草莓莖尖組織培養(yǎng)技術研究

蒲忠貴 張慶全

摘要：為建立完善的草莓組培快繁體系，解決種苗退化問題，以當?shù)夭葺髟云贩N紅顏莖尖為試材，設置0.1%升汞和0.1%升汞+2%吐溫-80溶液2種外植體消毒處理，以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）和萘乙酸（NAA）的6個誘導和繼代增殖培養(yǎng)基、5個生根培養(yǎng)基，研究草莓莖尖外植體消毒最佳方式與時間， 篩選誘導、繼代增殖及生根培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基。結(jié)果表明，0.1%升汞+2%吐溫-80溶液處理8 min時草莓莖尖污染率及褐化率較低，萌發(fā)率最高，可達82.3%，為最佳的消毒方式。外植體在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA培養(yǎng)基中，可誘導出更多的健壯不定芽，萌發(fā)率為83.3%，為最佳誘導培養(yǎng)基;適宜的繼代增殖培養(yǎng)基為 MS+1.0 mg/L 6-BA +0.02 mg/LNAA，增殖系數(shù)為4.5%;1/2MS+0.01 mg/L NAA為最佳生根培養(yǎng)基，生根率高達100%。

關鍵詞：草莓;莖尖;快繁;組織培養(yǎng)

中圖分類號：S668.4? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A? ? ? ? ? ? 文章編號：1001-1463（2022）09-0086-04

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2022.09.020

Study on the Tip-shoot Tissue Culture Techniques for Strawberry

PU Zhonggui， ZHANG Qingquan

（Agriculture and Rural Bureau at Yongjing County， Yongjing Gansu 731600， China）

Abstract： In order to improve the strawberry tissue culture and rapid propagation system and to address the quality degradation issue in seedlings， taking tip-shoots of a main strawberry variety Hongyan as material， two explant disinfection methods were used i.e.， 0.1% HgCl2 solution and 0.1% HgCl2 plus 2% Tween-80 solution， 6 induction media and multiplicative culture media and 5 rooting culture media based on MS culture base plus different concentrations of 6-BA and NAA were formulated to study the optimum explant disinfection method and time， and to select the optimum culture media for induction， multiplicative culture and rooting culture for tip-shoot tissue culture of strawberry， respectively. Results showed that 0.1% HgCl2 plus 2% Tween-80 solution treated for 8 min had the lowest pollution rate and browning rate of tip-shoot tissue， and the highest germination rate of 82.3%， which was considered as the optimum explant disinfection method. The optimum induction medium was MS plus 1.0 mg/L 6-BA plus 0.2 mg/L NAA which could induce more health adventitious buds with a germination rate of 83.3%. The optimum medium for multiplicative culture was MS plus 1 mg/L 6-BA plus 0.02 mg/L NAA which had a multiplication coefficient of 4.5%. The optimal medium for rooting was 1/2MS plus 0.01 mg/L NAA which showed a rooting rate of 100%.

Key words： Strawberry; Tip-shoot; Rapid propagation; Tissue culture

草莓為薔薇科草莓屬多年生草本植物，漿果色澤艷麗，鮮美可口，營養(yǎng)豐富，深受人們喜? ? 愛[1 - 3 ]。草莓在全國各地均有種植。近年來，永靖縣把發(fā)展草莓產(chǎn)業(yè)作為鄉(xiāng)村振興的重要抓手積極推進， “劉家峽草莓”已享譽蘭州、西寧、臨夏等周邊城市。目前，全縣種植面積達到220 hm2，全部以日光溫室和鋼架、竹架大棚的形式保護地種植，主栽品種以紅顏和妙香系列為主，分布在三塬、峴塬、劉家峽、太極等川塬鄉(xiāng)鎮(zhèn)。采摘期從每年元月份開始，長達7個月，平均產(chǎn)量達37 500 kg/hm2。主要銷往蘭州、西寧、臨夏等周邊城市以及以電商物流的形式銷往全國各地，電商率達到40%。但近年來，草莓種植戶為追求經(jīng)濟效益，盲目擴大種植面積，同時由于種植草莓周期長，種苗以匍匐莖繁殖和分株繁殖等無性繁殖方式為主，造成種苗種性退化快、花葉病等病毒病感染率高，導致果實畸形，果個不大，產(chǎn)量和質(zhì)量下降。從北京、山東、遼寧等種苗繁育基地引進的草莓脫毒種苗，由于地域差異或者脫毒苗本身問題，草莓產(chǎn)量很不穩(wěn)定，種植戶對優(yōu)質(zhì)草莓種苗的渴求愈發(fā)強烈。我們以紅顏草莓匍匐莖莖尖作為外植體，研究了草莓莖尖培養(yǎng)技術，以期為完善草莓莖尖組培快繁技術體系奠定基礎。

1? ?材料與方法

1.1? ?外植體制備

供試草莓品種為紅顏，大田生產(chǎn)種苗，于5 — 6月份采集種植于永靖縣三塬鎮(zhèn)兩合村鋼架大棚內(nèi)的草莓匍匐莖尖作為外植體。

1.2? ?外植體消毒

表面消毒劑選用0.1%升汞和0.1%升汞+2%吐溫-80溶液。消毒劑消毒時間設4、6、8、10、12 min共5個水平10個處理（表1），消毒后接種于MS培養(yǎng)基上，篩選出最佳消毒方法。

從健壯的紅顏草莓母株上，選取飽滿稚嫩的匍匐莖2～4 cm長的頂芽，用紗布包好，流水沖洗1～2 h后瀝干，在超凈工作臺中用75%酒精消毒30 s，迅速用無菌水沖洗4～5次，隨即用0.1%升汞+2%吐溫-80溶液處理8 min，再用無菌水沖洗4～6次。

1.3? ?芽誘導培養(yǎng)

消毒后的外植體用濾紙吸干水分，在雙目解剖鏡下剝?nèi)ビ兹~露出莖尖生長點，用解剖針挑去小于0.5 mm的莖尖生長點，立即接入誘導分化培養(yǎng)基（表2）中，每瓶接5個，10瓶為1個處理，重復3次。用封口膜綁扎好后放置在培養(yǎng)架上。觀察統(tǒng)計萌發(fā)芽數(shù)和生長狀況，篩選出最佳芽誘導培養(yǎng)基。

1.4? ?繼代增殖培養(yǎng)

將萌發(fā)的草莓莖尖轉(zhuǎn)接到繼代增殖培養(yǎng)基（表3）中，每瓶接種5個叢生芽，各接種10瓶。觀察統(tǒng)計增殖芽數(shù)、增殖系數(shù)和芽生長狀況，篩選出適宜的繼代增殖培養(yǎng)基。

1.5? ? 生根培養(yǎng)

待繼代培養(yǎng)結(jié)束后，立即轉(zhuǎn)入到生根培養(yǎng)基（表4）中，每瓶接種5株健壯幼苗，各接10瓶。觀察統(tǒng)計試管苗生長狀況、平均根長、平均根數(shù)、平均生根株數(shù)，篩選出最佳生根培養(yǎng)基。

1.6? ?培養(yǎng)方法與條件

培養(yǎng)溫度為22～26 ℃，光照時間14 h/d，光照強度1 600～2 000 lx。培養(yǎng)基MS、1/2MS、1/4MS均添加蔗糖3%，瓊脂6.5 g/L，pH 5.8。

1.7? ?統(tǒng)計方法

接種10 d后統(tǒng)計污染率、褐化率。接種20 d后統(tǒng)計萌發(fā)率。接種30 d后統(tǒng)計增殖芽數(shù)，計算增殖系數(shù)和生根率。

增殖系數(shù)=（增值芽數(shù)/原個體數(shù)）×100%

1.8? ?數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel 2003和SAS 9.1統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ? 不同消毒劑和處理時間對莖尖外植體消毒效果的影響

經(jīng)消毒處理的外植體接種7～10 d后，外植體周圍出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，但15 d后褐化逐漸減輕。從表1可知，0.1%升汞附加2%吐溫-80溶液的處理消毒效果較好，消毒4、6、8、10 min的污染率和褐化率均比0.1%升汞單一處理低，莖尖萌發(fā)率均高于0.1%升汞單一處理?？赡芴砑油聹?80溶液作為水包油型乳化劑在降低褐化方面具有特殊機理[4 ]。從表1還看出，0.1%升汞+2%吐溫-80處理隨著消毒時間從4、6、8、10、12 min延長，污染率也從58.3%、43.4%、25.3%、21.9%逐漸降低為20.4%，當消毒時間為8 min時，莖尖萌發(fā)率最高，達82.3%。已萌發(fā)的莖尖在后期培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，處理時間越短，莖尖長勢越迅速，同時褐化率較低，莖尖生長也較快。因此，0.1%升汞+2%吐溫-80處理8 min為草莓匍匐莖莖尖脫毒最佳的消毒方式。

2.2? ? 不同誘導培養(yǎng)基上外植體的誘導效果

從表2可以看出，草莓莖尖在MS+1.0 mg/L 6-BA +0.2 mg/LNAA培養(yǎng)基上誘導效果較好，萌發(fā)率為83.3%，為最佳誘導培養(yǎng)基。從不同濃度的6-BA來看，高濃度的6-BA會影響莖尖的正常分化與生長，同時NAA濃度也影響到莖尖萌發(fā)率。當6-BA濃度為1.0 mg/L，NAA濃度為0.1、0.2 mg/L時的生長狀況均較好，幼苗健壯，萌發(fā)芽數(shù)和萌發(fā)率均較高。說明6-BA對草莓組培苗影響較大，外植體分化培養(yǎng)基中6-BA的最適濃度為1.0 mg/L。同時，NAA的濃度也影響到莖尖的萌發(fā)率，其濃度為0.1 mg/L 萌發(fā)率遠低于0.2 mg/L，說明適當提高NAA含量有助于促進草莓莖尖的誘導。

2.3? ?草莓幼苗不定芽的繼代增殖培養(yǎng)效果

從表3可以看出，隨著6-BA濃度的不斷增加，草莓增殖系數(shù)呈先增后減趨勢，當6-BA濃度為1.0 mg/L、NAA的濃度為0.02 mg/L時，增殖系數(shù)達到最高，為4.5%，且增殖出的小苗長勢健壯、葉片深綠;當6-BA濃度繼續(xù)升高時，增殖系數(shù)反而有所下降，說明適于草莓幼苗不定芽增殖的6-BA最佳濃度為1.0 mg/L。因此，適宜的繼代增殖培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA +0.02 mg/L NAA。

2.4? ?不同生根培養(yǎng)基上草莓組培苗的生根情況

由表4可知，草莓組培苗在5種生根培養(yǎng)基中均能生根，但不同的培養(yǎng)基中平均根數(shù)、根長及長勢均有很大差異。以1/2MS+0.01 mg/L NAA為最佳生根培養(yǎng)基，根數(shù)多，根系粗壯，利于后期移栽，生根率達100%。對不添加激素的培養(yǎng)基而言，1/4MS中的草莓植株根系纖長，長勢較弱;1/2MS中的植株根系多且長，生長健壯。表明植株對NAA濃度變化比較敏感，稍高濃度則誘導植株基部形成愈傷組織，根系雖分化較多，但生長受到抑制。

3? ?討論與結(jié)論

表面消毒劑的種類，外植體消毒時間及外植體發(fā)育時期是建立草莓莖尖快繁技術體系的關鍵步驟[4 - 5 ]。草莓匍匐莖莖尖表面長有大量絨毛，致使消毒劑通過吸附進入外植體分生組織，而吐溫-80具有潤展劑的作用，可使外植體表面絨毛與升汞更好的接觸、附著及吸入[6 - 8 ]，可提高外植體消毒效果。

試驗結(jié)果表明，用0.1%升汞+2%吐溫-80溶液處理8 min時草莓莖尖污染及褐化水平較低，成苗率最高，可達82.3%。外植體在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA的誘導培養(yǎng)基中，可以誘導出更多的健壯，萌發(fā)率為83.3%，為最佳誘導培養(yǎng)基;適宜的繼代增殖培養(yǎng)基為 MS+1.0 mg/L 6-BA + 0.02 mg/L NAA，增殖系數(shù)為4.5%;1/2MS+0.01 mg/L NAA為最佳生根培養(yǎng)基，生根率達100%。因此，紅顏草莓匍匐莖外植體消毒時采用0.1%升汞+2%吐溫-80處理8 min效果為好。

外源激素的濃度和比例能影響培養(yǎng)物的基因表達，進而影響器官的分化，通過內(nèi)源激素的平衡調(diào)節(jié)來達到控制器官發(fā)生的目的[8 ]。在進行草莓誘導分化、繼代增殖培養(yǎng)時，激素種類、濃度和配比對萌發(fā)率和增殖系數(shù)表現(xiàn)得尤為明顯。在增殖培養(yǎng)前期，使用較高濃度的6-BA能夠短期增加基數(shù)、縮短繼代周期。而在增殖后期，則較低濃度的6-BA能夠分化出較多生長良好的幼苗，便于后期生根，可提高育苗生產(chǎn)效率。

參考文獻：

[1] 楊馥霞，湯? ?玲，賀? ?歡，等.? 低溫下7個草莓品種的抗性生理指標比較[J].? 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2021，52（4）：14-17.

[2] 李玉亮，胡軾林，潘旭升，等.? 蘭州新區(qū)日光溫室綠色食品草莓生產(chǎn)技術規(guī)程[J].? 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2020（5）：91-94.

[3] 楊馥霞，湯? ?玲，賀? ?歡，等.? 取樣部位對6 個草莓品種低溫半致死溫度的影響[J].? 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2019（12）：31-34.

[4] 周厚成，何水濤.? 草莓病毒病研究進展[J]. 果樹學報，2003（5）：421-426.

[5] 肖君澤，黃益鴻，姜放軍.? 草莓病毒病及其脫毒與檢測技術研究進展[J].? 江西農(nóng)業(yè)學報，2010，22（8）：88-90.

[6] 陳振光.? 園藝植物離體培養(yǎng)學[M].? 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社： 1996.

[7] 王振磊，閆芬芬，王? ?靜.? ?草莓組培快繁技術研究[J].? 北方園藝， 2012（11）：130-132.

[8] 崔廣榮，劉云兵，郭蕾娜.? 草莓增殖和生根壯苗培養(yǎng)基的篩選[J].? 園藝園林科學，2003，19（6）：210-212.