苯甲酰烏頭原堿對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞凋亡、炎癥因子的影響

邵鑫 蔣先虹 王瑞

【摘 要】目的：探究苯甲酰烏頭原堿（BAC）對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）凋亡、炎癥因子的影響及具體凋亡機(jī)制，為RA的臨床治療提供參考。方法：募集24例高度活動(dòng)期RA患者（DAS28評(píng)分 > 5.1分），同期納入性別、年齡匹配的16例健康體檢者為正常對(duì)照組（HC組）。采用梯度離心法分離PBMC;分別檢測(cè)加藥前及最終質(zhì)量濃度為0，150，300 μmol·L-1 BAC干預(yù)RA組、HC組PBMC細(xì)胞24 h后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR與Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)

水平;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中炎癥因子白細(xì)胞介素（IL）-1、IL-6、IL-17、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平。結(jié)果：RA組PBMC細(xì)胞中Bcl-2 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量增加，Bax、Caspase-3/Cleaved Caspase-3 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量減少，與HC組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。加入BAC干預(yù)后，150，300 μmol·L-1 BAC加藥組PBMC凋亡率增加，與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。150，300 μmol·L-1 BAC加藥組PBMC中Bcl-2 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低，Bax、Caspase-3/Cleaved Caspase-3 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯增加，與0 μmol·L-1 BAC組比較，除150 μmol·L-1 BAC組Bax mRNA和蛋白表達(dá)外，其余差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。同時(shí)BAC可以降低PBMC培養(yǎng)液中的炎癥因子IL-1、IL-6、IL-17、TNF-α水平，

300 μmol·L-1 BAC組最為顯著，與0 μmol·L-1 BAC組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。結(jié)論：RA患者血清中炎癥因子IL-1、IL-6、IL-17、TNF-α水平升高，PBMC凋亡減少，BAC可能通過Bcl-2/Bax、

Caspase-3途徑誘導(dǎo)PBMC細(xì)胞凋亡，并能降低PBMC中炎癥因子水平。

【關(guān)鍵詞】 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎;苯甲酰烏頭原堿;外周血單個(gè)核細(xì)胞;凋亡;炎癥因子

Effects of Benzoyl Aconitine on Apoptosis of Peripheral Blood Mononuclear Cells and Inflammatory Factors in Patients with Rheumatoid Arthritis

SHAO Xin，JIANG Xian-hong，WANG Rui

【ABSTRACT】Objective：To explore the effects of benzoyl aconitine（BAC）on apoptosis of peripheral blood mononuclear cells（PBMC）and inflammatory factors in patients with rheumatoid arthritis（RA）and the specific apoptosis mechanism，so as to provide reference for the clinical treatment of RA.Methods：Twenty patients with highly active RA（DAS28 score > 5.1）were collected，and 16 healthy physical examiners matched by gender and age were included in the same period as the normal control group（HC group）.PBMC was separated by gradient centrifugation.PBMC cells in the RA group and HC group were detected before medication and till the final mass concentrations being 0 μmol·L-1，150 μmol·L-1 and 300 μmol·L-1.Twenty-four hours later，the expression levels of apoptosis related genes and proteins were detected by real-time fluorescent quantitative PCR and Western blot.The apoptosis rate was detected by flow cytometry.Enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）was used to detect the inflammatory factors IL-1，IL-6，

IL-17 and tumor necrosis factor（TNF-α）in cell culture medium.Results：The relative expressions of Bcl-2 mRNA and protein in PBMC cells of the RA group increased，while the relative expressions of Bax，Caspase-3/Cleaved Caspase-3 mRNA and protein decreased.Compared with the HC group，the difference was statistically significant（P < 0.05）.After BAC intervention，the apoptosis rate of PBMC with mass concentrations of

150 μmol·L-1 and 300 μmol·L-1 increased，and the difference was statistically significant compared with the control group（P < 0.05）.The relative expressions of Bcl-2 mRNA and protein in PBMC with mass concentrations of 150 μmol·L-1 and 300 μmol·L-1 were significantly reduced，and the relative expressions of Bax，Caspase-3/Cleared Caspase-3 mRNA and protein were significantly increased.Compared with the BAC group with mass concentration of 0 μmol·L-1，except for the expression of Bax mRNA and protein in the BAC group with mass concentration of 150 μmol·L-1，the other differences were statistically significant（P < 0.05）.At the same time，BAC can reduce the levels of inflammatory factors IL-1，IL-6，IL-17 and TNF-α in PBMC culture medium，especially in BAC group with mass concentration of 300 μmol·L-1.Compared with the BAC group with mass concentration of 0 μmol·L-1，the difference was statistically significant（P < 0.05）.Conclusion：The levels of inflammatory factors IL-1，IL-6，IL-17 and TNF-α in serum of RA patients increase，while apoptosis decreases.BAC may induce PBMC apoptosis through Bcl-2/Bax and Caspase-3 pathways and reduce the level of inflammatory factors in PBMC.

【Keywords】 rheumatoid arthritis;benzoyl aconitine;peripheral blood mononuclear cells;apoptosis;

inflammatory factors

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種

以滑膜炎為主要特點(diǎn)的自身免疫性疾病，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜[1]，其病理?yè)p傷主要涉及滑膜成纖維細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、單個(gè)核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等[2-3]，與細(xì)胞增殖、凋亡蛋白的表達(dá)異常密切相關(guān)[4]。RA中最明顯的病理改變發(fā)生在關(guān)節(jié)滑膜中，RA滑膜成纖維細(xì)胞凋亡及自噬異?？蓪?dǎo)致滑膜組織增生肥厚，并且出現(xiàn)新生血管，形成血管翳[5]，是臨床上導(dǎo)致RA反復(fù)發(fā)作和預(yù)后不良的主要原因[6]。近年來(lái)有研究表明，血液循環(huán)中的T淋巴細(xì)胞等存在著免疫異常[7]，RA患者外周血中細(xì)胞凋亡出現(xiàn)異常[8]。烏頭類生物堿是一種具有多種免疫調(diào)節(jié)作用的中藥制劑[9]，主要成分為烏頭堿雙酯型生物堿和苯甲酰類單酯型生物堿，烏頭堿毒性強(qiáng)，治療范圍窄[10]，而苯甲酰烏頭原堿（BAC）為單酯型生物堿，毒性大大降低，仍保持一定的藥理活性[11]，但其是否可以誘導(dǎo)外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）凋亡和降低炎癥因子水平需要進(jìn)一步研究。關(guān)節(jié)滑膜組織可通過關(guān)節(jié)置換手術(shù)留取，但由于取材的有創(chuàng)性且手術(shù)患者例數(shù)較少，使得臨床研究具有一定的限制性。目前關(guān)于RA患者PBMC凋亡蛋白的表達(dá)水平及相關(guān)藥物性研究數(shù)據(jù)尚少，為此本研究留取標(biāo)本較為方便的外周血作為首選，檢測(cè)高度活動(dòng)期RA患者PBMC中凋亡相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)，并探索BAC是否能有效誘導(dǎo)其凋亡，為RA的臨床診治和新藥開發(fā)尋找新的靶點(diǎn)提供思路。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 根據(jù)美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（ACR）和歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟（EULAR）2010年RA分類標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算患者得分，選取2018年10月至2019年5月在川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科住院治療的高度活動(dòng)期（DAS28評(píng)分 > 5.1分）RA患者24例為RA組，男6例，女18例，平均年齡（45.72±11.73）歲，紅細(xì)胞沉降率（71.05±15.27）mm·h-1，C反應(yīng)蛋白（65.64±23.40）mg·L-1，類風(fēng)濕因子（70.23±47.91）IU·mL-1。另選取同時(shí)期年齡、性別匹配的健康體檢者16例作為健康對(duì)照組（HC組），男4例，女12例，平均年齡（40.51±14.95）歲。

1.2 試劑與儀器 BAC對(duì)照品（成都曼斯特生物科技有限公司，批號(hào)MUST-17102610，純度98.9%）;1640培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司）;胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）;兔抗人Bcl-2單克隆抗體、兔抗人Bax單克隆抗體、兔抗人Caspase-3單克隆抗體、兔抗人Active Caspase-3單克隆抗體（杭州華安生物科技有限公司，批號(hào)分別為ET1702-53、ET1701-64、ET1602-47）、鼠抗人β-actin單克隆抗體（成都Zen Bioscience公司）、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗（成都Zen Bioscience公司，批號(hào)511203、511103）;ECL化學(xué)發(fā)光液（合肥市Biosharp生物公司）;人淋巴細(xì)胞分離液Ficoll-Hypaque（天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰荆?引物（生工生物工程上海股份有限公司）;Trizol試劑（北京索萊寶科技有限公司）;Transcription Kit QuantiNova逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（德國(guó)QIAGEN公司）;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher公司）;RIPA蛋白裂解液（上海碧云天生物科技有限公司）;BL-150型電子天平（德國(guó)Sartorius公司）;LightCycler96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（瑞士羅氏公司）;Pultton P200 + 型超微量紫外分光光度計(jì)（北京五洲東方科技發(fā)展有限公司）;凝膠成像系統(tǒng)（法國(guó)Vilber Lourmat公司）;脫色搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.3 方 法

1.3.1 PBMC的提取 分別取2組受試者3 mL靜脈血，置于經(jīng)抗凝劑肝素處理過的真空采血管中。應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液采用Ficoll密度梯度離心法分離PBMC。具體操作步驟為：將3 mL靜脈血室溫下水平離心機(jī)以3000 r·min-1離心5 min，離心半徑15 cm，棄上層血清，在只剩血細(xì)胞的真空采集管中加入等體積的磷酸鹽緩沖液稀釋，吹打混勻。取另一離心管加入3 mL淋巴細(xì)胞分離液，混勻后緩慢疊加于淋巴細(xì)胞分離液表面，轉(zhuǎn)移過程中始終保持界面清晰，避免混合，室溫下離心機(jī)以2000 r·min-1離心20 min，離心半徑30 cm，離心后管內(nèi)液體分為4層，PBMC所在細(xì)胞層為白色，將該層細(xì)胞吸取在另一干凈的15 mL離心管中，加入磷酸鹽緩沖液至10～15 mL，1500 r·min-1離心20 min，離心半徑30 cm，離心后去掉上清，清洗后的PBMC使用胎牛血清和1640培養(yǎng)基體外培養(yǎng)。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PBMC凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平 將上述分離得到的PBMC按1.5×105個(gè)·mL-1接種于12孔板中，每孔2 mL，然后分別加入最終質(zhì)量濃度為0，150，300 μmol·L-1的BAC于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h（本實(shí)驗(yàn)濃度由預(yù)實(shí)驗(yàn)得出，下同），檢測(cè)加藥前與加入最終質(zhì)量濃度為0，150，300 μmol·L-1的BAC后細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平。TRIzol提取細(xì)胞總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒Transcription Kit QuantiNova說明操作，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用LightCycler96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀擴(kuò)增，引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以β-actin為內(nèi)參照基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各目標(biāo)基因mRNA的表達(dá)水平。引物序列見表1。

1.3.3 Western blot法檢測(cè)PBMC凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平 將上述分離得到的PBMC按1.5×105個(gè)·mL-1接種于12孔板中，每孔2 mL，然后分別加入最終質(zhì)量濃度為0，150，300 μmol·L-1的BAC于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分別檢測(cè)加藥前與加入最終質(zhì)量濃度為0，150，300 μmol·L-1的BAC后細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，濕法電泳轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗（稀釋度均為1∶1000）4 ℃孵育過夜，次日復(fù)溫后加入二抗（1∶10 000）1 h，用ECL化學(xué)發(fā)光液顯色、定影。用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，β-actin作為內(nèi)參照，以目的蛋白與β-actin吸光度的比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BAC對(duì)PBMC凋亡的影響 用完全培養(yǎng)基調(diào)整上述分離得到的PBMC密度至1.5×105個(gè)·mL-1，接種1 mL于24孔板中，然后分別加入最終質(zhì)量濃度為0，150，300 μmol·L-1的BAC，于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

收集細(xì)胞用PBS洗滌后，加入標(biāo)記熒光素AnnexinV-FITC、PI染色試劑各5 μL，混勻，室溫避光反應(yīng)5 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.3.5 酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)BAC對(duì)炎癥因子的影響 分別取上述3組細(xì)胞的培養(yǎng)液，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定白細(xì)胞介素（IL）-1、IL-6、IL-17、TNF-α的含量，按照試劑盒說明操作。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 RA組與HC組血清中炎癥因子水平比較 成功分離血清后，采用ELISA檢測(cè)炎癥因子，RA組與HC組IL-1、IL-6、IL-17、TNF-α水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表2。

2.2 RA組與HC組PBMC中凋亡相關(guān)基因及蛋白表達(dá)水平比較 實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot法結(jié)果顯示，與HC組比較，RA組PBMC中Bcl-2 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量增加，Bax、Caspase-3/Cleaved Caspase-3 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表3、表4。

2.3 BAC促進(jìn)PBMC凋亡情況 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，150，300 μmol·L-1 BAC加藥組PBMC凋亡率分別為（11.47±1.84）%、（21.05±3.56）%，與0 μmol·L-1 BAC（6.56±0.91）%比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），且具有濃度依賴性。

2.4 BAC對(duì)PBMC凋亡相關(guān)基因及蛋白的影響 實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot法結(jié)果顯示，與0 μmol·L-1 BAC加藥組比較，150，300 μmol·L-1 BAC加藥組PBMC細(xì)胞中Bcl-2 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低，Bax、Caspase-3/Cleaved Caspase-3 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表5、表6。

2.5 BAC對(duì)PBMC培養(yǎng)液中炎癥因子表達(dá)的影響 經(jīng)0，150，300 μmol·L-1 BAC干預(yù)后，150，300 μmol·L-1 BAC加藥組細(xì)胞培養(yǎng)液中炎癥因子IL-1、IL-6、IL-17、TNF-α含量均有所降低，與0 μmol·L-1 BAC加藥組比較，300 μmol·L-1 BAC加藥組降低更為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表7。

3 討 論

RA的發(fā)病機(jī)制至今尚不明確，其特點(diǎn)是慢性反復(fù)發(fā)作，患者大多有炎癥反應(yīng)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)RA患者細(xì)胞中IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子的分泌增多，這與本研究結(jié)果一致。炎癥因子會(huì)促使破骨細(xì)胞的活化及增殖，進(jìn)一步加劇病灶的形成，因而，治療RA的關(guān)鍵之一是控制炎癥，使臨床癥狀得到緩解[12-13]。RA患者滑膜細(xì)胞過度增殖引起滑膜組織異常增生也是導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞的主要原因，近年來(lái)，闡明RA滑膜細(xì)胞的生物學(xué)特性及機(jī)制研究逐漸深入也愈加明確[14-15]。細(xì)胞凋亡是一種受內(nèi)在基因調(diào)控的細(xì)胞主動(dòng)程序化死亡過程，是控制細(xì)胞生長(zhǎng)的主要途徑，線粒體功能障礙被認(rèn)為是發(fā)生凋亡異常的中心環(huán)節(jié)[16]。Bcl-2是抗細(xì)胞凋亡基因，主要分布在線粒體外膜表面，可通過介導(dǎo)細(xì)胞膜的通透性抑制促凋亡蛋白的釋放，從而阻止細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[17-18]。本研究通過檢測(cè)RA組與HC組中PBMC凋亡相關(guān)基因與蛋白的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，RA組中Bcl-2 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量增加，而Bax mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量減少。Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)是細(xì)胞凋亡通路的中心環(huán)節(jié)，Caspase-3是Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游最關(guān)鍵的凋亡蛋白酶，在死亡受體途徑與線粒體凋亡途徑等中介導(dǎo)了細(xì)胞凋亡[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，RA組與HC組PBMC中Active Caspase-3 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量也明顯減少，上述結(jié)果表明，RA患者中PBMC凋亡受到抑制，可能與啟動(dòng)Bax/Bcl-2、Caspase-3線粒體凋亡途徑有關(guān)。

由于烏頭類生物堿表現(xiàn)出治療RA較好的效果，但因毒性強(qiáng)臨床應(yīng)用受到限制[20]，為此本研究采用毒性大大減弱的BAC作為藥物，流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，BAC可以呈濃度依賴性方式促進(jìn)PBMC凋亡。接著筆者采用RT-qPCR與Western blot法觀察了150，300 μmol·L-1的BAC在誘導(dǎo)PBMC細(xì)胞凋亡后，凋亡相關(guān)基因和蛋白的變化。結(jié)果表明，藥物作用后，Bcl-2 mRNA與蛋白表達(dá)上調(diào)，Bax mRNA與蛋白表達(dá)下調(diào)，Active Caspase-3 mRNA與蛋白表達(dá)也顯著下調(diào)，且與藥物的作用濃度相關(guān)。此外，BAC可有效降低PBMC培養(yǎng)上清液中的炎癥因子IL-1、IL-6、IL-17、TNF-α水平，并以高劑量組最為明顯。以上結(jié)果均提示BAC可誘導(dǎo)RA患者中PBMC凋亡，并可降低炎癥因子表達(dá)，對(duì)于RA疾病的機(jī)制研究具有重要意義。

目前，RA的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，研究凋亡相關(guān)基因及蛋白在RA患者PBMC中的表達(dá)水平變化，深入分析細(xì)胞凋亡的調(diào)控情況，進(jìn)一步探討中藥單體有效成分誘導(dǎo)PBMC的凋亡機(jī)制，為闡明RA新的發(fā)病機(jī)制，及其臨床診治提供新的思路具有重要意義。

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收稿日期：2022-05-07;修回日期：2022-06-18