刺梨鮮果質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究

祝清燦 石亞 孫宜春 段麗 王杏 劉凱 李慧馨 豐敏

【摘 要】 目的：進(jìn)一步提升鮮刺梨果藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：用薄層色譜法（TLC）對(duì)鮮刺梨果藥材進(jìn)行鑒別，采用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)刺梨果中的維生素C進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果：供試品薄層色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn);維生素C進(jìn)樣量在0.6606～3.9636 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（R2=0.9998）;平均回收率為：98.37%，RSD=2.0%;結(jié)論：薄層鑒別方法專屬性強(qiáng)，高效液相色譜法精密度高，重復(fù)性好，可用于刺梨果的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】 刺梨果;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);薄層色譜;HPLC;維生素C

【中圖分類號(hào)】R284.1?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號(hào)】1007-8517（2022）16-0048-05

Study on the Improvement of the Quality Standard of Rosa Roxburghii Tratt

ZHU Qingcan SHI Ya SUN Yichun* DUAN Li WANG Xing LIU Kai LI Huixin FENG Min

Sinopharm Group Tongjitang（Gui zhou） Pharmaceutical Co.，Ltd.，Guiyang 550026， China

Abstract：Objective? Further improve the quality standards of Rosa roxburghii Tratt.Methods Thin layer chromatography （TLC） was used to identify the Rosa roxburghii Tratt， and the content of vitamin C in the Rosa roxburghii Tratt was determined by high-performance liquid chromatography （HPLC）.Results In the thin layer chromatography of the test product， spots of the same color appeared on the corresponding position of the chromatogram of the control medicinal material; the injection amount of vitamin C showed a good linear relationship with the peak area in the range of 0.6606～3.9636 μg （R2=0.9998）; average recovery Rate 100.22%， RSD=1.57%.Conclusion The thin-layer identification method has strong specificity， high-performance liquid chromatography with high precision and good repeatability， and can be used for quality control of prickly pear fruit.

Key words：Rosa Roxburghii Tratt; Quality Standard; Thin Layer Chromatography; HPLC; Vitamin C

刺梨，又名送春花、茨梨、木梨子、梨石榴，為薔薇科植物單瓣繅絲花Rosa roxburghii Tratt.f.normalis Rehd.et Wils.及繅絲花Rosa roxburghii Tratt.的果實(shí)，味酸甜、澀，8～10月采收，鮮用，為《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》[1]收錄的貴州省少數(shù)民族用藥，廣泛分于貴州、云南、四川、陜西、甘肅、安徽、浙江、江西、福建、湖北、湖南、西藏等省區(qū)，是貴州特色水果資源。具有消食健脾，收斂止瀉的功效，臨床主要用于積食腹脹、泄瀉等?，F(xiàn)代研究[2]表明，刺梨果肉中含大量的維生素、有機(jī)酸、超氧化物歧化酶（SOD）、刺梨黃酮、刺梨多糖、氨基酸、微量元素等成分，尤以維生素C的含量最為豐富，被譽(yù)為“維C之王”，具有抗氧化、抗腫瘤、延緩衰老、抗應(yīng)激、調(diào)節(jié)消化系統(tǒng)、降低重金屬負(fù)荷等藥理作用[3-6]?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下僅收載性狀、理化鑒別項(xiàng)目，鑒別方法專屬性不強(qiáng)。貴州省藥品監(jiān)督管理局將刺梨納入《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究》計(jì)劃，筆者建立了薄層色譜鑒別方法，采用高效液相色譜法測(cè)定鮮刺梨果中維生素C含量，為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)修訂提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Vanquish型超高效液相色譜儀 （賽默飛世爾科技有限公司）;Agilent 1260型高效液相色譜儀[ 安捷倫科技（中國）有限公司];色譜柱：PntulipsTM BP-NH2（250 mm×4.6 mm，5 μm），Welch Ultimate Hilic-NH2（250 mm×4.6 mm，5 μm）;菲羅門 ACE Excel NH2（250 mm×4.6 mm，5 μm）;Goodsee-II型紫外分析儀（上?？普苌萍加邢薰荆?202-0型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海路達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）;ME204TE/02型電子天平[梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司];SB25-12DTS型數(shù)控超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 試藥 刺梨對(duì)照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：121356-200401）;維生素C對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：C100425-201504）;乙腈（美國天地，批號(hào)：19035082）;甲醇[重慶江川化工（集團(tuán)）有限公司，批號(hào)：21070908];乙醇[重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司，批號(hào)：20170901];鹽酸[重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司，批號(hào)：20200401];乙酸乙酯（成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)：2017050201）;醋酸[重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司，批號(hào)：20190701];二水合草酸（成都金山化工試劑廠，批號(hào)：20170312）;磷酸[重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司，批號(hào)：20190601];化學(xué)試劑均為分析純;水為自制純化水。

1.3 材料 自制硅膠G薄層板（批號(hào)：20171108）;硅膠G薄層板（青島海浪硅膠干燥劑有限公司，批號(hào)：20140820）;硅膠G預(yù)制板（德國默克公司，批號(hào)：1.05626.0001;國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20170912）;硅膠G薄層板（批號(hào)：20170720）、硅膠G高效板（批號(hào)：20170831）、硅膠H板（批號(hào)：20160715）、硅膠GF254板（批號(hào)：20140910）均購自青島海洋化工有限公司。樣品由國藥集團(tuán)同濟(jì)堂（貴州）制藥有限公司種植部提供，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院何順志教授鑒定為薔薇科植物單瓣繅絲花Rosa roxburghii Tratt.f.normalis Rehd.et Wils.及繅絲花Rosa roxburghii Tratt.的果實(shí)。憑證標(biāo)本存放于國藥集團(tuán)同濟(jì)堂（貴州）制藥有限公司。樣品來源見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別 將鮮刺梨果搗碎，取果肉漿約10 g，加水20 mL，超聲處理20 min，過濾，取濾液，用鹽酸飽和的乙醚萃取2次，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取刺梨果對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法《中國藥典》2020年版四部通則（0502）試驗(yàn)[7]，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（30～60 ℃）-乙酸乙酯-甲酸（5∶4∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，揮干，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。置日光下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。如圖1所示。

2.2 維生素C含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 以氨基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以甲醇∶0.1%偏磷酸溶液（10∶90）為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)為243 nm;流速為1mL·min-1;柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。理論板數(shù)按維生素C峰計(jì)算不低于5000。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取維生素C對(duì)照品適量，精密稱定，置于10 mL棕色量瓶中，加0.5%亞硫酸氫鈉（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至 2.4）溶解并稀釋至刻度 ，制成1 mL含有100 μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備 將鮮刺梨果搗碎，取果肉漿約4 g，精密稱定，置于250 mL的棕色容量瓶中，加入0.5%亞硫酸氫鈉溶液（磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.4）至刻度，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用0.5%亞硫酸氫鈉溶液補(bǔ)足損失的重量，搖勻，取上清液，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液[8]。

2.2.4 空白對(duì)照溶液制備 取0.5%亞硫酸氫鈉溶液作為空白對(duì)照溶液。

2.2.5 專屬性 分別取“2.2.2、2.2.3、2.2.4”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白對(duì)照溶液各10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，分離度符合要求，陰性樣品無干擾，如圖2所示。

采用二級(jí)管陣列檢測(cè)器對(duì)供試品溶液中的維生素C色譜峰進(jìn)行峰光譜掃描和純度檢測(cè)，結(jié)果顯示，峰純度角度<峰純度閾值，供試品中維生素C光譜圖與譜庫中維生素C光譜圖匹配理想，說明維生素C峰為純峰，專屬性符合要求。

2.2.6 線性關(guān)系考察 精密稱取維生素C對(duì)照品適量，置10 mL棕色容量瓶中，加0.5%的亞硫酸氫鈉（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.4）溶液溶解并稀釋到刻度，即得（每1 mL含維生素C 3.303 mg），作為儲(chǔ)備液。分別精密吸取該儲(chǔ)備液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL，置于10 mL的棕色容量瓶中，用0.5%的亞硫酸氫鈉（磷酸調(diào)節(jié)pH為2.4）溶液定容，制成系列濃度對(duì)照品溶液I～Ⅵ（濃度分別為：0.06606 mg·mL-1、0.13212 mg·mL-1、0.19818 mg·mL-1、0.26424 mg·mL-1、0.33030 mg·mL-1、0.39636 mg·mL-1），分別精密吸取系列濃度對(duì)照品溶液I～Ⅵ各10 μL，注入高效液相色譜儀，按“2.2.1”色譜條件測(cè)定各自峰面積。以對(duì)照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得維生素C的線性回歸方程為：Y=32.656X+135.61，R2=0.9998，結(jié)果表明：維生素C進(jìn)樣量在0.6606～3.9636 μg的范圍內(nèi)與峰面積值呈良好的線性關(guān)系。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取維生素C對(duì)照品溶液（每1 mL含維生素C 0.9818 mg）10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰面積，計(jì)算6次維生素C峰面積的RSD值。結(jié)果，維生素C峰面積的RSD值為1.0%（n=6），表明儀器的精密度良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 將鮮刺梨果（批號(hào)：200901）搗碎，混勻，取6份，每份約4 g，精密稱定，按正文供試品溶液制備方法及色譜條件測(cè)定，計(jì)算6份樣品中維生素C峰面積的RSD值。結(jié)果，6次維生素C峰面積的RSD=2.3%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn)”制備的供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h測(cè)定維生素C的峰面積，計(jì)算維生素C峰面積的RSD值。結(jié)果表明，維生素C的RSD 為0.21%，表明維生素C在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.10 耐用性考察 將鮮刺梨果（批號(hào)：200901）搗碎，混勻，取約4 g， 按“2.2.3”供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，采用3種品牌的色譜柱測(cè)定維生素C的含量，色譜柱：PntulipsTM BP-NH2（250 mm×4.6 mm，5 μm），Welch Ultimate Hilic-NH2（250 mm×4.6 mm，5 μm）;菲羅門 ACE Excel NH2（250 mm×4.6 mm，5 μm），結(jié)果顯示，色譜峰分離均良好，含量測(cè)定結(jié)果無顯著差異，RSD=2.6%，表明測(cè)定方法的耐用性較好。

2.2.11 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的鮮刺梨藥材（批號(hào)：200901，含量為5.72 mg·g-1）搗碎，混勻，取9份，每份約0.2 g，精密稱定，置25 mL棕色容量瓶中，按已知含有量的80%、100%、120%水平加入對(duì)照品溶液（每1 mL含維生素C 0.9818 mg），1～3號(hào)樣品每份分別精密加入對(duì)照品溶液0.8 mL;4～6號(hào)樣品每份分別精密加入對(duì)照品溶液1.0 mL;7～9號(hào)樣品每份分別精密加入對(duì)照品溶液1.2 mL;按“2.2.3”供試品溶液制備方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算維生素C回收率，維生素C平均回收率為98.37%，12次測(cè)回收率的RSD=2.0%，表明方法的準(zhǔn)確度較好。結(jié)果見表2。

2.2.12 樣品含量測(cè)定 取鮮刺梨藥材12批，按“2.2.3”供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定維生素C含量，結(jié)果見表3。

根據(jù)測(cè)定結(jié)果，12批鮮刺梨藥材含量范圍為5.16～10.22 mg·g-1，平均值為7.22 mg·g-1，以平均值的80%設(shè)限時(shí)，為5.78 mg·g-1，考慮到各種藥材原料含量的波動(dòng)，故建議將鮮刺梨中維生素C含量限度標(biāo)準(zhǔn)暫定為不得少于5.50 mg·g-1。

3 討論

3.1 薄層色譜法供試品溶液制備 根據(jù)化學(xué)成分的溶解性，分別對(duì)提取溶劑（甲醇、乙醇、水），提取方法（超聲、回流），提取溶劑用量（10 mL、20 mL、30 mL），萃取溶劑（乙醚、乙酸乙酯），萃取劑用量（10 mL、20 mL、30 mL）等條件進(jìn)行考察，結(jié)果表明，以文章中制備方法制備的供試品溶液鑒別斑點(diǎn)最清晰。

3.2 薄層色譜條件考察 根據(jù)展開樣品主要化學(xué)成分的極性，對(duì)展開系統(tǒng)如石油醚（30～60 ℃）-乙酸乙酯-甲醇（5∶6∶1），正己烷-乙酸乙酯-甲醇（5∶4∶1），硅膠板種類（硅膠G板、硅膠H板，硅膠GF254板），樣品點(diǎn)樣量（3 μL、5 μL、7 μL、10 μL），點(diǎn)樣條帶寬度（5 mm、6 mm、7 mm、8 mm），薄層板預(yù)平衡時(shí)間（10 min、20 min、30 min），展開溫度（10 ℃、20 ℃、30 ℃）等進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，使用文章中所用的色譜條件時(shí)，展開效果較好，供試品與對(duì)照品及對(duì)照藥材在不同的檢視條件下色譜條帶數(shù)較多，分離度較好。

3.3 高效液相色譜法供試品溶液制備 分別對(duì)提取溶劑[1.0%草酸溶液、0.001 moL·L-1鹽酸溶液、0.5%亞硫酸氫鈉溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.4）、0.5%醋酸溶液]，提取方法（超聲、回流），提取溶劑用量（150 mL、200 mL、250 mL），提取時(shí)間（10 min、20 min、30 min）等條件進(jìn)行考察，結(jié)果表明，以文章中制備方法制備的供試品溶液峰面積最大。

3.4 高效液相色譜法色譜條件選擇 分別考察采用乙腈-0.01 moL·L-1磷酸氫二鉀（10∶90），甲醇-0.01 moL·L-1磷酸氫二鉀（10∶90），乙腈-0.1%偏磷酸（10∶90）及不同比例的甲醇-0.1%偏磷酸為流動(dòng)相時(shí)的分離情況，結(jié)果表明：以甲醇-0.1%偏磷酸（10∶90）為流動(dòng)相，各色譜峰的分離效果較好。采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)供試品溶液中維生素C在200 nm～450 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果表明，維生素C在波長(zhǎng)為243 nm處的峰純度較高，峰面積最大，由此確定檢測(cè)波長(zhǎng)為243 nm。

綜上，鮮刺梨的薄層色譜鑒別方法專屬性強(qiáng)，陰性樣品無干擾，薄層色譜斑點(diǎn)清晰，分離度較好;維生素C含量測(cè)定方法的專屬性較強(qiáng)，準(zhǔn)確度較高，穩(wěn)定性、耐用性、重現(xiàn)性較好;可以為提高刺梨藥材的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

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（收稿日期：2021-12-22 編輯：黃麗君）

基金項(xiàng)目：貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究課題（編號(hào)：DBXZYC52170）。

作者簡(jiǎn)介：祝清燦（1974-），男，白族，本科，副主任藥師，研究方向?yàn)橹谐伤幑に嚰百|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail：657662046@qq.com

通信作者：孫宜春（1984-），男，漢族，博士，副主任藥師，研究方向?yàn)橹兴幊伤庂|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail：657662046@qq.com