具有臨床降血壓功效的乳源三肽的研究進(jìn)展

周會(huì)欽，肖軍霞，榮慶軍，譚海剛，孫 杰，黃國(guó)清,*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109；2.青島波尼亞食品有限公司，山東 青島 266109；3.山東省花生研究所，山東 青島 266109）

高血壓是人類常見的慢性疾病，是以體循環(huán)動(dòng)脈血壓增高為主要特征，可伴有心、腦、腎等臟器功能或器質(zhì)性損傷的綜合征。高血壓也是心血管疾病、腎衰竭和中風(fēng)的主要危險(xiǎn)因素，常與其他代謝性疾病如肥胖、糖尿病和動(dòng)脈粥樣硬化等同時(shí)發(fā)生。近年來(lái)，隨著人們生活水平的不斷提高以及飲食結(jié)構(gòu)和生活習(xí)慣的改變，我國(guó)的高血壓發(fā)病率有所升高，且呈現(xiàn)低齡化趨勢(shì)。因此，對(duì)高血壓預(yù)防與治療方法進(jìn)行研究對(duì)于提高人們的健康水平、減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)具有重要意義[1]。

藥物是治療高血壓的主要方法，目前常用的高血壓治療藥物及方法包括β受體阻滯劑、利尿劑、鈣離子拮抗劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）抑制劑、腎素抑制劑、血管緊張素II受體阻滯劑、多巴胺I型受體激動(dòng)劑及基因治療等[2]，其中ACE抑制劑類藥物能夠阻止血管緊張素I轉(zhuǎn)換為血管緊張素II，且對(duì)激肽酶活性有抑制作用，因此在臨床中被廣泛用于高血壓的治療。當(dāng)前市場(chǎng)上銷售的ACE抑制劑類藥物如卡托普利、依那普利和賴諾普利都是人工合成類藥物，雖然它們具有較好的降血壓效果，但是會(huì)引起如咳嗽、味覺(jué)喪失和腎功能損害等多種副作用[3-4]。因此，尋找這些化學(xué)合成藥物的天然替代品對(duì)于高血壓的治療具有重要意義。

Ferreira等于1970年首次從腹蛇（Bothrops jararca）的毒液中提取得到了具有ACE抑制作用的活性多肽[5]，從此，降血壓肽（ACE inhibitory peptides，ACEIPs）開始引起了全球?qū)W者的廣泛關(guān)注。大量研究表明，來(lái)源于動(dòng)物、植物、微生物和昆蟲的天然ACEIPs具有很好的ACE抑制活性，且對(duì)人體無(wú)毒副作用，因此在高血壓的預(yù)防與治療中具有廣闊的應(yīng)用前景[6]。目前已有大量文獻(xiàn)對(duì)ACEIPs的來(lái)源[7-12]、結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系[13]、生物利用度[14]、作用模式[15]、在功能食品開發(fā)中的應(yīng)用[16]等進(jìn)行了綜述?，F(xiàn)有的關(guān)于ACEIPs的研究多基于其體外ACE抑制活性或在原發(fā)性高血壓大鼠（spontaneous hypertensive rats，SHR）的體內(nèi)降血壓活性，然而，目前尚未建立起這些體外或體內(nèi)活性與在人體內(nèi)實(shí)際降血壓功效之間的關(guān)系[17]。因此，雖然已有大量ACEIPs被分離和鑒定出來(lái)，但是經(jīng)過(guò)臨床研究證實(shí)對(duì)人體具有體內(nèi)降血壓功效且已在降血壓功能食品開發(fā)中獲得實(shí)際應(yīng)用的僅有極少數(shù)幾種[16]，其中最受關(guān)注的是Ile-Pro-Pro（IPP）、Val-Pro-Pro（VPP）和Leu-Pro-Pro（LPP）3種三肽。

目前這3種三肽主要來(lái)源于牛奶中的酪蛋白，其中IPP位于β-酪蛋白的74～76位和κ-酪蛋白的84～86位，VPP位于β-酪蛋白的108～110位，LPP位于β-酪蛋白的151～153位[18]，因此這3種三肽又合稱為乳源三肽（以下簡(jiǎn)稱乳三肽）。大量臨床研究及Meta分析表明，乳三肽可以有效降低高血壓患者的血壓[19-22]，對(duì)正常血壓沒(méi)有影響[23]，且可增加中老年人群的腦血流速度[24]，是非常理想的降血壓活性組件，可作為合成ACE抑制劑類藥物的補(bǔ)充或替代品。目前國(guó)外已有多種基于乳三肽的降血壓功能食品上市，而國(guó)內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)產(chǎn)品。因此，本文就乳三肽的功效、安全性、制備方法和新來(lái)源等進(jìn)行綜述，旨在為推動(dòng)我國(guó)第三代降血壓功能食品的開發(fā)提供參考。

1 乳三肽的體外ACE抑制活性

大量研究表明，ACEIPs對(duì)ACE的抑制作用與其N端和C端的氨基酸殘基種類密切相關(guān)。當(dāng)N端為疏水氨基酸，尤其是具有脂肪鏈的氨基酸（如Gly、Ille、Val和Leu時(shí)），C端為具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的氨基酸（如Pro、Tyr和Trp時(shí)），ACEIPs的ACE抑制活性最強(qiáng)[25]。IPP、VPP和LPP的N端和C端氨基酸殘基種類均很好地滿足上述構(gòu)效關(guān)系，這三者的半抑制濃度（50% inhibiting concentration，IC50）分別為5.0、9.0 μmol/L和9.6 μmol/L，雖然遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于常見的ACE抑制劑類藥物卡托普利的IC50（0.02 μmol/L）[26]，但是低于大部分已報(bào)道的ACEIPs[27]，因此具有很強(qiáng)的體外ACE抑制活性。一項(xiàng)體外研究證實(shí)，乳三肽可選擇性地抑制ACE1的活性，但對(duì)ACE2和胃促胰酶的活性無(wú)顯著影響[28]，這為乳三肽的實(shí)際應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

2 乳三肽的消化吸收

ACEIPs只有進(jìn)入血液循環(huán)才能發(fā)揮降血壓功效。由于人體的胃腸道和血液中存在大量的蛋白酶和肽酶，很多ACEIPs在消化吸收過(guò)程中極易被水解而失去原先的結(jié)構(gòu)和活性；另外，部分ACEIPs由于分子質(zhì)量過(guò)大而無(wú)法直接被人體吸收。因此，ACEIPs能否以完整的結(jié)構(gòu)被人體吸收是其能否發(fā)揮體內(nèi)降血壓功效的關(guān)鍵[16]。研究發(fā)現(xiàn)，由于脯氨酸獨(dú)特的環(huán)狀結(jié)構(gòu)會(huì)影響其與蛋白酶活性部分的結(jié)合，使得絕大部分蛋白酶都難以裂解Xaa-Pro或Pro-Pro肽鍵，因此在C末端存在一個(gè)或多個(gè)Pro殘基會(huì)使多肽耐受胃腸道蛋白酶的分解，并有利于多肽在后續(xù)的體內(nèi)運(yùn)輸過(guò)程中保持結(jié)構(gòu)完整，從而使其進(jìn)入血液循環(huán)并發(fā)揮體內(nèi)降血壓作用[29-31]。乳三肽的C端均含有兩個(gè)Pro殘基，這為其抵御蛋白酶和肽酶的降解提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，IPP和VPP對(duì)胃腸道消化酶具有很強(qiáng)的抗性[32]，且兩者均能以完整結(jié)構(gòu)通過(guò)Caco-2單層細(xì)胞[33]。以豬為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，對(duì)IPP、LPP和VPP的藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)它們均可以被完整地吸收進(jìn)入血液循環(huán)，且當(dāng)以靜脈注射的方式給藥時(shí)，IPP、LPP和VPP的消除半衰期分別為（2.5f0.1）、（1.9f0.1）min和（2.0f0.1）min；當(dāng)以口服方式給藥時(shí)，這3種三肽的半衰期則無(wú)顯著差異，分別為（9f1）、（15f4）min和（12f6）min[34]。人體實(shí)驗(yàn)也充分證實(shí)了這一結(jié)論，當(dāng)受試人群攝入含有IPP和LPP的飲料后，這兩種三肽均能夠被完整地吸收進(jìn)入血液循環(huán)，且與膳食同時(shí)攝入有利于提高這兩種三肽在血液中的含量[35]。

3 乳三肽的臨床降血壓效果

根據(jù)國(guó)際高血壓協(xié)會(huì)于2020年頒布的《全球高血壓實(shí)踐指南》，可將人體的血壓分為如下幾個(gè)等級(jí)，其中，正常人的血壓收縮壓為90～140 mm汞柱，舒張壓為60～90 mm汞柱；輕度高血壓患者收縮壓為140～159 mm汞柱，舒張壓為90～99 mm汞柱；中度高血壓患者收縮壓為160～179 mm汞柱，舒張壓為100～109 mm汞柱；重度高血壓患者收縮壓大于等于180 mm汞柱，舒張壓大于等于110 mm汞柱。目前已有大量Meta分析和綜述對(duì)乳三肽，尤其是IPP和VPP，在雙盲安慰劑對(duì)照試驗(yàn)中對(duì)高血壓患者的血壓干預(yù)作用進(jìn)行了總結(jié)[36-37]。結(jié)果表明，持續(xù)4～8周每日攝入2～10 mg含有IPP和VPP的飲品可以顯著降低受試者的血管收縮壓和舒張壓[21,38-40]。

Hata等在一項(xiàng)安慰劑對(duì)照研究中發(fā)現(xiàn)，讓30多名40～86 歲的高齡高血壓患者連續(xù)8周每天攝入95 mL含有IPP和VPP的可爾必思酸奶（日本東京可爾必思食品工業(yè)有限公司）后，患者的收縮壓下降了（14.1f3.1）mm汞柱（P＜0.01），舒張壓下降了（6.9f2.2）mm汞柱（P＜0.01），而安慰劑對(duì)照組的血壓沒(méi)有顯著變化[41]。Aihara等讓40 名正常高值血壓受試者和40 名輕度高血壓患者連續(xù)4周每天攝入6 片含IPP和VPP的瑞士乳桿菌CM4（Lactobacillus helveticusCM4）發(fā)酵酸奶片，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組受試對(duì)象的收縮壓和舒張壓與安慰劑組相比均顯著下降，其中正常高值血壓組與安慰劑組相比舒張壓顯著下降了5.0 mm汞柱，而輕度高血壓患者組的收縮壓下降了11.2 mm汞柱[42]。Turpeinen等進(jìn)行了一項(xiàng)為期10周的雙盲安慰劑對(duì)照干預(yù)實(shí)驗(yàn)，62 名輕度高血壓受試者每天攝入含有4.2 mg IPP和VPP的涂抹醬后，收縮壓顯著下降了5.0 mm汞柱[43]；隨后Turpeinen等又對(duì)104 名年齡在35～60 歲之間的歐洲高血壓高膽固醇患者進(jìn)行干預(yù)試驗(yàn)，同樣攝入含有4.2 mg IPP和VPP的涂抹醬，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組的收縮壓與安慰劑組相比顯著下降了3.6 mm汞柱（P＝0.007）[39]。Nakamura等就乳三肽對(duì)日本高血壓患者的降血壓效果進(jìn)行了研究，70 名年齡50～69 歲的高血壓患者每天攝入含有3.4 mg VPP和IPP的藥片，持續(xù)8周后實(shí)驗(yàn)組的收縮壓下降了（11.0f11.0）mm汞柱，而安慰劑組下降了（4.5f9.6）mm汞柱[44]。Kajimoto等設(shè)計(jì)了一項(xiàng)針對(duì)輕度高血壓患者的雙盲安慰劑對(duì)照試驗(yàn)，64 名年齡在39～61 歲的受試者連續(xù)每天攝入含有IPP和VPP的酸奶飲料（每瓶150 g，每天2 瓶），8周后發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組受試者的收縮壓和舒張壓與安慰劑組相比分別高度顯著下降了（13.9f11.4）mm汞柱（P＜0.001）和（9.1f7.5）mm汞柱（P＜0.001）[36]。Chanson-Rolle等以日本人群為受試對(duì)象，發(fā)現(xiàn)每天攝入一定量的IPP和VPP有效降低了受試者的血管收縮壓（－5.63 mm汞柱，P＜0.000 1），且這兩種三肽對(duì)高血壓患者的降壓效果要顯著好于對(duì)非高血壓患者[45]。Hirota等讓25 位患有輕度高血壓的男性受試者每天攝入含有VPP和IPP的酪蛋白水解物，1周后測(cè)量左上臂的反應(yīng)性充血情況，發(fā)現(xiàn)含有VPP和IPP的酪蛋白水解物可以顯著改善輕度高血壓患者的血管內(nèi)皮功能障礙[38]。

由上述研究可知，乳三肽，尤其是IPP和VPP具有明確的體內(nèi)降血壓功效。這些臨床研究結(jié)果為基于乳三肽開發(fā)具有明確功效的第三代降血壓功能食品奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。表1對(duì)部分關(guān)于乳三肽臨床降血壓功效的研究進(jìn)行了總結(jié)。

表1 乳三肽的臨床降血壓效果總結(jié)Table 1 A summary of the clinical antihypertensive effect of lactotripeptidess

4 乳三肽的其他功能

除了降血壓作用外，乳三肽還被發(fā)現(xiàn)具有其他多種生理功能。

4.1 改善血管內(nèi)皮功能障礙

VPP和IPP可以抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖、降低由血管緊張素酶II誘導(dǎo)的細(xì)胞促炎介質(zhì)（cyclooxygenase-2，COX-2）和超氧化物的含量，且VPP比IPP的效果更為顯著[46]；Song Tianyuan等也發(fā)現(xiàn)了這兩種三肽活性的差異，且認(rèn)為這種差異主要是兩者N端氨基酸殘基種類的不同所致[47]。Hirota等發(fā)現(xiàn)，在離體條件下，去除主動(dòng)脈的內(nèi)皮細(xì)胞后，VPP和IPP干預(yù)均未引起血管舒張，表明這兩種三肽是通過(guò)影響內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)引起血管舒張[48]。J?k?l?等以SHR為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，也發(fā)現(xiàn)VPP和IPP可以改善血管內(nèi)皮功能障礙，有利于腸系膜動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張[49-50]。體內(nèi)研究也證實(shí)了上述發(fā)現(xiàn)，Hirota等讓輕度高血壓患者連續(xù)1周攝入含有VPP和IPP的酪蛋白水解物后，發(fā)現(xiàn)受試者的血管內(nèi)皮功能障礙得到了顯著改善[38]。

4.2 促進(jìn)血管擴(kuò)張因子釋放

一氧化氮（nitrogen oxide，NO）是一種有效的內(nèi)源性血管舒張物質(zhì)，在保護(hù)心血管健康中發(fā)揮著重要作用[51-52]。研究發(fā)現(xiàn)，IPP和VPP也可以誘導(dǎo)NO的產(chǎn)生，從而改善I期高血壓患者的血管內(nèi)皮功能[38,47,53]。

Nonaka等將IPP和VPP與N-硝基-L-精氨酸甲酯鹽酸鹽混合后添加到正常大鼠的飲用水中，發(fā)現(xiàn)與未添加這兩種三肽的對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠血漿中亞硝酸鹽和硝酸鹽（NOx）的水平顯著增加，這對(duì)于緩解實(shí)驗(yàn)大鼠的動(dòng)脈功能障礙、血管僵硬和靶器官損傷具有積極影響[53]。還有報(bào)道證實(shí)IPP、VPP可以通過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)生NO以修復(fù)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[48,54]以及誘導(dǎo)離體主動(dòng)脈細(xì)胞產(chǎn)生NO，進(jìn)而引起主動(dòng)脈血管舒張[48]。有學(xué)者通過(guò)DNA芯片技術(shù)分析了IPP和VPP對(duì)SHR體內(nèi)降壓效果的機(jī)理，發(fā)現(xiàn)這兩種多肽可以顯著增加內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因的表達(dá)[55]。

4.3 類胰島素功能

高血壓和糖尿病這兩種代謝綜合征具有共同的病理，都能引起損傷血管，且長(zhǎng)時(shí)間患糖尿病易誘發(fā)心腦血管疾病，因此，IPP和VPP的攝入與胰島素水平的關(guān)系也引起了部分學(xué)者的關(guān)注[56-58]。最近研究發(fā)現(xiàn)，IPP和VPP可以通過(guò)增強(qiáng)胰島素信號(hào)的傳導(dǎo)和抑制炎癥對(duì)胰島素的干擾從而調(diào)節(jié)胰島素水平，進(jìn)而對(duì)高血壓的控制產(chǎn)生有利的影響[59-60]。Chakrabarti等以小鼠前脂肪細(xì)胞（3T3-F442A）為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)IPP和VPP可以誘導(dǎo)脂肪發(fā)生分化、上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)和脂聯(lián)素的釋放，還能夠抑制細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥[61]，且增加了3T3-F442A細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性[62]。

4.4 降低交感神經(jīng)活動(dòng)

高血壓對(duì)交感神經(jīng)也會(huì)產(chǎn)生一定的影響。Miyazaki等以SHR為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)攝入IPP和VPP后實(shí)驗(yàn)大鼠的皮膚動(dòng)脈交感神經(jīng)活動(dòng)和平均動(dòng)脈壓均顯著降低[63]；Usinger等在人體中也觀察到了類似的現(xiàn)象，受試者連續(xù)8周每天攝入由瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）發(fā)酵的含IPP和VPP的酸奶后，其交感神經(jīng)活動(dòng)顯著減弱[64]。

5 乳三肽的安全性

由于IPP、VPP和LPP主要存在于水解物中，因此目前對(duì)這3種三肽的安全性研究主要以相應(yīng)的水解物為對(duì)象。Tensguard?是由荷蘭DSM公司開發(fā)的一種富含IPP的乳蛋白水解物，具有顯著的降血壓功效。Ponstein-Simarro Doorten等對(duì)該水解物進(jìn)行了細(xì)菌反向突變?cè)囼?yàn)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)、哺乳動(dòng)物染色體突變?cè)囼?yàn)以及大鼠90 d重復(fù)劑量口服毒性研究，發(fā)現(xiàn)該水解產(chǎn)物不具有致畸或致突變作用，口服毒性試驗(yàn)則表明在選擇的最高測(cè)試劑量下（40 mg IPP/（kgmbgd））仍然是安全的[65]。Maeno等以倉(cāng)鼠為對(duì)象進(jìn)行染色體畸變實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)攝入IPP和VPP不會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞毒性或染色體異常[66]。Dent等則就IPP和VPP對(duì)大鼠進(jìn)行了為期90 d的重復(fù)灌胃毒性研究，并以兔子為對(duì)象研究了這兩種三肽對(duì)產(chǎn)前胚胎和胎兒發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)在測(cè)試的最高劑量（33.6 mg IPP/（kgmbgd））下兩種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均未出現(xiàn)不良反應(yīng)[67]。Mizuno等給24只大鼠連續(xù)91 d灌胃劑量分別為0、40、200、1 000 mg含有0.6% IPP和VPP的酪蛋白水解物，均未出現(xiàn)行為和臨床體征上的異常，解剖后發(fā)現(xiàn)器官和組織病理學(xué)也未發(fā)生顯著變化[68]。

IPP和VPP的有效降血壓劑量可能由于人群、地域、年齡、飲食習(xí)慣以及高/輕度血壓癥狀的不同而有差異，普遍認(rèn)為IPP和VPP的有效低劑量小于10 mg/d[69]，一般認(rèn)為在3.07 mg/d左右，但是當(dāng)乳三肽的劑量高達(dá)52.5 mg/d時(shí)人體也不會(huì)出現(xiàn)任何不良反應(yīng)[70]。

乳三肽對(duì)人體的安全性已被大量臨床研究所證實(shí)。Hata等發(fā)現(xiàn)，30多名高血壓患者在連續(xù)8周每天攝入95 mL含有IPP和VPP可爾必思酸奶后，脈搏率、體質(zhì)量和血清生化指標(biāo)均無(wú)明顯變化[41]。Aihara等也觀察到了同樣的結(jié)果，受試者在連續(xù)4周攝入含有IPP和VPP的發(fā)酵酸奶片后，脈搏率、體質(zhì)量和血清生化指標(biāo)均無(wú)明顯變化，也未出現(xiàn)其他不良反應(yīng)[42]。Nakamura等發(fā)現(xiàn)，受試者攝入含有3.4 mg VPP和IPP的藥片后均未出現(xiàn)咳嗽、疲勞、頭痛和痛風(fēng)等合成ACE抑制劑類藥物常出現(xiàn)的不良反應(yīng)[44]；Kajimoto等也發(fā)現(xiàn)受試者在每天攝入300 g含有IPP和VPP的酸奶飲料8周后，均未出現(xiàn)干咳、消化異常等不良反應(yīng)，血清標(biāo)記物和尿酸水平等指標(biāo)也未出現(xiàn)明顯變化[36]。Turpeinen等發(fā)現(xiàn)，來(lái)自歐洲的受試者攝入含IPP、VPP和植物固醇的涂抹醬后，其收縮壓和血清總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇水平均顯著降低，但是未出現(xiàn)其他不良反應(yīng)[39]。

由上述動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體研究可知，在合理的劑量范圍內(nèi)，乳三肽具有良好的安全性。

6 基于乳三肽的降血壓功能食品

目前國(guó)外市場(chǎng)上已有多種基于乳三肽的降血壓功能食品上市，產(chǎn)品形式多為片劑、膠囊或發(fā)酵酸奶。TensguardTM是由荷蘭DSM公司最新開發(fā)生產(chǎn)的一種乳蛋白水解物，該產(chǎn)品富含IPP，可用于維持心血管健康及保持血壓在正常范圍[65]。日本可爾必思食品工業(yè)公司生產(chǎn)的Calpis?酸奶由瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）和啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）發(fā)酵牛奶制得，富含IPP、VPP和LPP，據(jù)稱其“適用于輕度高血壓者”，該產(chǎn)品在日本已經(jīng)暢銷20多年，是眾多患有高血壓人士每天必不可少的降壓保健食品，并且可以和降壓藥物同時(shí)服用；該公司在Calpis?酸奶的基礎(chǔ)上又開發(fā)了具有降血壓功效的酪蛋白水解物AmealPeptide?，該產(chǎn)品以片劑的形式銷售，每片含LPP和VPP共1.7 mg，建議服用量為每天2 片。芬蘭瓦利奧（Valio）公司也推出了具有降血壓功能的、由瑞士乳桿菌發(fā)酵的酸奶制品Evolus?，該產(chǎn)品于2000年上市，深受歐洲消費(fèi)者歡迎，被稱為“第一個(gè)有助于降低血壓的歐洲功能性食品”[71]。

7 乳三肽的制備方法

乳三肽最早從瑞士乳桿菌和釀酒酵母共同發(fā)酵的酸奶中分離鑒定[72]。隨著人們對(duì)乳三肽功能了解的深入，乳三肽的制備方法也日益豐富。目前已報(bào)道的乳三肽生產(chǎn)方式主要分為3種：胃腸液消化法、瑞士乳桿菌發(fā)酵法和酶解法。

7.1 胃腸液消化法

酪蛋白在體內(nèi)的消化過(guò)程可分為兩個(gè)階段，首先經(jīng)消化酶（胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶）進(jìn)行“I期消化”，隨后在腸上皮細(xì)胞通過(guò)刷狀緣肽酶進(jìn)行“II期消化”。腸上皮細(xì)胞刷狀緣含有豐富的肽酶，可以將“I期消化”產(chǎn)生的多肽進(jìn)一步水解成寡肽（二肽、三肽）甚至氨基酸。胃腸道消化系統(tǒng)能否直接水解酪蛋白釋放乳三肽已經(jīng)引起了學(xué)者們的廣泛關(guān)注。體外研究表明，β-酪蛋白通過(guò)胃腸道消化后可釋放出含有IPP和VPP序列的前體，但并不能直接釋放出這兩種三肽[32]；但在另外一些研究中則得到了相反的結(jié)論。Tagliazucchi等利用COST Action Infogest體外消化模型對(duì)駱駝奶中的κ-酪蛋白進(jìn)行水解，成功在水解液中檢測(cè)到了IPP的存在，且其質(zhì)量濃度達(dá)到了（2.56f0.15）mg/L[73]；Rutella等利用該模型成功從脫脂牛奶中得到了VPP和IPP，且兩者的質(zhì)量濃度分別為（354.3f29.8）μg/L和（973.8f155.7）μg/L[74]；在牛、駱駝、綿羊和山羊奶的體外消化實(shí)驗(yàn)中得到了相似的結(jié)論[73,75-76]。一項(xiàng)臨床試驗(yàn)證實(shí)了上述發(fā)現(xiàn)，受試者在攝入了不含游離IPP的乳清分離蛋白后，血漿中的IPP濃度顯著增加，表明人體內(nèi)的胃腸道消化系統(tǒng)可水解乳清分離蛋白并釋放出IPP[77]。

7.2 瑞士乳桿菌發(fā)酵法

目前富含IPP、VPP和LPP的功能食品（包括酸奶、奶酪以及風(fēng)味乳飲料）主要以酪蛋白為原料通過(guò)瑞士乳桿菌發(fā)酵制得[78]。瑞士乳桿菌具有很高的胞外胞內(nèi)蛋白酶活性，因此被廣泛用于發(fā)酵牛奶以生產(chǎn)富含IPP、VPP和/或LPP的水解產(chǎn)物。

7.2.1 瑞士乳桿菌的蛋白水解系統(tǒng)

瑞士乳桿菌在發(fā)酵過(guò)程中要需要在自身蛋白酶水解系統(tǒng)的作用下水解酪蛋白，以產(chǎn)生供自身生長(zhǎng)繁殖所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，IPP、VPP及LPP即在此過(guò)程中被釋放出來(lái)[79-81]。在眾多乳酸菌菌株中，瑞士乳桿菌具有最高的細(xì)胞包膜蛋白酶活性[81]。Edens等發(fā)現(xiàn)瑞士乳桿菌的細(xì)胞包膜蛋白酶屬于絲氨酸蛋白酶，這類蛋白酶具有專一性和高效性，這也是瑞士乳桿菌具有極強(qiáng)蛋白質(zhì)水解活性的重要原因[29]。酪蛋白經(jīng)瑞士乳桿菌發(fā)酵水解生成生物活性肽主要由3 個(gè)系統(tǒng)起作用，即細(xì)胞包膜蛋白酶水解系統(tǒng)、細(xì)胞膜上的寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和胞內(nèi)酶水解系統(tǒng)[80,82-83]。第一個(gè)系統(tǒng)將酪蛋白水解成由3～30 個(gè)氨基酸殘基組成的寡肽，第二個(gè)系統(tǒng)將這些寡肽通過(guò)細(xì)胞膜上的肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，第三個(gè)系統(tǒng)則在細(xì)胞內(nèi)將寡肽通過(guò)胞內(nèi)蛋白酶水解為含2～5 個(gè)氨基酸片段的小肽（包括IPP、VPP和LPP）甚至是氨基酸[83]。

7.2.2 瑞士乳桿菌的細(xì)胞包膜蛋白酶

不同瑞士乳桿菌菌株的細(xì)胞包膜蛋白酶活性存在差異。Wakai等發(fā)現(xiàn)瑞士乳桿菌CM4和瑞士乳桿菌DPC4571的細(xì)胞包膜蛋白酶活性不同，進(jìn)而導(dǎo)致了兩者在發(fā)酵酸奶時(shí)產(chǎn)生IPP和VPP的含量也不同[84]；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，從瑞士乳桿菌菌株CP790中分離純化得到的細(xì)胞包膜蛋白酶水解α-和β-酪蛋白時(shí)無(wú)法得到IPP和VPP[85]，但是瑞士乳桿菌CP790和瑞士乳桿菌CM4的細(xì)胞外蛋白酶水解酪蛋白時(shí)產(chǎn)生了一個(gè)包含IPP和VPP序列的、由28 個(gè)氨基酸殘基組成的多肽[85]。這表明欲從酪蛋白中水解得到IPP和VPP，除了細(xì)胞包膜蛋白酶外，還需要其他蛋白酶的參與。

7.2.3 瑞士乳桿菌的細(xì)胞內(nèi)蛋白酶

在瑞士乳桿菌CM4菌株中檢測(cè)到了可水解C-末端脯氨酸的肽酶，該酶是加工生成IPP和VPP的關(guān)鍵[86]。Griffiths[79]、Wakai[87]等發(fā)現(xiàn)欲從酪蛋白中獲得IPP和VPP，還需要對(duì)肽的N-末端進(jìn)行切割，且當(dāng)N端氨基酸殘基為脯氨酸時(shí)氨肽酶的水解會(huì)終止。X-脯氨酰二肽氨基肽酶（pepX）能夠從多肽的N-末端切割兩個(gè)氨基酸并釋放具有Xaa-Pro序列的二肽[88-89]，但是當(dāng)Xaa-Pro-Pro序列存在時(shí)，氨肽酶停止水解[79]。因此，水解酪蛋白產(chǎn)生VPP和LPP需要多種蛋白酶和肽酶的協(xié)同作用。已經(jīng)在不同的瑞士乳桿菌菌株中發(fā)現(xiàn)了多種肽酶，包括氨肽酶（pepC1、pepC2、pepN、pepN2、pepA）、pepX、內(nèi)肽酶（pepE、pepE2、pepF、pepO、pepO2、pepO3）、三肽酶（pepT、pepT2）、二肽酶（pepD1、pepD2、pepD3、pepV、pepDA）[82-83,87]等，這些酶在乳三肽的定向水解中發(fā)揮了重要作用，這也是瑞士乳桿菌被廣泛用于乳三肽制備的重要原因之一。

瑞士乳桿菌的蛋白水解系統(tǒng)及水解過(guò)程如圖1所示。

圖1 瑞士乳桿菌蛋白水解系統(tǒng)的示意圖[78,82]Fig. 1 Schematic diagram of protein hydrolysis system of Lactobacillus helveticus[78,82]

7.3 酶解法

由于瑞士乳桿菌蛋白水解能力強(qiáng)、蛋白酶種類豐富，尤其是富含多種脯氨酸特異性的肽酶，因此在乳三肽的制備中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。但是微生物發(fā)酵法存在明顯缺點(diǎn)，首先，發(fā)酵使用的乳酸菌是活生物體，其分泌酶的類型和數(shù)量難以控制，生產(chǎn)過(guò)程的重現(xiàn)性較差；其次，發(fā)酵過(guò)程時(shí)間較長(zhǎng)，易發(fā)生微生物污染；此外，發(fā)酵產(chǎn)品不宜直接摻入固體食品中[29]。

相比于發(fā)酵法，蛋白酶水解法生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、產(chǎn)品質(zhì)量易于控制、成本相對(duì)較低，因此是一種更加經(jīng)濟(jì)可行的乳三肽生產(chǎn)方法。酶解法制備乳三肽的關(guān)鍵在于尋找可以切割含有X-Pro-Pro序列的蛋白酶。Mizuno等使用9種市售的蛋白酶水解酪蛋白，發(fā)現(xiàn)來(lái)自米曲霉（Aspergillus oryzae）的蛋白酶Sumizyme FP的水解產(chǎn)物中存在大量Xaa-Pro-Pro和Xaa-Pro序列[90]；對(duì)Sumizyme FP進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，得到了一種內(nèi)肽酶（neutral protease I，NP I）和一種氨肽酶（leucine aminopeptidase，LAP），其中前者具有羧肽酶活性，后者具有氨肽酶活性，兩者單獨(dú)作用不足以使酪蛋白水解釋放出IPP，但是兩者協(xié)同作用可以成功水解酪蛋白產(chǎn)生IPP，這表明NP I和LAP是水解酪蛋白產(chǎn)生IPP的關(guān)鍵酶[91]。米曲霉蛋白酶水解產(chǎn)生含IPP和VPP的酪蛋白水解產(chǎn)物經(jīng)臨床試驗(yàn)證實(shí)具有良好的降血壓效果[92-93]。

8 關(guān)于乳三肽的專利

由于乳三肽具有明確的體內(nèi)降血壓功效，目前已有大量關(guān)于它們新型生產(chǎn)方法的專利，其中最常見的是微生物發(fā)酵法。專利US2006/0246178[94]中報(bào)道了一種利用瑞士乳桿菌CNRZ 244（Lactobacillus helveticusCNRZ 244）發(fā)酵生產(chǎn)包含VPP和/或IPP乳制品的方法，原料可以使用含有酪蛋白的任意奶源，包括牛乳、羊乳、駱駝乳、馬乳、脫脂乳粉及重構(gòu)乳；為了提高產(chǎn)品的適口性和風(fēng)味，還可以在發(fā)酵過(guò)程中添加其他微生物例如釀酒酵母等。專利US6534304[95]篩選得到了一種具有高水解活性的瑞士乳桿菌CM4（Lactobacillus helveticusCM4）菌株，用其在37 ℃下對(duì)脫脂乳進(jìn)行發(fā)酵，24 h后酸奶中的IPP和VPP質(zhì)量濃度分別達(dá)到了23.5 μg/mL和38.5 μg/mL。專利US2011/0165135[96]使用3種新型的瑞士乳桿菌（CNCM I-3997、CNCM I-3998和CNCM I-3999）發(fā)酵牛奶，所得產(chǎn)品中IPP、VPP和LPP的質(zhì)量濃度可以達(dá)到可爾必思產(chǎn)品（Ameal S?）的3 倍。專利US6890529[97]發(fā)現(xiàn)一種新的菌株瑞士乳桿菌LBK-16H（Lactobacillus helveticusLBK-16H）具有很高的蛋白質(zhì)水解活性，將其在含9%牛奶的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，成功檢測(cè)到了VPP和IPP，兩者的質(zhì)量濃度分別為6 mg/L和13 mg/L。

由于乳三肽富含Pro的特性，目前僅有少量專利利用酶解法來(lái)獲得乳三肽，且其中很多并未明確所使用的蛋白酶種類。專利WO2006/084560A1[98]公布了一種生產(chǎn)含IPP和VPP及VB的多肽水解物的方法：首先利用蛋白酶水解全脂牛奶、脫脂牛奶、酸性乳清、干酪乳清、酪蛋白、凝乳酶酪蛋白、動(dòng)物蛋白明膠、骨頭、大豆、大米、玉米或小麥面筋等含有乳三肽序列的底物，然后對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)行分離和濃縮，即可作為一種添加劑用于降血壓功能食品的制備。歐洲專利EP1231279[99]公開了一種酶解酪蛋白酸鹽制備含IPP和VPP水解物的方法，先用蛋白酶水解底物得到含有IPP和VPP序列的中間產(chǎn)物，然后再進(jìn)一步酶解即得到IPP和VPP。專利US7879804[29]針對(duì)多酶復(fù)合水解耗時(shí)較長(zhǎng)、工藝繁瑣、容易污染等問(wèn)題，提出了單一水解步驟制備IPP和VPP的方法，利用脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶（proline specific endoprotease，PSE）并結(jié)合氨基肽酶對(duì)酪蛋白酸鹽在pH 4～6和40 ℃以上水解4 h后，IPP、LPP和VPP的含量分別達(dá)到了4.8、10.0 mg/g和5.0 mg/g。專利US8088597[100]則公開了一種利用PSE和氨肽酶結(jié)合水解糖巨肽生產(chǎn)低苦味、高IPP含量水解物的方法。

微生物發(fā)酵法和酶解法相結(jié)合也已被用于乳三肽的生產(chǎn)。專利US2011/0045130[30]先利用瑞士乳桿菌菌株100H（Lactobacillus helveticus100H）發(fā)酵脫脂乳，然后在發(fā)酵過(guò)程中添加Corolase LAP Ch.: 4123和PSE，所得水解產(chǎn)物中IPP、LPP和VPP的含量分別高達(dá)52.3、76.5 mg/g和79.6 mg/g。專利WO2009/065862[101]發(fā)現(xiàn)利用瑞士乳桿菌發(fā)酵脫脂牛奶僅能釋放出IPP和VPP，但是加入PSE和氨肽酶后，IPP、VPP、LPP均被釋放出來(lái)，且三者的含量分別為0.29、1.13 mg/g和0.26 mg/g。專利US2011/0142989[102]公開了一種利用來(lái)自曲霉的蛋白酶Umamizyme水解酪蛋白制備VPP、IPP和LPP的方法，發(fā)現(xiàn)結(jié)合瑞士乳桿菌CNRZ 244發(fā)酵可顯著提高水解產(chǎn)物中這3種三肽的含量。專利US2010/0151080[103]先使用木瓜蛋白酶F和菠蘿蛋白酶F水解脫脂乳，然后再使用瑞士乳桿菌CM4進(jìn)行發(fā)酵，得到了IPP和VPP含量較高的酸奶制品。

表2對(duì)現(xiàn)有的關(guān)于乳三肽的專利進(jìn)行了總結(jié)。

表2 目前關(guān)于乳三肽的專利Table 2 Summary of recent patents regarding lactotripeptides

9 IPP、VPP的天然新來(lái)源

牛奶中的酪蛋白是IPP、VPP和LPP的傳統(tǒng)來(lái)源，目前已經(jīng)上市銷售的降血壓功能食品中的乳三肽均源自牛奶或酪蛋白，且多已申請(qǐng)國(guó)際專利保護(hù)。因此，開拓乳三肽的新來(lái)源對(duì)于新型降血壓功能食品的開發(fā)具有重要意義。隨著信息技術(shù)的快速發(fā)展，許多蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)已經(jīng)明確，這為尋找上述乳三肽的新來(lái)源提供了極大的便利。

9.1 奶類新來(lái)源

除了牛奶外，很多其他來(lái)源的奶中也含有酪蛋白，因此也是乳三肽的潛在來(lái)源。Tagliazucchi等對(duì)駱駝、山羊和綿羊奶進(jìn)行體外消化，發(fā)現(xiàn)山羊和綿羊奶的水解物中含有VPP，駱駝、山羊和綿羊奶的水解物中含有IPP[76]，進(jìn)一步研究表明體外消化可從山羊奶的β-和κ-酪蛋白中釋放出IPP和VPP[75]。另外，在水牛奶[108-109]和牦牛奶[110-111]及其制品的模擬胃消化液中也發(fā)現(xiàn)了含有IPP和/或VPP序列的一系列前體物質(zhì)[108]。生物信息學(xué)分析表明，IPP還存在于馬奶和驢奶的κ-酪蛋白中[78]及駱駝奶的β-酪蛋白（片段173～175）和κ-酪蛋白（片段99～101）中[73]，VPP存在于駱駝奶的κ-酪蛋白中[73]。一項(xiàng)研究證實(shí)了上述發(fā)現(xiàn)，利用瑞士乳桿菌130B4（Lactobacillus helveticus130B4）發(fā)酵駱駝奶后，從水解產(chǎn)物中分離純化得到了含有IPP的九肽序列Ala-Ile-Pro-Pro-Lys-Lys-Asn-Gln-Asp[112-113]。

9.2 谷物新來(lái)源

使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中的肽段檢索工具進(jìn)行檢索，發(fā)現(xiàn)小麥、大米、黑麥、大麥、燕麥、玉米、小米等谷物的主要存儲(chǔ)蛋白中都含有IPP和VPP序列[78]。Hu Ying等的研究證實(shí)了上述結(jié)果，他們?cè)谛←満秃邴湹陌l(fā)酵酸面團(tuán)中成功分離鑒定出了IPP和VPP[114]。因此，谷物蛋白也是乳三肽的新型來(lái)源。

表3對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道的乳三肽的新來(lái)源進(jìn)行了總結(jié)。

表3 乳三肽新來(lái)源的總結(jié)Table 3 Summary of the new sources of lactotripeptides

10 結(jié) 語(yǔ)

IPP、VPP和LPP對(duì)高血壓患者具有明確的預(yù)防和治療效果，而且安全性高，因此，是一類極具前景的生物活性物質(zhì)，在第三代降血壓功能食品的研究與開發(fā)中具有廣闊的應(yīng)用前景，國(guó)外已有多種產(chǎn)品上市。然而，目前乳三肽主要來(lái)源于酪蛋白，其生產(chǎn)工藝及產(chǎn)品開發(fā)已經(jīng)較為成熟，但相關(guān)公司已對(duì)該來(lái)源的技術(shù)和產(chǎn)品進(jìn)行了專利保護(hù)；乳三肽僅存在于特定的蛋白質(zhì)中，而現(xiàn)有的生物信息學(xué)技術(shù)并未涵蓋所有蛋白質(zhì)資源的序列，這限制了乳三肽新來(lái)源的開發(fā)；另外，乳三肽富含脯氨酸，而目前市面上商品化的蛋白酶很難直接水解蛋白質(zhì)原料以獲得乳三肽?；谏鲜鲈?，雖然已有部分學(xué)者開始關(guān)注乳三肽，但是目前國(guó)內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)產(chǎn)品上市。因此，尋找上述乳三肽的新來(lái)源以及開發(fā)新的生產(chǎn)工藝對(duì)于我國(guó)新型第三代降血壓功能食品的開發(fā)至關(guān)重要。