鴨疫里默氏菌I型整合子與耐藥基因盒檢測(cè)

蔡秀磊，單 虎

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院山東省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東省獸藥診斷試劑工程技術(shù)研究中心，山東 青島266109）

目前，對(duì)養(yǎng)鴨業(yè)影響最大的細(xì)菌性傳染病之一就是鴨疫里默氏菌（Riemerella anatipestifer，RA）病[1]，該病的發(fā)病率和病死率都很高，在生產(chǎn)中最主要的防治手段仍然是藥物治療，但由于RA極易產(chǎn)生耐藥性，常有治療失敗的現(xiàn)象，造成很大的經(jīng)濟(jì)損失，因此開展對(duì)該菌的耐藥性及耐藥基因方面的研究尤為重要。1989年，Stokes和Hall首次提出整合子(integron，In)結(jié)構(gòu)[2]，該結(jié)構(gòu)是一個(gè)新的可移動(dòng)的基因元件，可協(xié)助耐藥基因水平傳播。此后，整合子結(jié)構(gòu)作為研究細(xì)菌耐藥性的重要手段，受到了各國科研人員的關(guān)注。目前已經(jīng)明確發(fā)現(xiàn)的整合子種類共有6種，在臨床致病菌中出現(xiàn)機(jī)率最多的是I型整合子。

鴨疫里默氏菌的耐藥性雖然引起了生產(chǎn)和科研工作的重視，但關(guān)于該菌的耐藥基因方面的研究尚未見任何報(bào)道。本研究利用PCR技術(shù)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室所保存的所有臨床分離的耐藥菌株進(jìn)行了I型整合子及其捕獲的耐藥基因盒的檢測(cè)，并將所檢測(cè)到的I型整合子結(jié)構(gòu)、耐藥基因序列與其他細(xì)菌做一比較，試圖分析、探討I型整合子在鴨疫里默氏菌耐藥性產(chǎn)生、傳播中的作用，并根據(jù)所檢測(cè)到的耐藥基因序列，初步從分子水平上分析該菌耐藥性產(chǎn)生的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 供試菌株 本試驗(yàn)所用22株菌株分離自1999-2005年浙江省各地區(qū)鴨場(chǎng)出現(xiàn)典型漿膜炎病變的病死鴨的肝臟、心臟，經(jīng)純化培養(yǎng)、生化鑒定、血清型鑒定、藥敏試驗(yàn)之后，用于本研究。

1.2 儀器 MJPCR儀（BIO-RAD），凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD）。

1.3主要試劑 限制性內(nèi)切酶SphI、Taq DNA聚合酶、pMD18-T載體、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；1kb DNA Marker、100 bp DNAMarker，購自TaKaRa公司。

1.4 PCR法檢測(cè)I型整合子及耐藥基因盒

1.4.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank上發(fā)表的I型整合酶基因序列、I型整合子的5′和3′端高度保守區(qū)的基因序列，利用軟件Oligo 6.0設(shè)計(jì)特異引物。I型整合酶基因擴(kuò)增引物為：intI1-F：5′-TGATGGCGA CGCACGAC-3′；intI1-R：5′-TTGGGCAGCAGCGAA GT-3′。耐藥基因盒擴(kuò)增引物為：FP：5′-GGCATCC AAGCAGCAAGCGCGTTACGCCGT-3′；RP：5′-AAG CAGACTTGAC-CTGATAGTTTGGCTGTG-3′。上述引物均由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。

1.4.2 RA基因組提取 從平板上挑取純化培養(yǎng)的單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，置于37℃搖床、180 r/min離心振蕩培養(yǎng)過夜。取上述培養(yǎng)液1mL置于1.5 mL離心管中，12 000 r/min（室溫）離心1min，棄上清，并加入567 uLTEBuffer（pH值8.0）重懸菌體并加入30μL10%SDS、3 uL蛋白酶K（20mg/mL），于37℃水浴中過夜。加入200 uL 3mol/LNaCl，置于65℃水浴中孵育10min。加入等體積的酚：氯仿并抽提兩次。加入1/10體積的3mol/LNaAc、2倍體積的無水乙醇，輕柔顛倒混勻，置于-20℃保持30min。用槍頭將上述液體中的絮狀沉淀勾出，并用70%乙醇洗滌沉淀1次。加入TERnase，37℃水浴內(nèi)放置30min，得到的產(chǎn)物即可作為PCR反應(yīng)的模板。

1.4.3 PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)程序 建立50μLPCR反應(yīng)體系：DNA Taq酶1.5 U，10×Buffer 5μL，dNTP Mixture4μL，模板5μL，上下游引物各2μL，加ddH2O至總體積50μL。

I型整合酶基因PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min，94℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)后再72℃延伸10min結(jié)束反應(yīng)。

I型整合子耐藥基因盒PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，62℃退火1min，72℃延伸3min，35個(gè)循環(huán)后再72℃延伸10min結(jié)束反應(yīng)。取2μL產(chǎn)物點(diǎn)樣于1.5%（1.0%）瓊脂糖凝膠電泳，用Bio-RAD成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并記錄。

1.4.4 I型整合酶基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物酶切鑒定 利用DNAStar-MapDraw軟件，分析intI1基因的酶切位點(diǎn)，對(duì)I型整合酶基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切鑒定。

1.5 PCR產(chǎn)物純化、克隆、測(cè)序與序列分析 PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行膠回收，回收產(chǎn)物連接到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)，挑取轉(zhuǎn)化子并經(jīng)Hind III、EcoRI雙酶切鑒定、PCR鑒定，篩選出的陽性轉(zhuǎn)化子送北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序，并采用DNA?Star、BLAST對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析、比較。

2結(jié)果

2.1 I型整合酶檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 PCR擴(kuò)增 22株RA的I型整合酶檢測(cè)均呈陽性，檢出率為100%，產(chǎn)物大小約為580 bp左右，與預(yù)期結(jié)果相符。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1。

圖1 intI1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.1.2 酶切鑒定 I型整合酶基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化后，以SphI酶切，出現(xiàn)約為320 bp和260 bp左右的兩條帶，產(chǎn)物大小與預(yù)期大小一致。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2。

圖2 intI1基因PCR產(chǎn)物Sph I酶切鑒定

2.1.3 測(cè)序結(jié)果 測(cè)序結(jié)果顯示，I型整合酶基因長度為587bp。根據(jù)GENBANK中已有的I型整合酶序列，經(jīng)DNAStar軟件、BLAST軟件比對(duì)，該序列與大腸桿菌（GenBank登陸號(hào)AY522431，下同）、肺炎桿菌（AY123253）、摩爾根菌（DQ522239）、沙門菌（AY463797）的同源性均為100%。GenBank登陸號(hào)為DQ881442。

2.2 耐藥基因盒檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 PCR擴(kuò)增 22株RA的耐藥基因盒檢測(cè)均為陽性。其中，從1株RA中擴(kuò)增得到大小約為1kb左右的產(chǎn)物，命名為In I-1，檢出率為4.5%；從21株RA中擴(kuò)增得到大小約為2.4 kb左右的產(chǎn)物，命名為In I-2，檢出率為95.5%。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖3。

圖3 耐藥基因盒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2.2 測(cè)序結(jié)果與序列分析 產(chǎn)物In I-1和In I-2經(jīng)純化、克隆后進(jìn)行測(cè)序，大小分別為1 048 bp和2 352 bp。測(cè)序結(jié)果通過DNAStar軟件與已知序列比較，并登陸GenBank，通過BLAST軟件比對(duì)。GenBank登陸號(hào)分別為EF105289、EF105290。In I-1測(cè)序結(jié)果：In I-1長度為1 048 bp，與質(zhì)粒pSp14(GenBank accession no.AY139598)、質(zhì) 粒pTET3(GenBank accession no.AJ420072)、質(zhì)粒pLEW279a(GenBank accession no.DQ390458)中檢測(cè)到的I型整合子結(jié)構(gòu)同源性達(dá)到了100%。進(jìn)一步分析這一整合子序列，發(fā)現(xiàn)其中含有一個(gè)耐藥基因盒aadA5基因。該基因以ATG開頭、大小為789 bp，與aa?dA5基因（GenBank accession no.DQ838665）99.7%相同，編碼核苷轉(zhuǎn)移酶，導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)氨基糖甙類藥物產(chǎn)生耐藥性。耐藥基因aadA5被整合在特異的整合位點(diǎn)aatI和59 be結(jié)構(gòu)之間，是一種整合效率較高的整合，且其aatI、59be以及3′端保守區(qū)的序列與沙門菌(GenBank accession no.AY463797)的同源性達(dá)到了99%以上。

In I-2測(cè)序結(jié)果：InI-2長度為2 352 bp，與奇異變形菌（GenBank accession no.AY677093）中檢測(cè)到的I型整合子結(jié)構(gòu)同源性為99.89%，與沙門菌（GenBank accession no.AJ746361）中檢測(cè)到的同源性為99.46%。該整合子含有3個(gè)開放閱讀框（ORF），是3個(gè)不同的耐藥基因盒。其中，長度為555 bp的ORF與aac 6-II基因（GenBank accession no.DQ402099）有99.5%相同，編碼?；D(zhuǎn)移酶，引起細(xì)菌對(duì)氨基糖甙類藥物的耐藥；長度為633 bp的ORF與cat B3基因（GenBank accession no.DQ343904）有99.7%相同，編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，介導(dǎo)對(duì)氯霉素產(chǎn)生耐藥性；長度為792 bp的ORF與aadA1基因（GenBank accession no.AF313472）有99.8%相同，編碼核苷轉(zhuǎn)移酶，介導(dǎo)對(duì)氨基糖苷類藥物的耐藥。aac6-II、catB3、aadA1這3個(gè)耐藥基因之間分別以59 be結(jié)構(gòu)為界，aac6-II基因與整合子的5′端保守區(qū)以aatI為界，aadA1基因與整合子的3′端保守區(qū)以59be為界。該整合子的5′端保守區(qū)、3′端保守區(qū)與其他細(xì)菌的同源性均達(dá)到了100%。

2.2.3 各菌株的耐藥表型與所攜帶耐藥基因盒之間的關(guān)系 在前期的研究中，我們對(duì)本試驗(yàn)中所有供試菌株均開展了相關(guān)的耐藥表型研究，多重耐藥現(xiàn)象十分嚴(yán)重，五耐、六耐菌株所占的比例最大，均占31.8%[3]，具體見表1。菌株9攜帶了能引起對(duì)氨基糖苷類藥物耐藥的aadA5基因盒，在藥敏試驗(yàn)中也表現(xiàn)了對(duì)丁胺卡那霉素和卡那霉素的耐藥性，耐藥表型與檢測(cè)到的耐藥基因盒吻合。但是在其他的21株菌中，均檢測(cè)到攜帶了aac6-II、catB3、aadA1這3個(gè)耐藥基因盒，而他們的耐藥表型卻不盡相同。這些菌株均表現(xiàn)出對(duì)氨基糖苷類藥物的耐藥性，個(gè)別菌株對(duì)青霉素、四環(huán)素、紅霉素等也有不同程度的耐受，他們雖都攜帶了介導(dǎo)氯霉素耐藥性的catB3基因盒，卻對(duì)氯霉素都很敏感，這可能與該基因盒距離啟動(dòng)子較遠(yuǎn)或啟動(dòng)子較弱不能被正常啟動(dòng)有關(guān)。

表1 22株RA的耐藥表型與攜帶耐藥基因盒情況

3 討論與結(jié)論

3.1 整合子在細(xì)菌多重耐藥迅速發(fā)展的過程中起到了重要的作用，尤其對(duì)革蘭陰性菌更為重要[4]。在臨床檢測(cè)中，I型整合子檢測(cè)陽性頻率最高。I型整合子主要由3個(gè)部分組成，分別是5′CS、可變區(qū)、3′CS，3個(gè)主要的功能元件是編碼I型整合酶的基因intI1、基因重組位點(diǎn)attI和啟動(dòng)子[5-6]，整合子可以捕獲耐藥基因盒，并利用5′CS端的啟動(dòng)子使耐藥基因盒得以表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的傳播[7]。其中I型整合酶是I型整合子的標(biāo)志性結(jié)構(gòu)，I型整合酶檢測(cè)為陽性者，內(nèi)部肯定含有I型整合子的結(jié)構(gòu)，我們的檢測(cè)結(jié)果更加證實(shí)了這一理論。

3.2 我們的檢測(cè)結(jié)果顯示，I型整合子作為耐藥基因傳播的重要基因元件，在鴨疫里默氏菌中同樣存在，且在本次檢測(cè)中，陽性率達(dá)到了100%。由于I型整合子已經(jīng)在大腸埃希菌、沙門菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯氏菌、不動(dòng)桿菌等[8]中被檢測(cè)到并證明是引起這些細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生及廣泛傳播的重要原因之一，我們可以推測(cè)I型整合子與RA的耐藥性尤其是多重耐藥性的發(fā)生與傳播有著重要的關(guān)系。本次檢測(cè)的檢出率特別高，遠(yuǎn)高于其他報(bào)道中的59%～75%，但是與石磊等[9]自33株臨床菌株中的檢出率相同，這可能與我們自臨床上分離到的菌株的多重耐藥性比較嚴(yán)重有關(guān)。

3.3 通過對(duì)I型整合酶基因的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)與其他細(xì)菌的該基因同源性達(dá)到了100%，可以認(rèn)為是同一基因，故RA中的I型整合酶基因應(yīng)該與其他細(xì)菌中的功能及作用機(jī)理相同或相似。這是首次在該菌中開展對(duì)I型整合酶基因的研究并證明其存在。

3.4 通過對(duì)耐藥基因盒進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序，我們發(fā)現(xiàn)了aadA5、aac6-II、catB3、aadA1四種不同的耐藥基因盒，分別介導(dǎo)對(duì)氨基糖苷類藥物和氯霉素的耐藥，且這4個(gè)基因與在其他細(xì)菌中所檢測(cè)到的同源性均在95%以上，屬于同一基因。根據(jù)這些基因在其他細(xì)菌中引起耐藥性發(fā)生的原理，我們可以推測(cè)RA對(duì)氨基糖苷類藥物、氯霉素產(chǎn)生耐藥性的機(jī)理與機(jī)制與其他細(xì)菌相同，這是首次在鴨疫里默氏菌中發(fā)現(xiàn)耐藥基因的存在，并證明其耐藥基因與其他細(xì)菌具有很高的同源性。

3.5 分析細(xì)菌的耐藥譜和所攜帶的耐藥基因盒二者之間的關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌的耐藥表型與攜帶的耐藥基因盒沒有絕對(duì)的相關(guān)性，攜帶相同耐藥基因盒的菌株所表現(xiàn)出的耐藥表型并不完全相同，有的菌株雖然檢測(cè)到已經(jīng)捕獲了特定的耐藥基金盒，但在臨床上并未表現(xiàn)對(duì)該藥的耐受，在其他相關(guān)報(bào)道中也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果[10]。這提示我們整合子結(jié)構(gòu)并不是引起細(xì)菌多重耐藥的惟一原因，還與其他耐藥機(jī)制有關(guān)。而且耐藥基因盒的表達(dá)強(qiáng)弱也是受多種條件因素控制的，比如啟動(dòng)子的強(qiáng)弱、耐藥基因盒與啟動(dòng)子之間的距離等。

通過對(duì)鴨疫里默氏菌I型整合子結(jié)構(gòu)的研究，對(duì)其中所捕獲的耐藥基因盒的解析，我們可以根據(jù)這些耐藥基因序列建立快速的細(xì)菌耐藥基因盒的檢測(cè)方法，并為我們研究該菌耐藥性的產(chǎn)生機(jī)制、傳播途徑、臨床上及時(shí)監(jiān)測(cè)該菌的藥物敏感性提供一個(gè)新途徑。整合子結(jié)構(gòu)是細(xì)菌耐藥性傳播的重要機(jī)制，耐藥基因可以通過該結(jié)構(gòu)在不同的細(xì)菌、地區(qū)之間進(jìn)行傳播，所以開展細(xì)菌整合子的監(jiān)測(cè)工作可以有效的指導(dǎo)臨床用藥并控制耐藥細(xì)菌的傳播。

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