基于RAF-MEK1/MEK2信號(hào)途徑探討脊蛇祛濕膠囊改善膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型大鼠腸道炎癥的作用機(jī)制

李湖帆 鐘琴 馬武開(kāi) 黃穎 朱丹 張瀟東 陳昌明

【摘 要】目的：探討脊蛇祛濕膠囊通過(guò)RAF-MEK1/MEK2信號(hào)途徑改善膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎（CIA）模型大鼠腸道炎癥的作用機(jī)制。方法：將70只SPF級(jí)Wistar雌性大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、脊蛇祛濕膠囊低劑量組、脊蛇祛濕膠囊中劑量組、脊蛇祛濕膠囊高劑量組、益生菌組及甲氨蝶呤組，每組10只。喂養(yǎng)1周后，除空白對(duì)照組外，其余6組構(gòu)建CIA模型，連續(xù)灌胃4周后處死大鼠，分離大鼠腸道組織，進(jìn)行HE染色，并觀察其病理，采用Western blot法檢測(cè)各組大鼠腸道組織RAF、MEK1及MEK2蛋白的表達(dá)水平，RT-qPCR法檢測(cè)大鼠腸道組織RAF、MEK1及MEK2 mRNA的表達(dá)水平。

結(jié)果：大腸病理及Western blot、RT-qPCR結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組腸道組織黏膜層及黏膜下層可見(jiàn)大量細(xì)胞增生，并可見(jiàn)黏膜隆起及充血、水腫。模型對(duì)照組RAF、MEK1、MEK2蛋白及基因在大腸組織中表達(dá)增加，當(dāng)予以一定脊蛇祛濕膠囊干預(yù)后，大鼠腸道組織的病變情況明顯改善，且大腸組織中RAF、MEK1、MEK2蛋白及基因表達(dá)降低。結(jié)論：脊蛇祛濕膠囊可能通過(guò)下調(diào)RAF-MEK1/MEK2信號(hào)途徑改善CIA大鼠的腸道炎癥。

【關(guān)鍵詞】 類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎;腸道炎癥;脊蛇祛濕膠囊;MAPK信號(hào)通路;RAF-MEK1/MEK2信號(hào);膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎;大鼠

Study on the Mechanism of Jishe Qushi Jiaonang（脊蛇祛濕膠囊）in Improving Intestinal Inflammation in Collagen-induced Arthritis Model Rats Based on RAF-MEK1/MEK2 Signal Pathway

LI Hu-fan，ZHONG Qin，MA Wu-kai，HUANG Ying，ZHU Dan，ZHANG Xiao-dong，CHEN Chang-ming

【ABSTRACT】Objective：To explore the mechanism of Jishe Qushi Jiaonang（JQJ，脊蛇祛濕膠囊）in improving intestinal inflammation in collagen-induced arthritis（CIA）model rats through RAF-MEK1/MEK2 signaling pathway.Methods：Seventy female Wistar rats of SPF grade were randomly divided into a blank control group，a model control group，a low-dose JQJ group，a medium-dose JQJ group，a high-dose JQJ group，a probiotics group and a methotrexate group，with 10 rats in each group.After fed for one week，except for the blank control group，the other six groups was used to construct CIA models.The rats were killed after continuous gavage for

4 weeks.The intestinal tissues of the rats were separated，HE staining was made，and their pathology was observed.The expression levels of RAF，MEK1 and MEK2 proteins in the intestinal tissues of the rats in each group were detected by Western blot，and the expression levels of RAF，MEK1 and MEK2 mRNA in the intestinal tissues of the rats were detected by RT-qPCR.Results：The results of colorectal pathology，Western blot and RT-qPCR showed that compared with the blank control group，a large number of cell proliferation，mucosal swelling，congestion and edema could be seen in the intestinal mucosa and submucosa of the model control group.In the model control group，the expressions of RAF，MEK1，MEK2 proteins and genes increased in large intestine tissue.When given a certain JQJ，the pathological changes of rat intestinal tissue were significantly improved，and the expression of RAF，MEK1，MEK2 proteins and genes in large intestine tissue decreased.Conclusion：JQJ may improve intestinal inflammation in CIA rats by down regulating RAF-MEK1/MEK2 signal pathway.

【Keywords】 rheumatoid arthritis;intestinal inflammation;Jishe Qushi Jiaonang（脊蛇祛濕膠囊）;MAPK signal path;RAF-MEK1/MEK2 signal;collagen-induced arthritis;rats

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是慢性損毀性關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的自身免疫疾病，以關(guān)節(jié)晨僵、腫脹、疼痛及功能障礙等為主要表現(xiàn)。引起RA發(fā)病的機(jī)制有很多，其中腸道微生物失調(diào)在RA發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[1]。腸道微生物失調(diào)能夠改變機(jī)體腸道上皮黏膜細(xì)胞的通透性，激活免疫細(xì)胞產(chǎn)生各種炎性因子及抗體在關(guān)節(jié)處或各器官聚集，造成關(guān)節(jié)滑膜組織炎癥及骨質(zhì)破壞，促進(jìn)RA發(fā)病[2]。研究表明，RA患者腸道菌群中異常增多的普雷沃氏菌能夠通過(guò)介導(dǎo)輔助性T細(xì)胞17（Th17細(xì)胞）的炎癥反應(yīng)促進(jìn)RA發(fā)病[3]。Th17細(xì)胞能夠分泌重要的效應(yīng)因子白細(xì)胞介素（IL）-17，IL-17A作為炎癥抗原結(jié)合細(xì)胞上的IL-17受體引發(fā)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)途徑介導(dǎo)炎癥、感染等的發(fā)生和發(fā)展，在RA的發(fā)病機(jī)制中至關(guān)重要[4]。而脊蛇祛濕膠囊在前期研究中已被證實(shí)對(duì)RA具有良好療效，能夠減輕膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎（CIA）模型大鼠足趾的腫脹，降低模型大鼠血清致炎因子IL-17、IL-1、腫瘤壞死因子-α等炎癥因子的分泌。同時(shí)脊蛇祛濕膠囊能降低核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路中的NF-κB/P65、NF-κB/P50蛋白在CIA模型大鼠血清中的表達(dá)，從而減輕關(guān)節(jié)炎癥;另外，脊蛇祛濕膠囊還能通過(guò)下調(diào)CIA大鼠細(xì)胞因子

IL-17、IL-23的表達(dá)，抑制IL-17/IL-23炎癥軸活性，達(dá)到減少RA滑膜炎癥反應(yīng)的目的[5]。但暫無(wú)脊蛇祛濕膠囊對(duì)大鼠腸道炎癥及MAPK相應(yīng)炎癥信號(hào)通路的相關(guān)性研究，腸道微生物導(dǎo)致的腸道炎癥早已被證明與RA密切相關(guān)。故本研究通過(guò)探討脊蛇祛濕膠囊對(duì)大鼠腸道MAPK信號(hào)通路中RAF、MEK1及MEK2蛋白表達(dá)的調(diào)控作用，從腸-關(guān)節(jié)軸出發(fā)為RA治療提供新的理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)6～8周齡雌性Wistar大鼠70只，體質(zhì)量150～180 g，購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（湘）2019-0013，大鼠飼養(yǎng)于貴州中醫(yī)藥大學(xué)甲秀校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。在室溫（25 ℃）環(huán)境下，相對(duì)濕度（50±5）%，飼養(yǎng)間通風(fēng)干燥，并保持安靜，以12 h的晝夜循環(huán)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。本研究通過(guò)貴州中醫(yī)藥大學(xué)倫理審批委員會(huì)審批，批準(zhǔn)號(hào)ky2020035。

1.2 主要藥物與試劑 脊蛇祛濕膠囊（藥物組成：金毛狗脊15 g、烏梢蛇10 g、千年健15 g、黑骨藤10 g、小花青風(fēng)藤15 g、姜黃20 g、白芍15 g、

三七3 g、甘草3 g。院內(nèi)制劑，每粒0.45 g，貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科，黔藥制字Z20160028，批號(hào)170701）;甲氨蝶呤片（通化茂祥制藥有限公司，批號(hào)070405B）;益生菌（雙歧桿菌四聯(lián)活菌片，內(nèi)蒙古雙奇藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)61001095）;牛Ⅱ型膠原凍干粉（Chondrex，批號(hào)200078）;弗氏完全佐劑（Sigma，批號(hào)SLCD4457）;蘇木素（Sigma，批號(hào)H9627）;伊紅Y（國(guó)藥集團(tuán)，批號(hào)71014544）;小鼠單抗β-actin（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)BM0627）;HRP標(biāo)記羊抗小鼠二抗（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)BA1051）;PMSF（阿拉丁，批號(hào)P105539）;兔單抗RAF（Abcam，批號(hào)ab181115）;兔多抗MEK1（affinity，

批號(hào)AF6383）;兔多抗MEK2（Affinity，批號(hào)AF6282）;HiScript?Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）（VAZYME，批號(hào)R233-01）;dNTP（TIANGEN，批號(hào)CD117）。

1.3 主要儀器 病理切片機(jī)（德國(guó)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，Leica RM 2016）;顯微鏡（奧林巴斯型生物顯微鏡，BX53）;電泳儀電源（北京六一儀器廠，DYY-7C）;垂直電泳槽（北京六一儀器廠，DYCZ-24DN）;離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司，HI650）;紫外分析儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，JY02S）;ChemiDoc Touch Imaging System（美國(guó)Bio Rad公司）;TransBlot Turb System（美國(guó)Bio Rad 公司）;熒光定量PCR儀（Applied Biosystems）。

2 方 法

2.1 分組、動(dòng)物模型制備與樣品采集 將70只雌性Wistar大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、脊蛇祛濕膠囊低劑量組、脊蛇祛濕膠囊中劑量組、脊蛇祛濕膠囊高劑量組、益生菌組及甲氨蝶呤組，每組10只。本研究中實(shí)驗(yàn)大鼠的給藥劑量均按照生藥量進(jìn)行換算[6]。除空白對(duì)照組外，其余各組大鼠經(jīng)右后足跖皮內(nèi)及尾根部注射CIA模型乳劑，每只0.1 mL，建立CIA大鼠模型?？瞻讓?duì)照組大鼠于右后足跖皮內(nèi)皮下及尾根部注射等量的生理鹽水。5 d后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，除空白對(duì)照組外，各組大鼠尾根部及右后足墊部消毒后，注射CIA模型乳劑每只0.2 mL致炎。造模第2天，除空白對(duì)照組外，其余大鼠可見(jiàn)關(guān)節(jié)輕度腫脹，加強(qiáng)免疫后可見(jiàn)大鼠關(guān)節(jié)重度腫脹，活動(dòng)受限，食欲減退，符合CIA大鼠模型[7]。造模第7天開(kāi)始給藥干預(yù)，脊蛇祛濕膠囊低劑量組給予脊蛇祛濕膠囊

0.225 g·kg-1·d-1灌胃，脊蛇祛濕膠囊中劑量組給予脊蛇祛濕膠囊0.45 g·kg-1·d-1灌胃，脊蛇祛濕膠囊高劑量組給予脊蛇祛濕膠囊1.35 g·kg-1·d-1灌胃，益生菌組給予益生菌0.35 g·kg-1·d-1灌胃，甲氨蝶呤組給予甲氨蝶呤1 mg·kg-1，每周1次灌胃，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組給予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)28 d。28 d后，處死大鼠，分離腸道組織用于觀察組織病理、Western blot及qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。

2.2 對(duì)大鼠腸道組織進(jìn)行HE染色 取適量腸道組織，使用梯度酒精對(duì)組織進(jìn)行脫水處理，使石蠟?zāi)茼樌貪B入組織，再進(jìn)行浸蠟，包埋，將包埋好的蠟塊使用徠卡病理切片機(jī)進(jìn)行切片，切片在烤箱烤3 h，將石蠟切片依次放入各種溶劑中進(jìn)行脫蠟，蒸餾水再浸洗5 min。再將切片放入蘇木素染液中染色5 min，自來(lái)水洗浸洗返藍(lán)，返藍(lán)切片放入1%水溶性伊紅染液染色5 min，自來(lái)水中浸洗，將切片風(fēng)干后中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察大鼠腸道組織病變情況。

2.3 Western blot法檢測(cè)RAF、MEK1及MEK2蛋

白的表達(dá) 取各組適量的大鼠腸道組織提取總蛋白，分離蛋白上清，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出待測(cè)樣品的蛋白濃度，與蛋白上樣緩沖液放入沸水中水浴進(jìn)行蛋白變性;隨后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳完畢后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，用TBST清洗1次后，用10%脫脂奶粉室溫封閉PVDF膜2 h，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，用TBST洗膜3次，每次5 min，二抗常溫下孵育1 h，用TBST洗膜3次，每次5 min;將PVDF膜用濾紙輕輕沾干后，加入顯影液，反應(yīng)2 min后放入ChemiDoc Touch Imaging System進(jìn)行曝光，檢測(cè)待測(cè)目的條帶并分析條帶灰度值。

2.4 RT-qPCR法檢測(cè)RAF、MEK1及MEK2 mRNA

的表達(dá) 在冰凍腸道組織中加入Trizol試劑，用勻漿器研磨移至無(wú)RNase的1.5 mL EP管中，裂解后加入氯仿于EP管中，混勻數(shù)次，室溫放置再離心8 min，可見(jiàn)RNA主要分布在水相中，再轉(zhuǎn)移上層水相于另一新的1.5 mL EP管中，加入異丙醇后靜置10 min，棄去上清，加入無(wú)RNase的75%乙醇1 mL，混勻后離心機(jī)以12000 r·min-1離心

5 min，離心半徑8.5 cm，計(jì)算RNA的純度和濃度，根據(jù)OD260/OD280比值，估測(cè)RNA質(zhì)量，根據(jù)吸光光度值按下列公式計(jì)算樣品RNA的濃度：總RNA濃度（μg·μL-1）= OD260×40×10-3。將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，稀釋10倍作為模板上機(jī)檢測(cè)，目的基因相對(duì)定量通過(guò)內(nèi)參基因CT值與待檢基因CT值經(jīng)2-△△Ct計(jì)算，得出樣本間表達(dá)量差異倍數(shù)關(guān)系。目的基因RAF、MEK1、MEK2及內(nèi)參基因β-actin引物序列見(jiàn)表1。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以表示，采用方差分析及t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 各組大鼠行為學(xué)表現(xiàn) 與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組早期致炎部位的炎癥反應(yīng)多出現(xiàn)對(duì)側(cè)和前足腫脹，呈進(jìn)行性加重，行動(dòng)不便，耳和尾部出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎小結(jié)，以及質(zhì)量下降等特征，大鼠主要表現(xiàn)為體質(zhì)量減輕，精神萎靡，攝食及其他活動(dòng)減少，帶有病態(tài)，伴輕微脫毛等關(guān)節(jié)癥狀，一般自后足首發(fā)，逐漸蔓延至前足，癥狀呈進(jìn)行性加重。經(jīng)喂養(yǎng)干擾藥物后，脊蛇祛濕膠囊高劑量組及甲氨蝶呤組較模型對(duì)照組明顯好轉(zhuǎn)，與空白對(duì)照組行為學(xué)表現(xiàn)基本一致。脊蛇祛濕膠囊中、低劑量組及益生菌組與模型對(duì)照組比較，行為學(xué)表現(xiàn)稍減輕。

3.2 脊蛇祛濕膠囊對(duì)CIA大鼠腸道組織病理學(xué)的影響 空白對(duì)照組腸道組織黏膜層及黏膜下層無(wú)充血、水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜層及黏膜下層細(xì)胞排列整齊。模型對(duì)照組腸道組織黏膜層及黏膜下層可見(jiàn)大量細(xì)胞增生，大量炎性細(xì)胞成彌漫性浸潤(rùn)，并可見(jiàn)黏膜隆起及充血、水腫。脊蛇祛濕膠囊低劑量組腸道黏膜層及黏膜下層可見(jiàn)中等量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腸道組織增生、水腫，腸道黏膜層及黏膜下層細(xì)胞排列紊亂，與模型對(duì)照組比較無(wú)明顯改善。脊蛇祛濕膠囊中、高劑量組和甲氨蝶呤組可見(jiàn)少量新生血管形成，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)少，與模型對(duì)照組比較，炎性浸潤(rùn)、增生、血管新生組織有明顯改善，脊蛇祛濕膠囊高劑量組和甲氨蝶呤組作用效果相當(dāng)。見(jiàn)圖1。

3.3 脊蛇祛濕膠囊對(duì)CIA大鼠腸道組織RAF、MEK1及MEK2蛋白表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠腸道中RAF、MEK1及MEK2蛋白的表達(dá)水平明顯升高（P < 0.05）;與模型對(duì)照組比較，各給藥組大鼠腸道中RAF、MEK1及MEK2蛋白的表達(dá)水平明顯降低（P < 0.05）。

見(jiàn)圖2、表2。

3.4 脊蛇祛濕膠囊對(duì)CIA大鼠腸道組織RAF、MEK1及MEK2 mRNA表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組RAF、MEK1及MEK2 mRNA蛋白表達(dá)顯著升高（P < 0.05）。與模型對(duì)照組比較，各給藥組RAF、MEK1及MEK2 mRNA蛋白表達(dá)顯著降低（P < 0.05）。見(jiàn)表3。

4 討 論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，RA為痰濁、瘀血、水濕等邪侵襲肢體經(jīng)絡(luò)引起氣血運(yùn)行不暢，經(jīng)絡(luò)痹阻所致。而脊蛇祛濕膠囊的主要作用為祛瘀消痰、通痹止痛。貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院風(fēng)濕科長(zhǎng)期治療RA的臨床經(jīng)驗(yàn)及前期研究成果發(fā)現(xiàn)，脊蛇祛濕膠囊能緩解RA患者關(guān)節(jié)腫痛，調(diào)節(jié)骨代謝，降低甲氨蝶呤等免疫抑制劑類(lèi)藥物的不良反應(yīng)[8]。

大量研究認(rèn)為，腸道在許多炎癥性疾病中扮演著重要的角色，腸漏、腸道微生態(tài)失調(diào)和腸道炎癥不僅與小腸結(jié)腸炎、克羅恩病等消化系統(tǒng)疾病有關(guān)，而且也與自身免疫性疾病密切相關(guān)，如RA、系統(tǒng)性紅斑狼瘡及多發(fā)性硬皮病等[9-10]。腸道微生物與宿主的發(fā)育、生長(zhǎng)及物質(zhì)代謝密切相關(guān)，且對(duì)機(jī)體的免疫應(yīng)答起重要的調(diào)節(jié)作用，若腸道菌群發(fā)生紊亂，則易產(chǎn)生腸道炎癥，使腸道天然屏障作用逐漸減弱，機(jī)體的抵抗力降低，無(wú)法發(fā)揮正常的抗菌能力，機(jī)體免疫系統(tǒng)減弱，即可增加患病風(fēng)

險(xiǎn)[11]。目前，腸-關(guān)節(jié)軸成為許多自身免疫性疾病研究的重點(diǎn)，研究表明，腸道微生物失調(diào)可導(dǎo)致腸道炎癥而使RA患者的病情加重[12]。此外，研究人員通過(guò)干預(yù)腸道Wnt/β-catenin通路能夠改變CIA大鼠的腸道炎癥情況及RA的嚴(yán)重程度，提示CIA模型與腸道炎癥密切相關(guān)[13]。約75%早期未經(jīng)治療的RA患者中有普氏菌，普氏菌會(huì)排擠對(duì)抗炎癥的微生物群，或自身促進(jìn)炎癥。隨著普氏菌的相對(duì)豐度及數(shù)量增加，會(huì)在腸道黏膜介導(dǎo)Th17細(xì)胞發(fā)生腸道炎癥[14]。Th17細(xì)胞通過(guò)分泌IL-17促進(jìn)自身免疫疾病的發(fā)展，IL-17結(jié)合其在腸道上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的受體引發(fā)MAPK信號(hào)通路影響著RA的病情[15]。

MAPK信號(hào)通路主要是通過(guò)氧化及激活轉(zhuǎn)錄因子，控制炎性因子表達(dá)參與整個(gè)RA炎癥的過(guò)

程[16]。RAF、MEK1及MEK2是MAPK信號(hào)通路中的重要一員，也是RAS-RAF-MEK-ERK通路中重要的信號(hào)分子，活化的RAS通過(guò)與RAF的結(jié)構(gòu)域結(jié)合從而使RAF激活，活化后的RAF能夠進(jìn)一步與下游的MEK蛋白結(jié)合進(jìn)而使MEK激活，激活后的MEK再進(jìn)一步激活下游的唯一底物ERK，最后活化的ERK進(jìn)入細(xì)胞核，繼而引起一系列生理、生化反應(yīng)。在細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化、腫瘤發(fā)生等方面發(fā)揮著重要作用[17]。在RA的發(fā)生、發(fā)展中，由于RAF、MEK1等基因的突變，導(dǎo)致該通路持續(xù)活化。其中，MEK蛋白與腸道炎癥密切相關(guān)，當(dāng)MEK信號(hào)通路被抑制，損傷的腸黏膜可被修復(fù)，腸道炎癥減輕[18]。另外，通過(guò)抑制RAF蛋白的表達(dá)，可使腸道中的巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)減少，抑制腸上皮細(xì)胞壞死和防止腸屏障功能喪失，也可使腸道炎癥緩解[19]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組RAF、MEK1、MEK2蛋白及RAF、MEK1、MEK2 mRNA在大腸組織中表達(dá)增加。當(dāng)予一定脊蛇祛濕膠囊干預(yù)后，大腸組織中RAF、MEK1、MEK2蛋白及RAF、MEK1、MEK2 mRNA表達(dá)降低，證明脊蛇祛濕膠囊可通過(guò)抑制RAF、MEK1、MEK2蛋白的表達(dá)減輕腸道炎癥。另外，1.35 g·kg-1劑量的脊蛇祛濕膠囊與甲氨蝶呤抑制RAF、MEK1、MEK2蛋白的表達(dá)量相當(dāng)，劑量太小則抑制效果不明顯，從治療RA及藥物不良反應(yīng)的角度，對(duì)于長(zhǎng)期服用脊蛇祛濕膠囊治療的RA患者來(lái)說(shuō)，能夠降低一定的不良反應(yīng)。同時(shí)病理切片顯示，予以脊蛇祛濕膠囊后腸道黏膜層及黏膜下層的充血、水腫及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕，大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)如足腫脹、精神等得到明顯改善。RA作為一種慢性疾病，服用藥物種類(lèi)多，時(shí)間長(zhǎng)，容易導(dǎo)致胃腸道疾病產(chǎn)生腸道炎癥，同時(shí)腸道菌群失調(diào)也可產(chǎn)生腸道炎癥，故RA患者需長(zhǎng)期服用護(hù)胃藥。而實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，脊蛇祛濕膠囊作為中藥可改善腸道炎癥，提示脊蛇祛濕膠囊可緩解傳統(tǒng)抗風(fēng)濕藥對(duì)RA患者造成的腸胃損傷。結(jié)合Western blot、RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果及病理切片、大鼠行為學(xué)表現(xiàn)，證實(shí)脊蛇祛濕膠囊可通過(guò)抑制RAF、MEK1、MEK2蛋白的表達(dá)改善腸道炎癥從而治療RA。

綜上所述，通過(guò)制備CIA模型，發(fā)現(xiàn)脊蛇祛濕膠囊能改善大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)，抑制機(jī)體腸道炎癥反應(yīng)，下調(diào)RAF-MEK1/MEK2信號(hào)表達(dá)，發(fā)揮治療RA的作用。本研究可為脊蛇祛濕膠囊治療RA提供一定的理論依據(jù)，同時(shí)通過(guò)研究

RAF-MEK1/MEK2蛋白在腸道的表達(dá)來(lái)探索更多的中藥用于治療RA。

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收稿日期：2022-03-12;修回日期：2022-04-25