乳酸菌代謝低聚果糖/菊粉途徑及機(jī)理的研究進(jìn)展

賴鯨慧，祝元婷，陳 媛，唐 林，陳貴希，李建龍，劉書(shū)亮,3,*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014；2.四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610066；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品加工與安全研究所，四川 雅安 625014）

低聚果糖（fructooligosaccharides，F(xiàn)OS）是由β-D(2→1)果糖基連接、末端有（或沒(méi)有）一個(gè)葡萄糖分子的碳水化合物，聚合度（degree of polymerization，DP）為2～10，分子式為GFn或FFn（G表示葡萄糖，F(xiàn)表示果糖基，n表示果糖基數(shù)）[1]。菊粉也稱菊糖，是由D-呋喃果糖分子以β(2→1)鍵連接而成的線性直鏈多糖，末端常帶一個(gè)葡萄糖殘基，常表示為GFn，DP一般在2～60。根據(jù)平均DP不同可分為3種：短鏈菊粉（DP≤10）、天然菊粉（2≤DP≤60）和長(zhǎng)鏈菊粉（DP≥23）[2]。FOS和菊粉是研究最為廣泛的益生元，大量體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明其可以選擇性調(diào)節(jié)腸道微生物，有助于宿主健康。

合生元又稱合生素，指益生元與益生菌結(jié)合使用的生物制劑（微生態(tài)制劑），具有益生功能及治療多種疾病的作用[3]。合生元可分為互補(bǔ)性合生元和協(xié)同性合生元。互補(bǔ)性合生元要求益生元和益生菌能產(chǎn)生益生效應(yīng)，產(chǎn)生的影響是其中每個(gè)組分有益影響之和。協(xié)同性合生元各成分除應(yīng)具有益生效應(yīng)外，益生菌還應(yīng)具有代謝益生元的能力。這是協(xié)同性合生元最大的優(yōu)點(diǎn)，即益生元可為益生菌提供營(yíng)養(yǎng)，賦予它與其他腸道微生物競(jìng)爭(zhēng)的優(yōu)勢(shì)，使得其在腸道定植和長(zhǎng)期發(fā)揮益生作用成為可能。

乳酸菌屬于益生菌，是人體腸道菌群重要組成部分，具有多種益生功能，如代謝產(chǎn)生的短鏈脂肪酸、細(xì)菌素、過(guò)氧化氫可抑制或殺死腸道內(nèi)的有害菌，維持腸道微生態(tài)平衡[4]。乳酸菌細(xì)胞內(nèi)碳水化合物活性酶存在特異性[5]，對(duì)益生元的利用也具有特異性，因此，了解不同乳酸菌對(duì)FOS和菊粉的代謝情況可為合生元（特別是協(xié)同性合生元）的研究提供菌種資源，明確乳酸菌代謝FOS和菊粉的機(jī)制有利于合生元研究。本文對(duì)乳酸菌對(duì)FOS和菊粉的代謝能力差異、代謝途徑以及主要的代謝調(diào)控機(jī)制進(jìn)行綜述，總結(jié)近年來(lái)FOS/菊粉合生元的應(yīng)用，以期為益生元與益生菌進(jìn)一步聯(lián)用提供參考依據(jù)，同時(shí)展望了未來(lái)的研究方向。

1 乳酸菌對(duì)低聚果糖和菊粉代謝能力的差異

FOS和菊粉被廣泛用于評(píng)價(jià)乳酸菌的益生功能。常以FOS或菊粉代替MRS培養(yǎng)基中的葡萄糖，觀察乳酸菌能否生長(zhǎng)或能否達(dá)到在MRS培養(yǎng)基生長(zhǎng)時(shí)的生物量。表1總結(jié)了近年來(lái)部分能利用FOS/菊粉的乳酸菌。能代謝FOS和菊粉的乳酸菌種類多樣，以乳桿菌屬和雙歧桿菌屬為主，乳桿菌對(duì)菊粉的利用較雙歧桿菌更常見(jiàn)。此外，乳酸菌與FOS和菊粉存在著特異性代謝關(guān)系，有的乳酸菌對(duì)FOS和菊粉均能代謝，如Lactobacillus paracaseiI321、L. caseiL1等，而B(niǎo)ifidobacterium longumB2a、B. bifidumB6A僅能代謝FOS[6]。

表1 近年報(bào)道的能代謝FOS/菊粉的乳酸菌Table 1 Overview of lactic acid bacteria capable of metabolizing FOS/inulin

乳酸菌在代謝FOS和菊粉時(shí)，對(duì)DP有不同偏好性。當(dāng)FOS（DP為4）和長(zhǎng)鏈菊粉（DP＞23）共同作為碳源時(shí)，L. paracaseisubsp.paracasei8700:2優(yōu)先代謝FOS，且不受FOS的DP影響[20]。類似地，B. longumBB536會(huì)先代謝scFOS）[21]。然而L. delbrueckiiTU-1、L. delbrueckiiJCM 1002T會(huì)優(yōu)先利用DP較高的FOS[22]。于雙歧桿菌而言，目前普遍認(rèn)為其優(yōu)先代謝低DP的FOS[21]。綜上所述，不同種類乳酸菌對(duì)不同DP的FOS的利用存在先后差異，因此代謝方式可能不同。

2 乳酸菌代謝低聚果糖和菊粉的途徑

通過(guò)薄層色譜法和高效液相色譜法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)L. paracasei1195在用FOS替換葡萄糖的改良MRS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，培養(yǎng)液中果糖、蔗糖含量會(huì)短暫增加，細(xì)胞提取物沒(méi)有FOS水解酶活性[10,23]。在L. plantarumP14和P76的無(wú)細(xì)胞上清液和細(xì)胞壁提取物中檢測(cè)到了水解酶活性，在細(xì)胞質(zhì)部分未檢測(cè)到[24]。相反，L. plantarumWCFS1培養(yǎng)液中未發(fā)現(xiàn)單糖和二糖的積累[25]，為此研究者們提出兩種乳酸菌代謝FOS的途徑。

2.1 水解轉(zhuǎn)運(yùn)途徑

水解轉(zhuǎn)運(yùn)途徑即先水解后轉(zhuǎn)運(yùn)的途徑，對(duì)L. paracaseiDSM 20020[22]、L. paracaseiDSM 23505[26]、L. caseiIAM 1045[27]和L. plantarumP14、P76[24]等而言，F(xiàn)OS先在胞外被水解酶水解，然后一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將水解產(chǎn)物（果糖、蔗糖和葡萄糖）轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入胞內(nèi)。以L. plantarumP14[24]為例分析其代謝過(guò)程：GFn和FFn型FOS或菊粉在胞外β-果糖苷酶作用下水解為果糖和scFOS，分別通過(guò)果糖和蔗糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（phosphotransferase system，PTS）轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)進(jìn)入細(xì)胞。即一方面scFOS在蔗糖PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)作用下穿過(guò)細(xì)胞膜并被磷酸化，再在蔗糖-6-磷酸水解酶（也稱作β-果糖苷酶）作用下水解成6-磷酸葡萄糖和果糖，6-磷酸葡萄糖再在磷酸己糖異構(gòu)酶的作用下轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖，果糖在果糖激酶作用下生成6-磷酸果糖，隨后進(jìn)入糖酵解途徑（圖1）。另一方面，胞外果糖通過(guò)果糖PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)后被磷酸化，在磷酸果糖激酶作用下生成1,6-二磷酸果糖繼續(xù)進(jìn)行糖酵解。

2.2 轉(zhuǎn)運(yùn)水解途徑

轉(zhuǎn)運(yùn)水解途徑即先轉(zhuǎn)運(yùn)再水解的途徑，如L. acidophilusNCFM[28]、L. delbrueckii[22]、L. plantarumST-III[29]以及L. plantarumWCFS[25]等是先通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)將FOS轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)胞內(nèi)，再在胞內(nèi)水解酶作用下水解成單糖后被利用。雙歧桿菌多以此方式代謝FOS，如B. breveUCC2003[30]、B. adolescentisG1[31]、B. lactisDSM 1014[32]。以L. plantarumWCFS1[25]為例分析其代謝過(guò)程：乳酸菌通過(guò)蔗糖PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)攝取胞外蔗糖或scFOS并將其磷酸化，接著胞內(nèi)果糖苷酶作用于葡萄糖和果糖之間糖苷鍵生成果糖和葡萄糖-6-磷酸；果糖在果糖激酶作用下磷酸化成果糖-6-磷酸，最后進(jìn)入糖酵解途徑（圖1）。有研究表明，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能力會(huì)隨FOS的DP增加而顯著減弱，因此，高DP的FOS、菊粉是通過(guò)先水解再轉(zhuǎn)運(yùn)的方式被代謝[25,29]。但Tsujikawa等[22]發(fā)現(xiàn)L. delbrueckiiTU-1的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)可直接將高DP菊粉型果聚糖轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)。因此，推測(cè)L. delbrueckiiTU-1代謝菊粉的途徑是先轉(zhuǎn)運(yùn)再水解。

圖1 乳酸菌代謝FOS的途徑[25]Fig. 1 FOS catabolic pathways of lactic acid bacteria[25]

3 乳酸菌代謝低聚果糖和菊粉的分子機(jī)制

由上述乳酸菌代謝FOS途徑可知，水解酶和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)在代謝過(guò)程中至關(guān)重要。許多研究表明水解酶和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的編碼基因一般位于同一個(gè)編碼FOS代謝的基因簇中，還包括相應(yīng)調(diào)控因子基因。表2歸納了預(yù)測(cè)到的在一些菌株中與FOS或菊粉代謝相關(guān)的基因簇。粉乳酸菌在代謝FOS或菊時(shí)，可能會(huì)有多個(gè)相關(guān)基因簇參與。Saulnier等[25]比較L. plantarumWCFS1在MRS培養(yǎng)基和改良MRS培養(yǎng)基（葡萄糖替換為FOS）中基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)位于同一基因簇中分別編碼果糖激酶（sacK1）、蔗糖PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（pts1BCA）、β-果糖苷酶（SacA）、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白（SacR）和α-葡萄糖苷酶（Agl）基因的表達(dá)明顯增強(qiáng)。Goh等[23]運(yùn)用微陣列分析發(fā)現(xiàn)一個(gè)由編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白（fosR）、果糖/甘露糖特異PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（fosABCD）、假定蛋白（fosX）和β-果糖苷酶（fosE）基因組成的fosRABCDXE操縱子參與了L. paracasei1195對(duì)FOS的代謝。Buntin[24]和Chen Chen[29]等發(fā)現(xiàn)L. plantarumST-III對(duì)FOS的代謝以及L. plantarumP14和L. plantarumP76對(duì)菊粉的代謝都有2 個(gè)相關(guān)基因簇參與。

表2 乳酸菌對(duì)FOS和菊粉代謝相關(guān)的酶及基因簇Table 2 Gene clusters and enzymes involved in metabolism of FOS and inulin in lactic acid bacteria

3.1 基因簇編碼蛋白

3.1.1 水解酶

與FOS和菊粉代謝相關(guān)水解酶有多種，均屬于GH32家族，如β-果糖苷酶（EC 3.2.1.26）[33-34]、菊粉酶（EC 3.2.1.7）[35-36]、果聚糖酶（EC 3.2.1.65）[35]和果聚糖β-果糖苷酶（EC 3.2.1.80）[26,37]等。許多研究者從分子水平證實(shí)了果糖苷酶對(duì)FOS的水解作用。如Chen Chen等[29,38]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)了參與L. plantarumST-III代謝FOS的果糖苷酶（編碼基因?yàn)閟acA），并用基因敲除實(shí)驗(yàn)證明果糖苷酶獨(dú)立負(fù)責(zé)FOS水解，sacA基因在大腸桿菌和L. rhamnosusGG的成功表達(dá)也進(jìn)一步證實(shí)了果糖苷酶對(duì)FOS的水解作用。由于代謝途徑存在胞內(nèi)水解和胞外水解，水解酶也有胞內(nèi)外之分，F(xiàn)OS胞外酶最典型特征是N端包含信號(hào)肽，C端有細(xì)胞壁的錨定位點(diǎn)LPQAG[23-24,39]。

通過(guò)分析酶水解產(chǎn)物和動(dòng)力學(xué)常數(shù)發(fā)現(xiàn)，不同酶作用的糖苷鍵種類以及酶切位點(diǎn)有所不同，而且同一種酶在不同菌株中對(duì)底物的活性都存在差異。如菊粉酶是內(nèi)切菊粉β(2-1)糖苷鍵，形成DP 3～6的FOS，果聚糖β-果糖苷酶卻作用于非還原末端的糖苷鍵，釋放果糖[40]。Ryan等[30]發(fā)現(xiàn)B. breveUCC 2003的果糖苷酶能夠催化裂解蔗糖或低DP的FOS中葡萄糖與相鄰果糖分子間的β(2-1)糖苷鍵，并且水解蔗糖時(shí)活力最高，然而B(niǎo). lactisDSM 10140T果糖苷酶是裂解末端果糖之間的β(2-1)糖苷鍵，作用于FOS時(shí)活力高于蔗糖[30,32]。因此水解酶酶切位點(diǎn)的不同將會(huì)影響水解產(chǎn)物種類及比例，這可能會(huì)影響乳酸菌代謝FOS過(guò)程中參與的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白種類。

研究表明果糖苷酶的底物特異性取決于其晶體結(jié)構(gòu)。果糖苷酶三維結(jié)構(gòu)具有典型的GH32家族蛋白結(jié)構(gòu)特征：N端為含有催化位點(diǎn)的β-螺旋槳結(jié)構(gòu)域（包括5 個(gè)β-折疊保守區(qū)域），C端為與底物結(jié)合有關(guān)的β-三明治結(jié)構(gòu)域，酶活性中心位于β-螺旋槳結(jié)構(gòu)的中心區(qū)域，Asp-63位點(diǎn)充當(dāng)親核試劑，Glu-234位點(diǎn)作為廣義酸堿（圖2）[41-42]。據(jù)報(bào)道，通常果糖苷酶催化水解底物的機(jī)理是：Glu為底物氧原子提供質(zhì)子，Asp作為親核體攻擊底物果糖殘基的異頭C-2碳原子，形成了果糖殘基-共價(jià)酶復(fù)合物，同時(shí)底物其余殘基被釋放，然后Glu從水分子中奪走一個(gè)質(zhì)子（作為廣義堿）使得羥基取代酶-果糖殘基復(fù)合物的果糖殘基，從而釋放果糖使酶活性中心恢復(fù)[43]。此外，Mendoza-Llerenas等[44]認(rèn)為β-螺旋槳結(jié)構(gòu)域中擁有開(kāi)放式漏斗狀通道的果糖苷酶比僅有一個(gè)空洞的果糖苷酶具有更廣泛的底物選擇性。

圖2 β-果糖苷酶的三維結(jié)構(gòu)[41]Fig. 2 Three-dimensional structure of β-fructofuranosidase[41]

3.1.2 轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)

乳酸菌糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)主要有4種：PTS、腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ATP-binding cassette transporter，ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、透性酶、同向轉(zhuǎn)運(yùn)體[45]。就目前研究結(jié)果而言，蔗糖PTS和果糖/甘露糖PTS是參與乳酸菌代謝FOS和菊粉最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，如L. plantarumWCFS1[25]、L. paracasei1195[23]、L. plantarumP14和L. plantarumP76[24]等；也有少數(shù)乳酸菌是通過(guò)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和透性酶轉(zhuǎn)運(yùn)FOS或其水解產(chǎn)物，如L. acidophilusNCFM[28]、B. breveUCC2003[30]等。PTS由磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP）依賴性蛋白激酶I（PEP-dependent protein kinase enzyme I，EI）、組氨酸磷酸載體蛋白（histidine-phosphoryl protein，HPr）以及糖特異性酶II復(fù)合物（enzyme II，EII）組成，其中前兩者是無(wú)底物識(shí)別特異性的可溶性胞內(nèi)蛋白，EII可特異性識(shí)別和轉(zhuǎn)運(yùn)底物分子，并且包含4 個(gè)結(jié)構(gòu)域（EIIA、EIIB、EIIC和EIID），但有的不含EIID[46]。PTS是一種需能量的可逆濃度運(yùn)輸系統(tǒng)，碳源分子經(jīng)過(guò)該系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)后會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化（被磷酸化）。一般PTS轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程為：HPr在EI的作用下接受來(lái)自磷酸烯醇式丙酮酸的磷酸基團(tuán)被磷酸化，接著依次將磷酸基團(tuán)傳遞給EIIA、EIIB，然后胞外碳源分子經(jīng)EIIC、EIID轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)胞內(nèi)后接受磷酸基團(tuán)成為磷酸化的碳源分子而被代謝[47]，其中EIIB的磷酸化和EIIC（EIID）的轉(zhuǎn)運(yùn)是緊密相連的[48]。

乳酸菌在代謝FOS時(shí)參與的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)可能不止1 個(gè)，如Chen Chen等[29]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析和基因敲除實(shí)驗(yàn)證明SacPTS1和SacPTS2編碼的蔗糖PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)均參與L. plantarumST-III對(duì)FOS的轉(zhuǎn)運(yùn)。Buntin等[24]發(fā)現(xiàn)L. plantarumP14、P76對(duì)菊粉的代謝有蔗糖PTS和果糖/甘露糖PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的共同參與。此外，從表2中可以看出，只要是先水解再轉(zhuǎn)運(yùn)的菌株，其代謝過(guò)程中參與的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)均有果糖/甘露糖PTS，從現(xiàn)有收集到的文獻(xiàn)推測(cè)，若乳酸菌在胞外水解FOS或菊粉，那么水解產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運(yùn)由果糖/甘露糖PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)負(fù)責(zé)，如果是在胞內(nèi)代謝FOS，那么參與的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)可能為蔗糖PTS或ABC轉(zhuǎn)運(yùn)或透性酶。

3.1.3 調(diào)控因子

目前已命名編碼參與FOS代謝調(diào)控因子的基因有MsmR、fosR、sacR、LacIfos。B. breveUCC2003中LacIfos產(chǎn)物的N端與GalR-LacI家族中和DNA結(jié)合的區(qū)域具有明顯相似性，即螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)，C端則是與糖結(jié)合區(qū)域[30]。此外，通過(guò)NCBI網(wǎng)站查詢到L. acidophilusNCFM、L. plantarumWCFS1、L. plantarumST-III調(diào)控因子是阻遏蛋白，分別為MsmR、SacR、SacR1；相反L. paracasei1195的調(diào)控因子FosR是轉(zhuǎn)錄激活蛋白。與FOS代謝相關(guān)的基因簇均受FOS或菊粉誘導(dǎo)，因此，探討乳酸菌代謝FOS/菊粉的機(jī)制離不開(kāi)對(duì)其代謝調(diào)控方式的總結(jié)。

3.2 乳酸菌對(duì)FOS和菊粉的代謝調(diào)控

3.2.1 局部調(diào)控

局部調(diào)控即局部轉(zhuǎn)錄因子在有或無(wú)誘導(dǎo)物存在時(shí)，與操縱基因作用調(diào)控結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄。Chen Chen等[49]在排除葡萄糖引起的全局調(diào)控情況下，通過(guò)基因敲除實(shí)驗(yàn)證明編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的sacR1和sacR2對(duì)L. plantarumST-III代謝FOS具有局部調(diào)控作用。Francke等[50]在植物乳桿菌WCFS1中發(fā)現(xiàn)了參與蔗糖或FOS代謝的局部轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Lp_0188（sacR）。因此，鑒于L. plantarumST-III和L. plantarumWCFS1在誘導(dǎo)物（FOS）存在時(shí)，基因簇被誘導(dǎo)表達(dá)，且基因簇中調(diào)控因子產(chǎn)物為阻遏蛋白，推測(cè)其局部調(diào)控方式屬于可誘導(dǎo)的負(fù)調(diào)控。即當(dāng)FOS（誘導(dǎo)物）不存在時(shí)，阻遏蛋白與操縱基因結(jié)合，阻止結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄；當(dāng)FOS（誘導(dǎo)物）存在時(shí)，F(xiàn)OS與阻遏蛋白結(jié)合并從操縱基因上脫離，RNA聚合酶啟動(dòng)結(jié)構(gòu)基因的正常轉(zhuǎn)錄。而對(duì)L. paracasei1195而言，誘導(dǎo)物（FOS）存在時(shí)，基因簇同樣被誘導(dǎo)表達(dá)，但其基因簇中編碼調(diào)控因子fosR的產(chǎn)物是激活蛋白，推測(cè)其局部調(diào)控方式屬可誘導(dǎo)的正調(diào)控。即當(dāng)FOS（誘導(dǎo)物）不存在時(shí)，激活蛋白以失活狀態(tài)存在，無(wú)法與操縱基因結(jié)合，因此結(jié)構(gòu)基因不轉(zhuǎn)錄；當(dāng)FOS（誘導(dǎo)物）存在時(shí)，激活蛋白被FOS激活，與操縱基因結(jié)合開(kāi)啟結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。此外Chen Chen等[49]通過(guò)電泳凝膠遷移實(shí)驗(yàn)和染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)證明了L. plantarumST-III的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子SacR1和SacR2能與啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（transcription factor binding site，TFBS）以高親和力進(jìn)行特異性結(jié)合。

3.2.2 全局調(diào)控

除局部調(diào)控外，乳酸菌對(duì)糖的代謝調(diào)控往往還有全局調(diào)控。全局調(diào)控是由易被宿主利用的糖（如葡萄糖）所誘導(dǎo)的代謝調(diào)控蛋白A（catabolite control protein A，CcpA）與代謝反應(yīng)元件（catabolite response element，cre）結(jié)合完成的。CcpA對(duì)碳代謝物的調(diào)控可分為碳代謝阻遏（carbon catabolite repression，CCR）效應(yīng)和碳代謝物激活（carbon catabolite activation，CCA）效應(yīng)[51]。cre是CcpA介導(dǎo)CCR效應(yīng)的重要順勢(shì)調(diào)控元件[52]。革蘭氏陽(yáng)性菌中與CcpA結(jié)合的cre位點(diǎn)位置有所不同，有的位于啟動(dòng)子區(qū)域，也有位于啟動(dòng)子下游。有學(xué)者對(duì)L. plantarumST-III FOS代謝相關(guān)基因簇中潛在cre位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變并結(jié)合電泳凝膠遷移實(shí)驗(yàn)證明CcpA與其4 個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域的6 個(gè)cre位點(diǎn)特異性結(jié)合[53-54]。這種直接與cre位點(diǎn)結(jié)合的方式為CcpA的直接調(diào)控，除此之外，CcpA還可通過(guò)間接調(diào)控來(lái)調(diào)控其他基因表達(dá)，即CcpA引起局部調(diào)控因子變化，從而使得受控于局部調(diào)控因子且啟動(dòng)子區(qū)域不含cre位點(diǎn)的基因也因此而發(fā)生變化。如盧艷青[55]通過(guò)分析CcpA基因敲除前后利用FOS和葡萄糖的差異轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)，有些已確定發(fā)生了顯著變化的基因，其啟動(dòng)子區(qū)域卻不含cre位點(diǎn)，推測(cè)這些基因可能受到CcpA間接調(diào)控。

在革蘭氏陽(yáng)性菌中CcpA主要起負(fù)調(diào)控作用，即主要為CCR效應(yīng)，也稱葡萄糖效應(yīng)。比如L. paracasei1195在含低濃度葡萄糖的FOS環(huán)境生長(zhǎng)時(shí)呈現(xiàn)典型二次生長(zhǎng)現(xiàn)象，即葡萄糖先被利用，待葡萄糖利用完，F(xiàn)OS代謝相關(guān)基因才開(kāi)始表達(dá)[23]。調(diào)控原理即：當(dāng)葡萄糖等速效碳源存在時(shí)，胞內(nèi)高水平ATP/Pi（ATP與無(wú)機(jī)磷酸比例）與葡萄糖代謝產(chǎn)物激活Hpr激酶/磷酸酯酶活性，將HPr的Ser46位點(diǎn)磷酸化，形成HPr-Ser46-P，然后HPr-Ser46-P與CcpA結(jié)合形成復(fù)合物，與非速效碳源（FOS）代謝基因簇啟動(dòng)子區(qū)域cre位點(diǎn)結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄；當(dāng)葡萄糖不存在時(shí)，His15被HPr磷酸化，HPr-Ser46-P將失去磷酸化反應(yīng)，F(xiàn)OS被正常利用，抑制效果消失[23,56]（圖3）。

圖3 CcpA介導(dǎo)的CCR效應(yīng)Fig. 3 Mechanism of CcpA-mediated CCR effect in lactic acid bacteria

因此，乳酸菌對(duì)FOS（或菊粉，下同）的代謝調(diào)控（全局＋局部）大致可分為4種情況（以阻遏蛋白為例）：僅葡萄糖存在、僅FOS存在、葡萄糖和FOS均不存在、葡萄糖和FOS都存在（圖4）。只有葡萄糖時(shí)，局部調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物（阻遏蛋白）與操縱基因結(jié)合，HPr-Ser46-P和CcpA結(jié)合形成復(fù)合物并與啟動(dòng)子區(qū)域cre位點(diǎn)結(jié)合，阻止FOS代謝相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)；只有FOS時(shí)，結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄沒(méi)有CcpA復(fù)合物（即沒(méi)有CcpA復(fù)合物與啟動(dòng)子區(qū)域的cre位點(diǎn)結(jié)合）抑制，阻遏蛋白與FOS（誘導(dǎo)劑）結(jié)合，從操縱基因上脫離，解除對(duì)FOS代謝相關(guān)基因的抑制；葡萄糖和FOS都不存在時(shí)，結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄同樣沒(méi)有CcpA復(fù)合物的抑制，阻遏蛋白與操縱基因結(jié)合抑制FOS代謝相關(guān)簇表達(dá)；葡萄糖和FOS都存在時(shí)，阻遏蛋白與FOS（誘導(dǎo)劑）結(jié)合，脫離結(jié)構(gòu)基因，解除其對(duì)FOS相關(guān)基因簇啟動(dòng)子區(qū)域的抑制，但是這時(shí)全局調(diào)節(jié)因子CcpA與啟動(dòng)子區(qū)域cre位點(diǎn)結(jié)合，阻礙了RNA聚合酶與啟動(dòng)子結(jié)合，從而抑制FOS代謝相關(guān)基因的表達(dá)，即出現(xiàn)了CCR效應(yīng)。乳酸菌對(duì)碳源的代謝調(diào)控非常復(fù)雜，有些基因只受局部調(diào)控因子作用，有的會(huì)受到全局調(diào)控和局部調(diào)控的雙重作用，同時(shí)有的局部調(diào)控因子還受到全局調(diào)控的作用，因此這背后復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還亟待解析。

圖4 乳酸菌對(duì)FOS（或菊粉）的代謝調(diào)控Fig. 4 Metabolic regulation of FOS (or inulin) by lactic acid bacteria

總的來(lái)說(shuō)，乳酸菌對(duì)FOS/菊粉的代謝機(jī)制為：在誘導(dǎo)物存在或者不存在的情況下，乳酸菌基因組中與碳代謝相關(guān)的調(diào)控蛋白啟動(dòng)或抑制FOS/菊粉代謝相關(guān)基因簇的表達(dá)，即影響編碼水解酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)FOS或菊粉的代謝或不代謝。

4 低聚果糖或菊粉類合生元的應(yīng)用

乳酸菌代謝菊粉或FOS的能力對(duì)于合生元（特別是協(xié)同性合生元）發(fā)揮生理作用起著重要作用。本文對(duì)近年來(lái)（2018ü2021年）關(guān)于菊粉/FOS合生元的報(bào)道進(jìn)行了總結(jié)（表3）。研究表明菊粉/FOS合生元在對(duì)抗2型糖尿病的并發(fā)癥、調(diào)節(jié)免疫以及改善腸道健康方面具有積極的影響。Kanjan等[9]對(duì)協(xié)同性合生元進(jìn)行了體外研究，發(fā)現(xiàn)將L. paracaseiI321（能降解菊粉）和菊粉同時(shí)應(yīng)用到糞便菌群時(shí)，菊粉使得L. paracaseiI321在糞便菌群的競(jìng)爭(zhēng)環(huán)境中存活并占優(yōu)勢(shì)，同時(shí)其代謝過(guò)程分泌的胞外酶將菊粉水解為scFOS和果糖，刺激糞便中不能代謝菊粉但能代謝FOS的菌（乳桿菌和雙歧桿菌）的生長(zhǎng)，使這些菌協(xié)同抑制沙門氏菌的生長(zhǎng)。

表3 近年關(guān)于FOS/菊粉合生元的應(yīng)用研究Table 3 Recent applications of synbiotics containing FOS/inulin

5 結(jié) 語(yǔ)

本文綜述了乳酸菌對(duì)FOS和菊粉的代謝能力差異，乳酸菌代謝FOS和菊粉的途徑、代謝機(jī)制以及FOS/菊粉類合生元的應(yīng)用等。目前乳酸菌代謝FOS和菊粉的兩種途徑已較為明了，即先轉(zhuǎn)運(yùn)再水解和先水解再轉(zhuǎn)運(yùn)，但是更為深入、清楚的代謝機(jī)制，尤其是調(diào)控機(jī)制還亟待解析。新技術(shù)手段的發(fā)展，特別是基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)的發(fā)展，將為代謝機(jī)制的解析提供更好的手段。此外，雖然益生菌/益生元單獨(dú)使用均有益生效應(yīng)，但是從實(shí)際應(yīng)用以及長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展來(lái)看，合理利用代謝機(jī)制促進(jìn)FOS或菊粉更有效地被乳酸菌利用、賦予乳酸菌與其他微生物競(jìng)爭(zhēng)的優(yōu)勢(shì)、開(kāi)發(fā)科學(xué)健康的合生元（尤其是協(xié)同性合生元）產(chǎn)品將有望成為未來(lái)的熱門課題。