水族抗痹證藥酒抗類風濕性關節(jié)炎的實驗研究

吉楊丹 帥敏 吳倩 梁子聰 王恒 臧貴勇

【摘 要】 目的：觀察水族抗痹證藥酒對類風濕性關節(jié)炎大鼠的影響。方法：將50只SD雌性大鼠隨機分組，分為空白組，模型組，抗痹證藥酒高、中、低劑量組（5 mL/kg，2.5 mL/kg，1.25 mL/kg），每組10 只。除空白組外，其余各組大鼠于踝關節(jié)注射弗氏佐劑建立關節(jié)炎模型，建模成功后給予相應劑量的藥物灌胃，每天1次，持續(xù)2周。測定各組大鼠血清中白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α的含量，鏡下觀察各組大鼠踝關節(jié)組織病理變化。結果：與空白組比較，模型組大鼠血清中白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α含量均明顯升高（P<0.05）。與模型組比較，抗痹證藥酒不同劑量組大鼠血清中白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α含量均有不同程度下降，其中高劑量組血清白介素1-β含量，中劑量組和高劑量組血清白介素6含量，低劑量組、中劑量組、高劑量組血清腫瘤壞死因子-α含量比較具有顯著性差異（P<0.05）。與模型組相比，水藥抗痹證藥酒不同劑量組大鼠關節(jié)滑膜充血、水腫情況有不同程度減輕，淋巴細胞、漿細胞等炎細胞浸潤相對較輕。結論：水藥抗痹證藥酒可降低佐劑性關節(jié)炎大鼠血清中白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α含量，從而減輕關節(jié)滑膜炎癥以及關節(jié)軟骨、骨質破壞，起到抗類風濕性關節(jié)炎作用。

【關鍵詞】 水藥;類風濕性關節(jié)炎;實驗研究

【中圖分類號】R29?? 【文獻標志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2022）12-0016-03

Experimental Study on Anti-Rheumatoid Arthritis with Shui Peple Medicinal Liquor of Anti-Arthralgia Syndrome

JI Yangdan1 SHUAI Min1 WU Qian2 LIANG Zicong1 WANG Heng1 ZANG Guiyong1*

1.Qiannan Medical College for Nationalities，Duyun? 558003，China;2.The People′s Hospital of Qiannan，Duyun 558003，China

Abstract：Objectives To observe the effect of Shui Peple medicinal liquor of anti arthralgia syndrome on rats with rheumatoid arthritis. Methods 50 female SD rats were randomLy divided into blank group， model group， high， medium and low dose groups （5 mL / kg， 2.5 mL / kg， 1.25 mL / kg） with 10 rats in each group. Except the blank group， the other groups were injected Freunds adjuvant into the ankle joint to establish the arthritis model. After successful modeling， the rats were given corresponding doses of drugs by gavage once a day for 2 weeks. We determined the serum contents of Interleukin-1-β、Interleukin-6 and tumor necrosis factor-αin each group and observed the pathological changes of ankle joint under microscope. Results Compared with the blank group， the serum contents of Interleukin-1-β， Interleukin-6 and tumor necrosis factor-αin the model group was significantly higher （P<0.05）. Compared with the model group， the serum contents of Interleukin-1-β、Interleukin 6， tumour necrosis factor-αdecreased to various degrees， among which the contents of Interleukin-1-βin high-dose group， the contents of interleukin-6 in medium and high-dose groups， the contents of serum tumor necrosis factor in the low， medium and high-dose groups had significantly differences（P<0.05）. Compared with the model group， the hyperemia and edema of the synovium of the joints was alleviated to various degrees in rats treated with different doses of Shui medicinal liquor of anti arthralgia syndrome. The infiltration of inflammatory cells such as lymphocytes and plasma cells was relatively mild.Conclusions Shui Peple liquor of anti arthralgia syndrome can reduce the serum contents of Interleukin-1-β，Interleukin-6 and tumor necrosis factor-αin adjuvant arthritis rats. Therefore， it can alleviate joint synovial inflammation as well as articular cartilage， bone destruction and play an anti-rheumatoid arthritis role.

Shui Peple Medicinal Liquor; Rheumatoid Arthritis; Experimental Study

類風濕關節(jié)炎（ rheumatoid arthritis，RA） 是臨床上一種致殘性很高的疾病，其病理表現(xiàn)為滑膜炎性增生、關節(jié)軟骨破壞、關節(jié)間隙變窄，晚期可出現(xiàn)關節(jié)周圍肌肉萎縮及關節(jié)僵硬變形[1-3]。中藥治療RA在臨床應用上已有較大的突破，其中雷公藤、祖師麻、青楓藤、白芍等有效成分亦被生產(chǎn)成中藥制劑用于臨床治療[4]。然而挖掘及開發(fā)更多中藥、民族藥抗RA制劑也成為目前熱門的課題。本方搜集于三都水族民族地區(qū)民間，其被應用治療類風濕關節(jié)炎、痛風、骨關節(jié)炎已有基礎，而且臨床效果較好。課題組前期已經(jīng)就該藥酒就急性毒性實驗進行了研究并已發(fā)表相關論文。本實驗建立大鼠類風濕關節(jié)炎模型，以不同濃度水族抗痹證藥酒方灌胃干預，觀察其是否具有治療RA的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α ELISA試劑盒購自北京誠林生物公司，弗氏完全佐劑購于美國Sigma公司。顯微鏡 E200型（日本尼康），酶標儀MR-96A型（深圳邁瑞）等。

1.2 ?藥酒的制備 由刺五加、雷公藤、黑骨藤、楤木等按一定比例用53度白酒浸泡3個月以上。

1.3 實驗動物與分組 清潔級SD雌性大白鼠50只，體質重（200±20）g，分籠飼養(yǎng)。造模前用數(shù)字隨機法將大鼠其分成模型組，空白對照組，抗痹證藥酒高、中、低劑量治療組，每組10 只。

1.4 建模及灌胃 佐劑性關節(jié)炎建模[5] 取羊毛脂16 g與液體石蠟（72 mL）加溫后置于研缽中，然后將卡介苗等體積滴加入研缽（逐滴加入），充分研磨均勻后配制成CFA，并分裝至1.5 mL EP管中。除空白組外，其余各組大鼠用75%酒精對大鼠右足趾進行消毒，將CFA 0.15 mL注射于大鼠右足趾皮下，空白組不作任何處理。建模成功后，水族抗痹證藥酒高、中、低劑量組分別給5 mL/kg、2.5 mL/kg、1.25 mL/kg抗痹證藥酒提取物灌胃，空白組及模型組給予等體積蒸餾水灌胃，每天1次，持續(xù)2周。

1.5 指標檢測

1.5.1 大鼠血清中白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α的含量測定 造模第14天，末次給藥1 h后，股動脈取血，靜置，離心，取上清液，在-20 ℃下保存待測。白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α的含量采用ELISA法測定，按照試劑盒說明書操作。

1.5.2 病理組織形態(tài)學檢查 取右踝關節(jié)組織標本于4%甲醛溶液固定，脫鈣，常規(guī)石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，光學顯微鏡鏡檢觀察。

2 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行，計量資料以均數(shù)加減標準差表示，采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠血清中白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α含量測定的結果 與空白組比較，模型組大鼠血清中白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α含量均明顯升高（P<0.05）。與模型組比較，抗痹證藥酒不同劑量組大鼠血清中白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α含量均有不同程度下降，其中高劑量組血清白介素1-β含量，中劑量組和高劑量組血清白介素6含量，低劑量組、中劑量組、高劑量組血清腫瘤壞死因子-α含量比較具有顯著性差異（P<0.05）。詳見表1。

3.2 各組大鼠踝關節(jié)病理切片觀察結果 正常組（圖1 A）關節(jié)滑膜結構層次分明，細胞排列整齊，關節(jié)軟骨及骨質未見破壞;模型組（圖1 B）足關節(jié)滑膜見明顯充血、水腫，血管翳形成，滑膜可見大量淋巴細胞、漿細胞浸潤，關節(jié)軟骨輕度破壞;與模型組相比，水族抗痹證藥酒不同劑量組（圖1 C、圖1 D、圖1 E）大鼠關節(jié)滑膜充血、水腫情況有不同程度減輕，淋巴細胞、漿細胞浸潤情況相對減輕;與低中劑量組比較，高劑量組滑膜充血、水腫情況以及淋巴細胞、漿細胞等炎細胞浸潤最輕。

4 討論

RA發(fā)病機制復雜，炎性介質作用是其發(fā)病的主要因素。而白介素-1β、白介素6、腫瘤壞死因子-α是現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)參與其致炎過程的主要促炎因子之一[2-3，6]。目前在白介素-1家族中有多個成員，其中白介素-1β是通過激活單核-巨噬細胞、B細胞和T細胞參與RA的致炎過程。白介素-1β的主要作用是抑制骨和軟骨的修復，在RA致病過程中是導致骨和軟骨破壞的關鍵細胞因子[7]。研究[8]表明，腫瘤壞死因子-α比白介素-1β更具有致炎作用，高水平的腫瘤壞死因子-α除了參與RA關節(jié)破壞和滑膜炎癥外，還與肉芽腫樣滑膜炎產(chǎn)生相關。腫瘤壞死因子-α和白介素-1β兩種細胞因子之間雖然作用不同，但相互調節(jié)，抑制糖蛋白和膠原合成，影響軟骨的修復，加快骨質破壞[9]。白介素6由滑膜細胞產(chǎn)生的，是RA關節(jié)炎癥中的重要炎癥介質。它雖不直接參與滑膜增生和關節(jié)軟骨破壞，但它是腫瘤壞死因子-α和白介素-1β等炎癥因子的效應因子，具有炎癥放大器的作用[10]。

大鼠注射佐劑后，關節(jié)可出現(xiàn)紅腫熱痛、功能障礙等炎癥表現(xiàn)，血清炎癥因子增高，關節(jié)滑膜增厚，炎細胞浸潤等病理表現(xiàn)，與RA患者的臨床表現(xiàn)十分相似，所以佐劑性關節(jié)炎模型是一種公認的類風濕性關節(jié)炎模型制作方法[5]。本實驗血清炎癥因子檢測結果顯示，與模型組比較，抗痹證藥酒組大鼠血清中白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α含量均有不同程度下降，而高劑量組血清白介素1-β含量、中高劑量組血清白介素6含量和低中高劑量組血清腫瘤壞死因子-α含量比較，具有顯著性差異（P<0.05）。踝關節(jié)鏡下病理觀察可見，與模型組相比，水族抗痹證藥酒不同劑量組（圖1 C、圖1 D、圖1 E）大鼠關節(jié)滑膜充血、水腫情況有不同程度減輕，淋巴細胞、漿細胞浸潤情況相對減輕;與低中劑量組比較，高劑量組滑膜充血、水腫情況，淋巴細胞、漿細胞浸潤情況最輕。證實抗痹證藥酒不同劑量組均具有佐劑性關節(jié)炎大鼠血清中白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α含量的作用，從而減輕關節(jié)滑膜炎癥，關節(jié)軟骨、骨質破壞。水族抗痹證藥酒在抑制大鼠RA模型炎癥因子方面效果顯著，但其作用機制還有進一步挖掘的價值。本實驗證實了該方具有抗RA的效果，為今后民族方藥開發(fā)與利用奠定了理論基礎。

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（收稿日期：2021-10-14 編輯：劉 斌）