壯藥羊開口的化學(xué)成分研究

劉立輝　鄒準(zhǔn)　周艷林　鐘小清　呂高榮　周志宏　鄒節(jié)明

【摘 要】 目的： 研究壯藥羊開口的化學(xué)成分。方法： 利用硅膠、MCI gel、Sephadex LH-20、反相C₁₈柱色譜進(jìn)行分離純化，根據(jù)化合物的波譜數(shù)據(jù)和薄層色譜鑒定其結(jié)構(gòu)。結(jié)果： 從羊開口的75%乙醇提取物中分離鑒定了6個(gè)化合物，分別鑒定為胡蘿卜苷（Ⅰ）、白樺脂酸（Ⅱ）、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（Ⅲ）、3，3′，4′-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（Ⅳ）、沒食子酸甲酯（Ⅴ）和沒食子酸（Ⅵ）。結(jié)論： 化合物Ⅱ、Ⅳ均為首次從該植物中分離得到。

【關(guān)鍵詞】 羊開口;展毛野牡丹;野牡丹科;野牡丹屬;化學(xué)成分;結(jié)構(gòu)鑒定

【中圖分類號(hào)】R284.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2022）14-0036-03

Chemical Constituents from Zhuang Medicine Radix Melastomatis normalis

LIU Lihui¹ZOU Zhun¹ZHOU Yanlin¹ZHONG Xiaoqing¹LV Gaorong¹ZHOU Zhihong²ZOU Jieming^1*

1. Guilin Sanjin Pharmaceutical Co.， Ltd.， Guilin 541004， China;

2. School of Chinese Medicine， Yunnan University of Chinese Medicine， Kunming 650500， China

Abstract：Objective To study the chemical constituents from Zhuang medicine Radix Melastomatis normalis. Methods The constituents were separated and purified by various chromatographic methods such as Silica gel， MCI gel，Sephadex LH-20 and Reverse-phase C₁₈，and their structures were identified by spectral data analyses and TLC. Results Six compounds were isolated from the 75% ethanol extracts of Radix Melastomatis normalis and identified as daucosterol（Ⅰ），betulinic acid（Ⅱ）， 4-O-β-D-glucopyranosyl-3，3′-di-O-methylellagic acid（Ⅲ）， 4-O-β-D-glucopyranosyl-3，3′，4′-tri-O-methylellagic acid（Ⅳ），methyl gallate（Ⅴ），and gallic acid（Ⅵ）.Conclusion Compounds Ⅱ and Ⅳ were obtained from the plant for the first time.

Key words：Radix Melastomatis normalis;Melastoma normale D.Don;Melastomaceae;Melastoma L.;Chemical Constituents;Structural Identification

壯藥羊開口為野牡丹科（Melastomaceae）野牡丹屬（Melastoma L.）植物展毛野牡丹Melastoma normale D.Don的干燥根，為廣西壯醫(yī)藥習(xí)用藥材，收載于《廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（第一卷）》，壯藥名為棵芒難，味甘、酸、澀，微溫，具有收斂、止血、解毒的功效，用于泄痢、崩漏帶下、內(nèi)外傷出血^[1]?，F(xiàn)代藥理研究^[2]表明，羊開口提取物對(duì)艾滋病毒逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA多聚酶活性具有抑制作用。羊開口是中成藥三金片系列產(chǎn)品的重要原料之一，目前關(guān)于羊開口化學(xué)成分的研究報(bào)道并不多，報(bào)道的化學(xué)成分主要包括β-谷甾醇、鞣花酸、沒食子酸及其衍生物等少數(shù)化合物^[3]。文獻(xiàn)^[4]報(bào)道從展毛野牡丹分離得到一些酚類化學(xué)成分，但該化學(xué)成分的種類依然還是沒食子酸衍生物和少量的酚苷類化合物。因此，為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)羊開口的化學(xué)成分，明確相關(guān)活性與藥用物質(zhì)基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)羊開口的化學(xué)成分進(jìn)行了研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器 UV2401PC型紫外可見分光光度計(jì)（日本Shimadzu公司）;Finnigan MAT-90型質(zhì)譜儀（美國Finnigan公司）;Bruker AM-400和DRX-500核磁共振儀（德國Bruker公司，TMS為內(nèi)標(biāo)）; XP 205電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）;MILLI-Q密理博超純水儀（德國Merck公司）;LC-20A型島津半制備高效液相色譜儀（日本島津公司）;RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）;SHB-ⅢA型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）;CCA-1112A冷卻水循環(huán)裝置（上海愛郎儀器有限公司）;WFH-201B暗箱式紫外透射反射儀（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2 材料 柱色譜硅膠（200～300目）和薄層層析硅膠板G（青島海洋化工廠）;反相C₁₈填料（40～60 μm）（日本Fuji公司）;MCI CHP-20（75～150 μm）（日本Mitsubishi Chemical公司）;Sephadex LH-20（瑞典Amersham Biosciences公司）;提取用乙醇為市售食品級(jí)，其余化學(xué)試劑均為市售色譜純或分析純。羊開口采自廣西桂林市永福縣，其原植物經(jīng)中國科學(xué)院廣西植物研究所蔣水元研究員鑒定為展毛野牡丹Melastoma normale D.Don。植物標(biāo)本存放于桂林三金藥業(yè)股份有限公司企業(yè)技術(shù)中心。

2 提取和分離

羊開口干燥根10 kg，粉碎后加75%乙醇加熱回流提取3次，每次2 h，濾過，濾液合并濃縮成浸膏加水混懸，靜置，出現(xiàn)大量沉淀，濾過，得沉淀（87 g），濾液用等體積三氯甲烷萃取3 次，三氯甲烷萃取液合并濃縮得到三氯甲烷萃取部位浸膏（11 g）。將三氯甲烷萃取部位浸膏與前所得沉淀分別取樣加適量溶劑溶解，通過在TLC上用相同溶劑系統(tǒng)展開對(duì)比，三氯甲烷萃取部位浸膏色譜中，在與前所得沉淀色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。將三氯甲烷萃取部位浸膏與前所得沉淀合并，經(jīng)硅膠柱色譜（石油醚-丙酮梯度、三氯甲烷-甲醇梯度）洗脫，合并得到5 個(gè)組分（Fr.1～Fr.5）。Fr.2（40 g）經(jīng)硅膠柱色譜（三氯甲烷-甲醇梯度）洗脫，合并得到2 個(gè)組分（Fr.2.1～Fr.2.2）。Fr.2.1（2g）經(jīng)硅膠柱色譜（三氯甲烷-甲醇梯度）反復(fù)洗脫、MCI 柱色譜（甲醇-水梯度）洗脫，最后經(jīng)重結(jié)晶，得化合物Ⅱ（63 mg）和Ⅵ（66 mg）;Fr.2.2（3g）經(jīng)硅膠柱色譜（三氯甲烷-甲醇梯度）反復(fù)洗脫，再經(jīng)重結(jié)晶，得到化合物Ⅰ（220 mg）。Fr.4（20 g）經(jīng)硅膠柱色譜（三氯甲烷-甲醇梯度）洗脫，合并得到3 個(gè)組分（Fr.4.1～Fr.4.3）。Fr.4.3（1g）經(jīng)硅膠柱色譜（三氯甲烷-甲醇梯度）反復(fù)洗脫、反相C₁₈柱色譜（甲醇-水梯度）洗脫，最后經(jīng)重結(jié)晶，得到化合物Ⅲ（10 mg）和Ⅴ（77 mg）。三氯甲烷萃取剩余水層經(jīng)MCI 柱色譜（甲醇-水梯度）、硅膠柱色譜（三氯甲烷-甲醇梯度）、Sephadex LH - 20 柱色譜（甲醇-水梯度）洗脫，最后經(jīng)重結(jié)晶，得到化合物Ⅳ（45 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物Ⅰ：白色粉末（甲醇），UV λmax nm （MeOH）：198，246。ESI-MS m/z：599 [M+Na]⁺，分子式為C₃₅H₆₀O₆。¹H-NMR （DMSO） δ：5.32（1H，s，H-6），4.90（1H，d，J=8.0 Hz，H-1），4.42（1H，t，H-3），0.93（3H，s，H-19），0.65（3H，s，H-18）;¹³C-NMR （DMSO） δ：140.9（C-5），121.7（C-6），101.3（C-1′），77.4（C-5′），77.4（C-3），77.2（C-3′），73.9（C-2′），70.6（C-4′），61.6（C-6′），56.6（C-14），55.9（C-17），50.1（C-9），45.6（C-24），42.3（C-13），40.6（C-4），39.4（C-16），37.3（C-1），36.7（C-10），36.7（C-20），33.8（C-22），31.9（C-7），31.8（C-8），29.7（C-2），29.2（C-12），28.3（C-25），25.9（C-28），24.3（C-15），23.1（C-23），21.1（C-26），20.2（C-27），19.6（C-11），19.4（C-21），19.1（C-19），12.2（C-29），12.2（C-18）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)^[5]報(bào)道的胡蘿卜苷數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為胡蘿卜苷。

化合物Ⅱ：白色針晶（甲醇），UV λmax nm （MeOH）：246。 EI-MS m/z：455 [M-H]-，分子式為C₃₀H₄₈O₃。¹H-NMR （C₅D₅N） δ：4.95， 4.76（each 1H， m， CH₂-29 ）， 3.45（1H， m， H-3 ）， 1.77， 1.21， 1.07， 1.06， 1.01， 0.83（each 3H，s，CH₃×6）;¹³C-NMR （C₅D₅N） δ：178.6 （C-28）， 151.1（C-20）， 109.7（C-29）， 77.9 （C-3）， 56.4 （C-17）， 55.7（C-5）， 50.7（C-9）， 49.5（C-19）， 47.5（C-18）， 42.6（C-14）， 40.9（C-8）， 39.3（C-4）， 39.0（C-1）， 38.4（C-13）， 37.3（C-10）， 37.3（C-22）， 34.6（C-7）， 32.6（C-16）， 31.0（C-15）， 30.0（C-21）， 28.4（C-23）， 28.1（C-2）， 25.9（C-12）， 21.0（C-11）， 19.2（C-30）， 18.5（C-6）， 16.1（C-24）， 16.2（C-25）， 16.2（C-26）， 14.7（C-27），以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)^[6]報(bào)道的白樺脂酸數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為白樺脂酸。

化合物Ⅲ：柱狀晶片（甲醇），UV λmax nm （MeOH）：246，364。EI-MS m/z：491 [M-H]-，分子式為C₂₂H₂₀O₁₃。¹H-NMR （DMSO） δ：7.78（1H， s，H-5′）， 7.49（1H， s，H-5）， 5.12（1H， d，J=9.0 Hz，H-1″）， 4.04（3H， s，OCH₃-3′）， 4.00（3H， s，OCH₃-3）;¹³C-NMR （DMSO） δ：158.3（C-7 and 7′）， 152.8（C-4′）， 151.5（C-4）， 141.8（C-3′）， 141.6（C-3）， 140.9（C-2′）， 140.2（C-2）， 114.1（C-1）， 112.7（C-6）， 111.9（C-5）， 111.8（C-5′）， 111.6（C-6′）， 111.1（C-1′）， 101.4（C-1″）， 77.2（C-5″）， 76.5（C-3″）， 73.3（C-2″）， 69.5（C-4″）， 60.5（C-6″）， 61.6（3-OCH₃）， 60.9（3′-OCH₃）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)^[7]報(bào)道的3，3′-二甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為3，3′-二甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物Ⅳ：白色粉末（甲醇），UV λmax nm （MeOH）：246， 364。ESI-MS m/z：529 [M+Na]⁺，分子式為C₂₃H₂₂O₁₃。¹H-NMR （C₅D₅N） δ：8.47（1H， s， H-5′）， 7.82（1H， s， H-5）， 5.93（1H， d，J=7.8 Hz， H-1″）， 4.25， 4.15（6H， s， 3，3′-2 × OCH₃）， 3.87（3H， s， 4′-OCH₃）;¹³C-NMR （C₅D₅N） δ：158.8（C-7）， 158.6（C-7′）， 154.8（C-4′）， 152.8（C-4）， 142.6（C-3）， 141.8（C-2）， 141.8（C-2′，3′）， 113.9（C-1）， 113.3（C-6）， 113.1（C-1′）， 113.1（C-5）， 112.6（C-6′）， 108.0（C-5′）， 102.7（C-1″）， 78.9（C-2″）， 78.31（C-3″）， 74.6（C-4″）， 70.86（C-5″）， 62.10（C-6″），61.7（3-OCH₃）， 61.3（3′-OCH₃）， 56.4（4′-OCH₃），以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)^[8]報(bào)道的3，3′，4′-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為3，3′，4′-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物Ⅴ：淺黃色晶體（甲醇），UV λmax nm （MeOH）：274。分子式為C₈H₈O₅。¹H-NMR （MeOD） δ：7.06（2H，s）， 3.83（3H， s）;¹³C-NMR （MeOD） δ：169.1（C-7）， 146.4（C-3，5）， 139.8（C-4）， 121.4（C-1）， 110.1（C-2，6）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)^[9]報(bào)道的沒食子酸甲酯數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為沒食子酸甲酯。

化合物Ⅵ：針狀晶體（甲醇），通過在TLC上用3種溶劑系統(tǒng)展開對(duì)比，與沒食子酸對(duì)照品斑點(diǎn)顏色及Rf值均一致，故鑒定為沒食子酸。

4 討論

研究從羊開口的乙醇提取物中分離鑒定了6個(gè)化合物，包括1個(gè)甾體類化合物，1個(gè)三萜類化合物，2個(gè)鞣酸類化合物，2個(gè)酚酸類化合物，進(jìn)一步證實(shí)了可水解鞣酸類成分為本屬植物的特征性成分之一^[10]。

文獻(xiàn)^[11]報(bào)道，胡蘿卜苷具有良好的抗腫瘤、抗氧化以及保護(hù)神經(jīng)等藥理作用。白樺脂酸具有一定的抗腫瘤、抗病毒、抗氧化應(yīng)激、抗炎等藥理活性，尤其是在抗腫瘤、抗HIV、抗黑色素瘤方面，展現(xiàn)出良好的開發(fā)前景。白樺脂酸通過抑制COX-2介導(dǎo)的NF-κB和ERK1/2通路抑制丙肝病毒復(fù)制，可作為一種治療HCV感染患者潛在的藥物開發(fā)先導(dǎo)化合物^[12]。鞣花酸苷類物質(zhì)3，3′-二甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷在1～500 μg·mL^-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)人胃癌MGC細(xì)胞、人肝癌HepG-2細(xì)胞、人盲腸癌Hce-8693細(xì)胞增殖均有一定的抑制作用，隨著劑量的增大和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，呈較好的劑量-時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系^[13]。沒食子酸甲酯具有一定的抗氧化活性，其IC₅₀值為8.99 μmol·L^-1[14]。沒食子酸甲酯還可以通過抑制Akt和ERK1/2磷酸化，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移，顯示出一定的抗腫瘤作用^[15]。沒食子酸具有一定的生物活性，包括抗氧化、抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎作用等。沒食子酸可以抑制促細(xì)胞炎性因子腫瘤壞死因子、白介素-6和白介素-1的分泌，間接抑制革蘭陰性菌細(xì)胞壁中的脂多糖誘發(fā)炎性反應(yīng)^[16]。

根據(jù)研究分離得到的化學(xué)成分及相關(guān)活性報(bào)道，初步證實(shí)了羊開口具有一定的抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗菌、抗炎的活性物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)也初步證實(shí)了羊開口的收斂、止血、解毒的中醫(yī)功效以及泄痢、崩漏帶下、內(nèi)外傷出血的臨床應(yīng)用具有一定的合理性，為完善羊開口的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及進(jìn)一步的研究開發(fā)提供了理論依據(jù)。關(guān)于該植物更多的化學(xué)成分和深入的藥理作用機(jī)制仍有待更進(jìn)一步的研究。

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（收稿日期：2021-12-04 編輯：陶希睿）