佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠外周血單個核細(xì)胞中hsa-miRNAs的表達(dá)及新風(fēng)膠囊干預(yù)研究

文建庭 劉健 姜輝 孫艷秋 王馨 王杰 周琴 丁香 陳曉露 張先恒

【摘 要】目的：探究佐劑性關(guān)節(jié)炎（AA）大鼠外周血單個核細(xì)胞（PBMCs）中人微小RNAs（hsa-miRNAs）的表達(dá)及新風(fēng)膠囊（XFC）干預(yù)研究。方法：建立AA大鼠模型，造模后第12天開始給藥，將大鼠隨機(jī)分為正常組（NC組）、模型組（MC組）、XFC低劑量組（L-XFC組）、XFC中劑量組（M-XFC組）、XFC高劑量組（H-XFC組）。給藥30 d后，觀察各組大鼠體質(zhì)量、足跖腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）的變化；RT-qPCR法檢測PBMCs中miRNAs的表達(dá)；ELISA法檢測血清中C反應(yīng)蛋白（CRP）、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（抗CCP抗體）、類風(fēng)濕因子（RF）、白細(xì)胞介素（IL）-11、IL-17、IL-4、IL-10的表達(dá)。結(jié)果：①致炎前，各組大鼠體質(zhì)量、足跖腫脹度及AI比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）；致炎12 d，各組大鼠足跖腫脹度和AI均顯著升高（P < 0.01）；XFC給藥后，各組大鼠體質(zhì)量、足跖腫脹度、AI得到顯著改善。②與NC組相比，MC組hsa-miR-146a-3p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-597-3p mRNA表達(dá)顯著降低（P < 0.01），CRP、RF、抗CCP抗體、IL-17、hsa-miR-3184-5p mRNA表達(dá)顯著升高（P < 0.01）；XFC治療后，上述指標(biāo)得到顯著改善。③Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，hsa-miR-146a-3p與足跖腫脹度、CRP、RF、IL-11呈顯著負(fù)相關(guān)，與IL-4呈顯著正相關(guān)（P < 0.05）；hsa-miR-31-5p與AI、RF、IL-17呈負(fù)相關(guān)，與IL-10呈正相關(guān)（P < 0.05）；hsa-miR-29c-3p與RF、IL-11呈負(fù)相關(guān)（P < 0.05）；hsa-miR-3184-5p與IL-4呈負(fù)相關(guān)（P < 0.05）。結(jié)論：AA大鼠PBMCs中存在差異表達(dá)的hsa-miRNAs，與免疫炎癥指標(biāo)具有顯著相關(guān)性，XFC在改善免疫炎癥指標(biāo)的同時，也能改善miRNAs，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

【關(guān)鍵詞】 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；佐劑性關(guān)節(jié)炎；微小RNAs；新風(fēng)膠囊；干預(yù)研究；大鼠

Expression of hsa-miRNAs in Peripheral Blood Mononuclear Cells of Adjuvant Arthritis Rats and Intervention of Xinfeng Capsule（新風(fēng)膠囊）

WEN Jian-ting，LIU Jian，JIANG Hui，SUN Yan-qiu，WANG Xin，WANG Jie，ZHOU Qin，DING Xiang，CHEN Xiao-lu，ZHANG Xian-heng

【ABSTRACT】Objective：To investigate the expression of hsa-miRNAs in peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）of adjuvant arthritis（AA）rats and the intervention of Xinfeng Capsule（新風(fēng)膠囊，XFC）.Methods：The AA rat model was established，and the drug was administered?on the 12 th day after the model was established.

The rats were randomly divided into a normal group（NC group），a model group（MC group），a low-dose XFC group（L-XFC group），a medium-dose XFC group（M-XFC group），and a high-dose XFC group（H-XFC group）.After 30 days of administration，the changes of body mass，footpad swelling，and arthritis index（AI）of the rats in each group were observed.The expression of miRNAs in PBMCs was detected by RT-qPCR.The expressions of CRP，anti CCP antibody，RF，interleukin IL-11，IL-17，IL-4 and IL-10 in serum were detected by ELISA.Results：①There was no significant difference（P > 0.05）in body mass，footpad swelling and AI of rats in each group before inflammation;twelve days after inflammation，the degree of footpad swelling and AI of rats in each group increased significantly（P < 0.01）;After administration of XFC，body mass，footpad swelling and AI were significantly improved.②Compared with the NC group，the expressions of hsa-miR-146a-3p，hsa-miR-31-5p，hsa-miR-29c-3p，and hsa-miR-597-3p mRNA in the MC group decreased significantly（P < 0.01），while the expressions of CRP，RF，anti CCP antibody，IL-17，hsa-miR-3184-5p mRNA in the MC group increased significantly（P < 0.01）;After treatment with XFC，the above indicators were significantly improved.③Spearman correlation analysis showed that hsa-miR-146a-3p was significantly negatively correlated with footpad swelling，CRP，RF and IL-11，and significantly positively correlated with IL-4（P < 0.05）;hsa-miR-31-5p was negatively correlated with AI，RF，IL-17，and positively correlated with IL-10（P < 0.05）;hsa-miR-29c-3p was negatively correlated with RF and IL-11（P < 0.05）;and there was a negative correlation between hsa-miR-3184-5p and IL-4（P < 0.05）.Conclusion：There are hsa-miRNAs differentially expressed in PBMCs of AA rats，which are significantly correlated with immune inflammatory indicators.XFC can improve both immune inflammatory indicators and miRNAs，and its mechanism needs further study.

【Keywords】 rheumatoid arthritis;adjuvant arthritis;micro RNAs;Xinfeng Capsule（新風(fēng)膠囊）;intervention study;rats

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以骨和關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行性破壞為特征的慢性炎癥性疾病，發(fā)病率高、致殘率高，以滑膜炎和血管炎為主要病理表現(xiàn)［1-2］。微小RNAs（miRNAs）是一類單鏈內(nèi)源性非編碼小RNAs，長度約為21～

25個核苷酸，通過發(fā)揮調(diào)控基因表達(dá)、細(xì)胞生長、分化及凋亡等在RA中發(fā)揮重要作用［3-4］。目前研究發(fā)現(xiàn)，RA患者血清、外周血單個核細(xì)胞（PBMCs）、滑膜細(xì)胞等均有差異表達(dá)的miRNAs［5］。miRNAs的多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)作用機(jī)制提示其可能在RA復(fù)雜病機(jī)中起關(guān)鍵作用。已有多種異常表達(dá)的miRNAs如miR-155、miR-125a等通過影響下游靶基因參與RA炎癥免疫反應(yīng)、凋亡逃逸及氧化應(yīng)激等發(fā)病機(jī)制［6-7］。RA屬中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇，脾虛濕盛是其重要病機(jī)，中藥復(fù)方新風(fēng)膠囊（XFC，專利號ZL201310011369.8）在新安醫(yī)學(xué)理論指導(dǎo)下創(chuàng)制，具有健脾化濕通絡(luò)作用，應(yīng)用于臨床20余年，療效顯著［8-9］。

本團(tuán)隊前期通過高通量測序得到RA患者PBMCs中差異表達(dá)的miRNAs［10-11］，為比較不同種屬差異miRNAs表達(dá)的一致性，探尋RA相關(guān)的特征性miRNAs，進(jìn)行病毒載體介導(dǎo)的動物體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗及XFC的作用機(jī)制。本研究通過復(fù)制佐劑性關(guān)節(jié)炎（AA）大鼠模型，觀察AA大鼠PBMCs中人微小RNAs（hsa-miRNAs）的表達(dá)及XFC的干預(yù)作用。

1 實(shí)驗材料

1.1 實(shí)驗動物 雄性清潔級SD大鼠50只，體質(zhì)量（180±20）g；購自安徽省實(shí)驗動物中心，動物使用許可證號SYXK（皖）2005-02，安徽中醫(yī)藥大學(xué)標(biāo)準(zhǔn)清潔級實(shí)驗動物房喂養(yǎng)，保持室內(nèi)環(huán)境安靜，溫度18～22 ℃，相對濕度50%～75%，保持通風(fēng)排氣每小時10～20次。

1.2 藥品及試劑 XFC每粒含生藥0.4 g，購自安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心，皖藥制字Z20050062。弗氏完全佐劑購自Sigma公司；戊巴比妥購自上海雅吉生物科技有限公司；C反應(yīng)蛋白（CRP）（SU-B30078）、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（抗CCP抗體）（SU-B37304）、類風(fēng)濕因子（RF）（SU-B30575）、白細(xì)胞介素（IL）-11（SU-B30195）、IL-17（SU-B30201）、IL-4（SU-B30217）、IL-10（SU-B30194）均購自泉州市睿信生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo Scientific公司；引物由Sangon Biotech合成。

1.3 儀器設(shè)備 足跖腫脹測量儀（YLS-7B，上北京吉安得爾科技有限公司）；動物體重天平（上海玉研科學(xué)儀器有限公司）；普通PCR儀（PTC-200，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品上海有限公司）；高速臺式冷凍離心機(jī)（LX 300，海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；熒光定量PCR儀（StepOne Plus，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；酶標(biāo)分析儀（RT-6100，雷杜公司）。

2 方 法

2.1 造模及給藥 50只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組（NC組）10只，AA組40只。

AA組大鼠左后足跖皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑（FCA）0.1 mL，使其致炎復(fù)制成AA實(shí)驗動物模型［12］；造模成功后，第13天將AA組大鼠隨機(jī)分為4組：模型組（MC組）、XFC低劑量組（L-XFC組）、XFC中劑量組（M-XFC組）、XFC高劑量組（H-XFC組）。第13天開始給藥，按照各種實(shí)驗動物間單位體表面積用藥量相等的原則進(jìn)行藥物換算［13］，NC組和MC組：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的氯化鈉（NaCl），1 mL·（100 g）-1。L-XFC組：將XFC去除膠囊殼，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的NaCl配成混懸液（每毫升含藥量0.017 g，即0.17 g·kg-1），1 mL·（100 g）-1灌胃。M-XFC組：將XFC去除膠囊殼，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的NaCl配成混懸液（每毫升含藥量0.034 g，即0.34 g·kg-1），1 mL·（100 g）-1灌胃。H-XFC組：將XFC去除膠囊殼，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的NaCl配成混懸液（每毫升含藥量0.068 g，即0.68 g·kg-1），1 mL·（100 g）-1灌胃。

2.2 觀察指標(biāo)

2.2.1 體質(zhì)量、足跖腫脹度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）測算 分別在大鼠造模前1 d、致炎12 d、給藥后30 d使用電子天平稱量大鼠的體質(zhì)量，根據(jù)大鼠后足跖容積計算足跖腫脹度。分別于造模前1 d和給藥后30 d觀察和記錄全身關(guān)節(jié)病變程度。大鼠全身關(guān)節(jié)病變按5級評分法評價，根據(jù)未注射FCA的另外3只肢體關(guān)節(jié)病變程度進(jìn)行累計積分，計算AI：0分，無紅腫；1分，小趾關(guān)節(jié)紅腫；2分，趾關(guān)節(jié)和足跖腫脹；3分，踝關(guān)節(jié)以下足爪腫脹。AI為各個關(guān)節(jié)積分的累計積分，最高為12分。

2.2.2 RT-qPCR檢測PBMCs中miRNAs的表達(dá) 2％戊巴比妥鈉［0.3 mL·（100 g）-1］腹腔注射麻醉，腹主動脈采血，提取PBMCs，TRIzol提取PBMCs中的總RNA，總RNA按照Thermo反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書提供方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s，然后進(jìn)行40個循環(huán)反應(yīng)，每個循環(huán)包括95 ℃變性15 s和60 ℃變性30 s。

Bio-Rad凝膠圖像分析儀拍照，Image-Pro Plus軟件分析，計算電泳條帶吸光度值，以U6作為內(nèi)參，計算mRNA的相對表達(dá)量。引物序列見表1。

2.2.3 ELISA法檢測CRP、RF、抗CCP抗體及細(xì)胞因子的表達(dá) 收集各組大鼠血液，置于離心機(jī)以3000 r·min-1離心15 min，離心半徑10 cm，分離并保存血清，采用ELISA法測定大鼠血清CRP、RF、抗CCP抗體、IL-11、IL-17、IL-4和IL-10的表達(dá)量。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，采用正態(tài)性檢驗，單因素方差分析用于多組間比較，相關(guān)性分析采用Spearman分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 各組大鼠體質(zhì)量、足跖腫脹度和AI的變化及XFC對其影響 致炎前各組大鼠體質(zhì)量、足跖腫脹度及AI比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。致炎12 d，與NC組比較，各組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），足跖腫脹度和AI均顯著升高（P < 0.01）。給藥30 d，與NC組比較，MC組大鼠體質(zhì)量顯著降低，足跖腫脹度和AI顯著升高（P < 0.01）；與MC組比較，M-XFC組大鼠體質(zhì)量升高（P < 0.05），其余各組足跖腫脹度和AI顯著降低（P < 0.01）。見表2。

3.2 各組大鼠hsa-miRNAs的表達(dá)情況 與NC組比較，MC組hsa-miR-146a-3p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-597-3p mRNA表達(dá)顯著降低（P < 0.01），hsa-miR-3184-5p mRNA表達(dá)顯著升高（P < 0.01）；與MC組比較，其余各組hsa-miR-146a-3p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-597-3p mRNA表達(dá)顯著升高（P < 0.05或P < 0.01），hsa-miR-3184-5p mRNA表達(dá)顯著降低（P < 0.05或P < 0.01）。見表3。

3.3 各組大鼠CRP、RF、抗CCP抗體和細(xì)胞因子表達(dá)情況 與NC組比較，MC組CRP、RF、抗CCP抗體、IL-17表達(dá)顯著升高（P < 0.01），IL-4、IL-10、IL-11表達(dá)顯著降低（P < 0.01）；與MC組比較，各組CRP、RF和抗CCP抗體的表達(dá)顯著降低（P < 0.01或P < 0.05），M-XFC組和H-XFC組IL-17表達(dá)降低，IL-4、IL-10、IL-11表達(dá)顯著升高（P < 0.05或P < 0.01）。見表4。

3.4 AA大鼠miRNAs與足趾腫脹度、AI、CRP、RF、抗CCP抗體和細(xì)胞因子的相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，hsa-miR-146a-3p與足跖腫脹度、CRP、RF、IL-11呈顯著負(fù)相關(guān)，與IL-4呈顯著正相關(guān)（P < 0.05或P < 0.01）；hsa-miR-31-5p與AI、RF、IL-17呈負(fù)相關(guān)，與IL-10呈顯著正相關(guān)（P < 0.05或P < 0.01）；hsa-miR-29c-3p與RF、IL-11呈顯著負(fù)相關(guān)（P < 0.05或P < 0.01）；hsa-miR-3184-5p與IL-4呈顯著負(fù)相關(guān)（P < 0.05）。見表5。

4 討 論

miRNAs具有多種功能，可以通過調(diào)控靶基因參與RA的發(fā)病，包括滑膜增殖、炎癥反應(yīng)、血管翳形成、骨流失及骨破壞等病理反應(yīng)［14］。ZHOU等［15］發(fā)現(xiàn)，miR-27b直接抑制HIPK2表達(dá)，介導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡，改善RA的發(fā)展。WEI等［16］研究表明，miR-101-3p通過下調(diào)PTGS2來減輕AA大鼠的足跖關(guān)節(jié)和RF。因此，發(fā)現(xiàn)RA的特征性miRNAs，系統(tǒng)研究其在RA發(fā)病機(jī)制中的多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)作用具有重要意義。本研究通過復(fù)制AA大鼠模型，觀察發(fā)現(xiàn)給予FCA致炎后，大鼠足跖出現(xiàn)紅腫、局部焮熱癥狀，致炎12 d，與NC組比較，各組大鼠足跖腫脹度和AI均顯著升高，說明模型復(fù)制成功。RT-qPCR結(jié)果顯示，與NC組比較，MC組hsa-miR-146a-3p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-597-3p mRNA表達(dá)顯著降低，hsa-miR-3184-5p mRNA表達(dá)顯著升高，說明hsa-miRNAs在RA患者和AA大鼠體內(nèi)具有同源性表達(dá)。另外，運(yùn)用ELISA法檢測大鼠血清中免疫炎癥指標(biāo)的表達(dá)，結(jié)果顯示，與NC組比較，MC組CRP、RF、抗CCP抗體、IL-17表達(dá)顯著升高，IL-4、IL-10、IL-11表達(dá)顯著降低。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，大鼠體內(nèi)差異表達(dá)的miRNAs與免疫炎癥指標(biāo)具有顯著相關(guān)性。有研究表明，miR-16、miR-17等6種miRNAs在RA患者血漿、PBMC及關(guān)節(jié)液中有顯著變化，且與RA疾病活動性指標(biāo)ESR、CRP、RF等密切相關(guān)［17］。與本研究結(jié)果類似，均表明miRNAs表達(dá)水平可作為RA疾病活動的有效檢測指標(biāo)，可協(xié)助RA臨床診斷。

RA屬中醫(yī)學(xué)“痹病”范疇，中醫(yī)藥治療RA歷史悠久，療效顯著，既可抗炎止痛、緩解癥狀以治標(biāo)，又可改善微循環(huán)、調(diào)節(jié)免疫以固本，達(dá)到標(biāo)本兼治的目的。中藥復(fù)方XFC由黃芪、薏苡仁、雷公藤、蜈蚣組成，不僅能改善AA大鼠關(guān)節(jié)癥狀［18-19］，還可以通過調(diào)控蛋白激酶C（PKC）/核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）通路，改善AA大鼠肺功能，通過Toll樣受體4/絲裂原活化蛋白激酶通路改善AA大鼠心功能［20-21］。前期研究還表明，XFC通過調(diào)節(jié)miR-155的表達(dá)，抑制NF-κB信號通路活化，改善RA凝血指標(biāo)，從而改善RA血瘀狀態(tài)和患者肺功能［22］。本研究結(jié)果表明，經(jīng)不同劑量XFC治療后，AA大鼠足跖腫脹度和AI顯著降低，關(guān)節(jié)紅腫癥狀明顯改善，miRNAs及免疫炎癥指標(biāo)等也顯著改善，但其機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

綜上所述，hsa-miR-146a-3p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-597-3p、hsa-miR-3184-5p在AA大鼠中均具有差異表達(dá)，說明這些miRNAs在RA患者和AA大鼠中表達(dá)具有同源性，可進(jìn)一步進(jìn)行病毒載體介導(dǎo)的動物體內(nèi)miRNAs轉(zhuǎn)染實(shí)驗，研究miRNAs在RA中的調(diào)控特點(diǎn)，將有利于揭示RA復(fù)雜發(fā)病機(jī)制，確立RA的關(guān)鍵靶點(diǎn)，為RA臨床診斷與治療提供參考。

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收稿日期：2022-05-15；修回日期：2022-06-17

基金項目：國家自然科學(xué)基金面上項目（81973655，82074373）；

科技部國家重點(diǎn)研發(fā)計劃中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究重點(diǎn)專項（2018YFC1705204）；安徽省高校協(xié)同創(chuàng)新項目（GXXT-2020-025）；安徽省重點(diǎn)研究和開發(fā)計劃對外科技合作項目（201904b11020011）；安徽省名中醫(yī)劉健工作室建設(shè)項目（中醫(yī)藥發(fā)展秘〔2018〕11號）；安徽省重點(diǎn)研究與開發(fā)計劃項目（201904a07020004）；安徽現(xiàn)代中醫(yī)內(nèi)科應(yīng)用基礎(chǔ)與開發(fā)研究省級實(shí)驗室專項（2016080503B041）；安徽省第12批“115”創(chuàng)新團(tuán)隊項目（皖人才辦〔2019〕1號）；新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室開放基金項目（2020xayx10）

作者單位：1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031

通信作者：劉健 安徽省合肥市蜀山區(qū)梅山路117號，liujianahzy@126.com