫會抑制植物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物積累[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，福建組和四川組建澤瀉雖然都在10～12 ℃條件下完成23-乙酰澤瀉醇B 的快速積累，但四川組建澤瀉(CAo)的23-乙酰澤瀉醇B 積累速率和采收時功效物質(zhì)含量均低于福建組建澤瀉(JAo)，可能是四川組建澤瀉在地上部分生長期有效積溫不足，導(dǎo)致其生長發(fā)育遲緩，進(jìn)而影響其次生代謝產(chǎn)物積累[25]，且在處理末期，隨著四川組溫度設(shè)置的降低，23-乙酰澤瀉醇B 含量幾乎沒有增長，這可能是后期溫度低于建澤瀉的適宜溫度范圍，導(dǎo)致其生長受到抑制。而福建組川澤瀉(JAp)中23-乙酰澤瀉醇B 的快速積累始于處理45 d，且在塊莖積累期(90～120 d)并未出現(xiàn)23-乙酰澤瀉醇B 含量快速增加。在最后采收時，其23-乙酰澤瀉醇B 含量也低于道地產(chǎn)區(qū)有效積溫條件下的川澤瀉，這可能是由于福建組川澤瀉在地上部分生長期有效積溫較高導(dǎo)致其快速生長，塊莖中23-乙酰澤瀉醇B 提前積累；同時，在塊莖積累期有效積溫較高不利于川澤瀉的生長，導(dǎo)致其塊莖中23-乙酰澤瀉醇B 含量幾乎不變。23-乙酰澤瀉醇B 作為澤瀉的主要藥效成分，在栽培中需考慮有效積溫對其積累的影響。

研究表明，植物通過提高抗氧化酶活性，尤其是SOD、POD 和CAT 活性來減少外部溫度變化對自身的影響[26—27]。實驗發(fā)現(xiàn)道地產(chǎn)區(qū)有效積溫條件下的建澤瀉和川澤瀉保護(hù)酶活性變化趨勢一致，MDA 含量變化也較為平穩(wěn)，說明兩種澤瀉均適應(yīng)道地產(chǎn)區(qū)的溫度條件，對此溫度變化細(xì)胞能通過抗氧化保護(hù)酶之間的協(xié)同作用降低脂膜過氧化程度，同時清除細(xì)胞內(nèi)活性氧，從而提高自身抗性[28]。而福建組川澤瀉(JAp)在0～30 d 有效積溫過高，四川組建澤瀉(CAo)在地上部分生長期有效積溫不足，保護(hù)酶活性受到抑制，導(dǎo)致其MDA 含量顯著升高，有效積溫對建澤瀉和川澤瀉的抗氧化能力影響顯著?？寡趸赶到y(tǒng)作為植物自身的保護(hù)機(jī)制，與次生代謝產(chǎn)物一起，共同抵御外界環(huán)境變化帶來的影響[29]。前人研究發(fā)現(xiàn)，植物抗氧化酶活性與其次生代謝產(chǎn)物積累密切相關(guān)[30]。本實驗中除福建組川澤瀉(JAp)外，福建組建澤瀉(JAo)、四川組建澤瀉(CAo)和川澤瀉(CAp)塊莖中23-乙酰澤瀉醇B 快速積累期與其SOD 和POD 活性最高的時間幾乎重合，這與Tang等[31]的研究結(jié)果一致，說明抗氧化酶和次生代謝產(chǎn)物在適應(yīng)環(huán)境變化的過程中具有協(xié)同作用。

溫度可以通過影響植物體內(nèi)次生代謝途徑相關(guān)基因的表達(dá)來影響萜類物質(zhì)含量的變化[32]，其中細(xì)胞色素P450(CPY450)對萜類物質(zhì)的相互轉(zhuǎn)化起到重要作用[33]。研究表明，栽培在四川彭山的建澤瀉中CYP71 和CYP85 家族的差異表達(dá)基因(DEGs)表達(dá)水平較栽培在福建建甌的建澤瀉顯著上調(diào)，這可能導(dǎo)致栽培在兩地的建澤瀉出現(xiàn)三萜組分含量差異[34]。本實驗中，道地產(chǎn)區(qū)有效積溫條件下的建澤瀉和川澤瀉23-乙酰澤瀉醇B 含量升高，23-乙酰澤瀉醇C降低，這可能是由于有效積溫通過影響建澤瀉與川澤瀉體內(nèi)代謝途徑相關(guān)基因的表達(dá)導(dǎo)致功效物質(zhì)間的競爭性轉(zhuǎn)化，從而使23-乙酰澤瀉醇B 和23-乙酰澤瀉醇C 的含量產(chǎn)生差異，但其內(nèi)在轉(zhuǎn)化機(jī)制還需進(jìn)一步研究。上述結(jié)果為以功效物質(zhì)為目標(biāo)的定向培育提供理論支撐。