釀酒酵母異源合成檸檬烯的研究進(jìn)展

胡智慧，李弘軒，郭學(xué)武,2，張翠英，肖冬光,*

（1.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.中國輕工業(yè)濃香型白酒固態(tài)發(fā)酵重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓 644000）

萜類化合物是植物的一類次生代謝產(chǎn)物，主要由異戊二烯單元組成的化合物以及其衍生物構(gòu)成。萜類化合物根據(jù)所含異戊二烯數(shù)目的不同可分為單萜化合物（C10）、倍半萜化合物（C15）、二萜化合物（C20）、三萜化合物（C30）、四萜化合物（C40）和多萜化合物（C10n）等[1]。多種萜類化合物已在醫(yī)藥、化妝品、食品等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，其中具有代表性的實(shí)例包括抗瘧藥青蒿素[2]（倍半萜）、香精原料檀香萜[3]（倍半萜）、抗癌藥紫杉醇[4]（二萜）、抗菌藥丹參酮[5]（二萜）、抗腫瘤藥人參皂苷[6]（三萜）和抗氧化的番茄紅素[7]（四萜）等。

檸檬烯屬于單萜類化合物，化學(xué)式為C10H16。它主要存在于柑橘類（如檸檬、柑橘等）的果皮和果肉中，已被美國食用香料與提取物制造商協(xié)會(huì)（Flavor and Extract Manufactures Association of the Unite States，F(xiàn)EMA）認(rèn)定其毒性屬一般公認(rèn)安全級(jí)，并已被美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)食用[8]。檸檬烯化學(xué)結(jié)構(gòu)內(nèi)含有一個(gè)手性碳原子，所以有兩種光學(xué)異構(gòu)體，右旋檸檬烯（D-檸檬烯，如圖1A所示）和左旋檸檬烯（L-檸檬烯，如圖1B所示），此外還存在一種外消旋體（D/L-檸檬烯，如圖1C所示）[9]。L-檸檬烯具有類似松油和松脂的芳香氣味，而D-檸檬烯則具有類似檸檬或甜橙的香味，已被應(yīng)用于香精領(lǐng)域，如作為添加劑添加到冰激凌、巧克力等中來調(diào)整口感；亦可在橙香、果香、檸檬等香型配方中作為修飾劑[10]；檸檬烯同時(shí)還具有防腐保鮮、抑菌、抗氧化、抗炎癥、抗腫瘤、祛痰平喘和利膽溶石等多種生理活性，因此已被應(yīng)用于食品保鮮、醫(yī)療領(lǐng)域[10]。此外，檸檬烯的衍生物如紫蘇醇、松油醇、香芹酮、香芹醇等也具有重要的應(yīng)用價(jià)值[11]。

檸檬烯具有重要的生理功能和很高的應(yīng)用價(jià)值，但其提取受植物季節(jié)性與提取工藝的限制，而合成生物學(xué)為更高效地獲取檸檬烯提供了新思路。釀酒酵母具有遺傳背景清晰、遺傳改造技術(shù)成熟、存在甲羥戊酸（mevalonate pathway，MVA）途徑等優(yōu)勢(shì)，已廣泛作為合成萜類化合物的底盤微生物。本文主要回顧了近幾年利用代謝工程改造釀酒酵母異源合成檸檬烯取得的成就，闡述了以釀酒酵母作為底盤微生物，利用代謝工程和合成生物學(xué)的手段提高檸檬烯產(chǎn)量的合成策略，還討論了如何減輕檸檬烯對(duì)宿主細(xì)胞的毒性和提高宿主對(duì)檸檬烯的耐受性。

圖1 D-檸檬烯（A）、L-檸檬烯（B）、D/L-檸檬烯（C）的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structures of D-limonene (A), L-limonene (B),and D/L-limonene (C)

1 釀酒酵母中異源合成檸檬烯的研究進(jìn)展

1.1 檸檬烯合成酶基因的克隆

雖然釀酒酵母中具有MVA路徑，能合成檸檬烯的前體物，但是體內(nèi)缺乏相應(yīng)的檸檬烯合成酶，因此野生釀酒酵母不具有合成檸檬烯的能力。為了實(shí)現(xiàn)釀酒酵母異源合成檸檬烯的目標(biāo)，需要引入外源的檸檬烯合成酶。迄今為止，研究者已經(jīng)從不同的植物中分離得到了多種檸檬烯合成酶基因（表1），其中來自檸檬（Citrus limon）、蜜柑（Citrus unshiu）、橙子（Citrus sinensis）、薄荷（Mentha spicata）、白蘇（Perilla frutescens）、荊芥（Schizonepeta tenuifolia）、藿香（Agastache rugose）、番茄（Solanum habrochaites）等中的檸檬烯合成酶已在大腸桿菌（Escherichia coli）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）、產(chǎn)脂酵母（Rhodosporidium toruloides）、藍(lán)藻（Anabaenasp）、藍(lán)細(xì)菌（Synechococcus elongatus）等宿主中成功表達(dá)。

表1 多種植物中分離的檸檬烯合成酶基因及表達(dá)Table 1 Cloning and expression of limonene synthase genes from a variety of plants

1.2 釀酒酵母異源合成萜類化合物的研究進(jìn)展

目前國內(nèi)外已有很多科研工作者利用合成生物學(xué)的手段將萜類合成酶在釀酒酵母中進(jìn)行表達(dá)，成功實(shí)現(xiàn)異源合成植物特有的萜類化合物。表2列舉了近幾年利用釀酒酵母異源合成植物萜類化合物的實(shí)例，主要通過代謝工程的手段過量表達(dá)萜類合成途徑中的限速酶、全局轉(zhuǎn)錄因子，強(qiáng)化萜類合成代謝通量；采用氨基酸抑制型啟動(dòng)子、銅離子抑制型啟動(dòng)子、弱啟動(dòng)子等替換合成萜類化合物前體物的競爭路徑中關(guān)鍵基因的啟動(dòng)子，弱化其表達(dá)的同時(shí)減少合成萜類化合物前體物的過度消耗；從植物中篩選或者挖掘高活性和專一性的萜類合成酶或者采用蛋白質(zhì)工程策略，對(duì)萜類合成酶進(jìn)行定向進(jìn)化，從中篩選出高催化活性的萜類合成酶，為進(jìn)一步提高萜類化合物的產(chǎn)量奠定基礎(chǔ)。

表2 近年來通過改造釀酒酵母生產(chǎn)植物萜類物質(zhì)的研究進(jìn)展Table 2 Recent progress in the production of plant terpenoids by engineered Saccharomyces cerevisiae

2 釀酒酵母中異源合成檸檬烯的策略

釀酒酵母中異源合成檸檬烯的策略如圖2所示，主要集中在檸檬烯合成路徑的改造與優(yōu)化，上游主要是通過引入外源基因改造和強(qiáng)化原有的乙酰-CoA代謝路徑或者構(gòu)建新的乙酰-CoA代謝路徑，從而提高乙酰-CoA的供應(yīng)量；中游主要是通過過量表達(dá)或者組合表達(dá)MVA途徑中的限速酶、甾醇合成的全局轉(zhuǎn)錄因子（編碼基因upc2-1）等措施強(qiáng)化MVA的代謝通量，其次就是引入外源基因構(gòu)建新的代謝路徑，減少碳的流失和降低能量、還原力的消耗，進(jìn)而建立檸檬烯合成的最佳代謝路徑，最后就是強(qiáng)化檸檬烯合成過程中還原型輔酶II（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）的供應(yīng)，提供充足的還原力；下游主要是弱化競爭路徑，減少檸檬烯合成底物的流失，其次就是將檸檬烯合成酶融合表達(dá)及檸檬烯合成路徑中酶的亞細(xì)胞定位表達(dá)等策略，進(jìn)一步提高檸檬烯合成酶的催化效率?？傊?，這些合成策略將為檸檬烯的合成和其他萜類化合物的異源合成提供新的思路和參考。

2.1 檸檬烯合成路徑的改造及優(yōu)化

2.1.1 強(qiáng)化乙酰-CoA供應(yīng)量

圖2 代謝工程改造釀酒酵母異源合成檸檬烯的策略Fig. 2 Strategic diagram of metabolic pathways for the heterologous production of limonene in S. cerevisiae

釀酒酵母中乙酰-CoA主要來源于線粒體的丙酮酸脫氫酶（pyruvate dehydrogenase，PDH）途徑，其次來源于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)內(nèi)的PDH旁路途徑。乙酰-CoA作為三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循環(huán)的起始化合物以及各種生物合成途徑的關(guān)鍵前體，對(duì)維持細(xì)胞生長和發(fā)揮功能至關(guān)重要。檸檬烯的合成路徑構(gòu)建于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)內(nèi)，其合成也需要大量的乙酰-CoA，即每合成一分子檸檬烯，需要消耗6分子乙酰-CoA，然而酵母體內(nèi)又缺少將大量的乙酰-CoA從線粒體中轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，因此細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)內(nèi)的乙酰-CoA含量對(duì)檸檬烯的合成至關(guān)重要。目前，科研工作者已通過多種措施調(diào)控和改造釀酒酵母細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的內(nèi)源代謝途徑或者引入外源的代謝路徑來提高乙酰-CoA的供應(yīng)量，同時(shí)減少能量和輔酶NADPH的消耗（圖2），其中包括細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)內(nèi)重新構(gòu)建PDH旁路，替換原有高耗能、反饋抑制強(qiáng)的PDH代謝旁路，從而提高了乙酰-CoA的利用率[42-44]；引入Mus. musculus異源的ATP-檸檬酸裂解酶（ATP-citrate lyase，ACL）途徑，將線粒體內(nèi)的檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)內(nèi)，增加乙酰-CoA的供應(yīng)來源[45-46]；引入大腸桿菌的乙?；胰┟摎涿福╝cetylating acetaldehyde dehydrogenase，A-ALD）途徑，增加乙酰-CoA的供應(yīng)量[47]；引入外源的磷酸轉(zhuǎn)酮酶/磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶（phosphoketolase/phosphotransacetylase，PK/PTA）途徑，不僅增加了乙酰-CoA的供應(yīng)量，還減少了能量和輔酶的消耗[48]；引入大腸桿菌的PDH路徑，不僅增加了乙酰-CoA的供應(yīng)量，還增加了輔酶NADPH的供應(yīng)[49]。

2.1.2 調(diào)節(jié)MVA途徑的代謝通量及路徑的優(yōu)化

釀酒酵母的MVA途徑涉及多步反應(yīng)，其中含有多個(gè)限速酶，只有解除限速酶的約束才能實(shí)現(xiàn)流向底物的代謝通量最大化，但很難通過過量表達(dá)限速酶等單一調(diào)控手段實(shí)現(xiàn)MVA途徑的代謝通量最大化，因此可采取過量表達(dá)甾醇合成的全局轉(zhuǎn)錄因子基因upc2-1，全局調(diào)控MVA途徑的代謝通量[2]（圖2）；對(duì)外源基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化、梯度調(diào)控啟動(dòng)子強(qiáng)度[50-51]、調(diào)節(jié)核糖體結(jié)合位點(diǎn)（ribosomebinding site，RBS）結(jié)合強(qiáng)度[52]等方法過量表達(dá)或者組合過表達(dá)MVA途徑的關(guān)鍵基因tHMGR、IDI1、ERG12，進(jìn)而達(dá)到強(qiáng)化MVA途徑的通量和積累足夠GPP的目的[39,53]（圖2）；過量表達(dá)tRNA合成的負(fù)調(diào)控因子基因MAF1，減少異戊烯基焦磷酸（isopentenyl diphosphate，IPP）被分流，強(qiáng)化IPP和二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyl diphosphate，DMAPP）流向GPP[54-55]（圖2）。檸檬烯的前體物（IPP/DMAPP）合成需要大量的ATP和輔酶NADPH，這對(duì)宿主的能量代謝和輔酶供應(yīng)提出了更高的要求，同時(shí)也直接影響著目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量及產(chǎn)率。為了解決能量與輔酶供應(yīng)的問題，科研工作者引入外源基因構(gòu)建多個(gè)新的代謝路徑，減少了碳的流失并降低了能量、還原力的消耗，進(jìn)而建立檸檬烯合成的最佳代謝路徑。各個(gè)路徑的碳流失、能量和輔酶的消耗如表3所示。

表3 釀酒酵母中通過4種路徑合成IPP和DMAPP之間的差異Table 3 Comparison of four pathways for the generation of IPP/DMAPP in yeast

2.1.3 強(qiáng)化輔酶NADPH的供應(yīng)

酵母細(xì)胞內(nèi)氧化型輔酶I（NAD＋）/還原型輔酶I（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）、氧化型輔酶II（NADP＋）/還原型輔酶II（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）等輔助因子對(duì)是電子傳輸鏈的重要組成部分，至少參與800種生化反應(yīng)，其中輔因子水平（氧化態(tài)/還原態(tài)之間的比率）直接影響著代謝路徑的通量及目標(biāo)產(chǎn)物的合成，因此可以通過輔酶工程強(qiáng)化細(xì)胞中輔因子水平，驅(qū)動(dòng)代謝通量朝著目標(biāo)產(chǎn)物的合成方向。釀酒酵母中脂肪酸的生物合成需要大量的輔酶NADPH，強(qiáng)化轉(zhuǎn)氫酶體系和戊糖磷酸途徑可提高細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)內(nèi)NADH轉(zhuǎn)換成NADPH的轉(zhuǎn)換量，進(jìn)而提高脂肪酸的合成量[59]。釀酒酵母中那可?。∟oscapine）的生物合成也會(huì)消耗大量的NADPH[60]，Li Yanran等[61]通過過表達(dá)酵母自身的NADH激酶、3種異檸檬酸還原酶、丙酮酸脫羧酶、預(yù)苯酸脫氫酶、乙醛脫氫酶和NADP依賴性甘油脫氫酶，從而可以顯著地提高NADPH的供應(yīng)和那可汀的產(chǎn)量。3-羥丙酸（3-hydroxypropionic acid，3-HP）的合成也需要大量的NADPH，Chen Yun等[62]通過過表達(dá)異源NADP＋依賴的三磷酸甘油醛脫氫酶可以使釀酒酵母中的3-HP產(chǎn)量提高30%。輔酶NADPH作為檸檬烯異源合成過程中主要的輔酶因子，其持續(xù)高效的供應(yīng)能力決定著檸檬烯合成路徑的代謝通量，因此，提高輔酶NADPH供應(yīng)能力對(duì)提高檸檬烯及其他萜類化合物的產(chǎn)量至關(guān)重要，具體措施如圖3所示。

圖3 輔酶工程強(qiáng)化檸檬烯及萜類化合物的合成效率Fig. 3 Cofactor engineering to enhance biosynthetic efficiency of limonene and terpenoids

2.1.4 弱化競爭路徑與關(guān)鍵酶的融合表達(dá)

GPP合成酶是一種雙功能酶（GPP合成酶/FPP合成酶），不僅能催化一分子IPP和一分子DMAPP生成一分子GPP，又能繼續(xù)催化一分子GPP和一分子IPP生成一分子FPP，然而連續(xù)的反應(yīng)限制了游離GPP的積累和檸檬烯的合成，因此提高GPPS的活性，減少GPP流向FPP，進(jìn)而增加游離形式的GPP數(shù)量，這將有助于進(jìn)一步提高檸檬烯的產(chǎn)量。FPP對(duì)細(xì)胞膜形成及細(xì)胞的生長至關(guān)重要，因此不能敲除ERG20基因，只能采取弱化FPP活性的策略來提高GPP的數(shù)量，即GPP合成酶Erg20p的單突變體（K197G、S、C、D、T、E）[63-65]和Erg20p的雙突變體（F96W-N127W）[39-40,66-67]對(duì)GPP的親和力高于FPP，弱化了GPP被分流到FPP，進(jìn)而更利于GPP的積累和檸檬烯的合成。Schilmiller等[68]從番茄（Solanum lycopersicum）中發(fā)現(xiàn)了NDPS1，其可催化IPP和DMAPP形成NPP（GPP的順式異構(gòu)體），同時(shí)也揭示了以NPP和GPP作為底物合成不同單萜化合物的路徑，其中D-檸檬烯、α-松油烯、α-蒎烯等單萜化合物的合成均可采用NPP、GPP作為底物，但以NPP作為底物的合成路徑短于GPP，表明NPP是最佳底物；而羅勒烯、月桂烯、芳樟醇等單萜化合物的合成不能以NPP作為底物，只能以GPP作為底物。Kumar等[69]也對(duì)D-LS進(jìn)行了酶動(dòng)力學(xué)分析，表明NPP是D-LS的最佳底物。Cheng Si[39]和Hu Zhihui[41]等已在釀酒酵母中建立了NPP作為檸檬烯合成最適底物的新合成路徑。

在萜類化合物異源合成過程中常采用代謝工程的方法強(qiáng)化關(guān)鍵基因的表達(dá)或者改變關(guān)鍵酶的活性，但是目前這些方法往往不能夠使代謝通量最大化地流向目標(biāo)產(chǎn)物，而酶融合表達(dá)被認(rèn)為是提高酶的催化效率和萜類化合物產(chǎn)量的有效策略[40,53]。在利用釀酒酵母、大腸桿菌等微生物細(xì)胞工廠異源合成萜類化合物的過程中，代謝路徑中會(huì)存在多個(gè)順序酶催化，即一個(gè)酶的催化產(chǎn)物是下一步酶的催化底物，而當(dāng)萜類合成酶在宿主內(nèi)成功表達(dá)后便構(gòu)成新的順序酶催化，游離狀態(tài)的萜類合成酶與底物在空間上的距離難以控制，這就制約了外源酶的催化效率[70]。采用融合酶的表達(dá)方式將代謝路徑中的萜類合成酶與一個(gè)或者多個(gè)順序酶串聯(lián)融合表達(dá)，把不同酶的功能整合到一個(gè)融合酶中，通過控制其空間靠近效應(yīng)，進(jìn)一步提高酶的催化效率，達(dá)到提高萜類化合物產(chǎn)量的目的。為了避免融合酶的不同結(jié)構(gòu)域在折疊、催化過程中存在的相互干擾，在融合酶的構(gòu)建過程中需要引入柔性連接肽或者蛋白支架[71]，進(jìn)而適當(dāng)?shù)乇３置概c酶之間的距離。通過改變酶與酶之間的空間組織關(guān)系，一般指融合方向和連接肽，能夠在空間上縮短酶與酶、酶與底物之間的距離，增加酶與底物的局部濃度，減少其他代謝物的干擾，同時(shí)減少中間產(chǎn)物的擴(kuò)散和被競爭路徑所利用，進(jìn)而提高融合酶的催化效率[72]。線粒體是釀酒酵母中獨(dú)立的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，具有乙酰-CoA、ATP供應(yīng)充足等優(yōu)勢(shì)，可作為萜類化合物合成的第二場所。Yee等[73]已將香葉醇的合成路徑定位于酵母的線粒體中，提高了香葉醇的產(chǎn)量。目前檸檬烯合成途徑尚未在線粒體中構(gòu)建，今后的研究可將檸檬烯合成途徑的酶整體定位于線粒體中表達(dá)，再結(jié)合細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)內(nèi)的檸檬烯合成途徑，同時(shí)調(diào)控基質(zhì)和線粒體的檸檬烯合成途徑，進(jìn)而達(dá)到提高檸檬烯產(chǎn)量的目的。近年來采用酶的融合表達(dá)與定位的策略，改造釀酒酵母異源合成萜類化合物的實(shí)例如表4所示。

表4 酶的融合表達(dá)與亞細(xì)胞定位表達(dá)Table 4 Fusion expression and subcellular localization of enzymes

2.2 檸檬烯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及耐性蛋白的挖掘

檸檬烯等萜類化合物在釀酒酵母中過量的積累會(huì)對(duì)其自身產(chǎn)生毒害作用，進(jìn)而影響其生長及發(fā)酵性能。為了減弱檸檬烯對(duì)酵母持續(xù)的毒害作用，通常在發(fā)酵過程中加入有機(jī)溶劑（正己烷、十二烷、十四酸異丙酯、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二異壬酯等），進(jìn)而將發(fā)酵液中的檸檬烯萃取出來，雙相發(fā)酵可以有效地減弱檸檬烯對(duì)酵母的毒害作用[53,75]。研究如何提高酵母菌株快速轉(zhuǎn)運(yùn)檸檬烯到細(xì)胞外或者增強(qiáng)酵母耐受檸檬烯的能力，將有助于進(jìn)一步緩解檸檬烯對(duì)細(xì)胞的傷害及提升檸檬烯的合成量。Ro等[76]研究發(fā)現(xiàn)在青蒿酸的脅迫下釀酒酵母體內(nèi)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有助于提高菌株耐受青蒿酸的能力。釀酒酵母中有31種ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（表5）[77-78]，這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白一般具有相似的分子結(jié)構(gòu)和功能，主要負(fù)責(zé)不同物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，其中也包括對(duì)細(xì)胞生長有毒的物質(zhì)。值得注意的是，這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白除了主要分布在細(xì)胞膜外，似乎每個(gè)細(xì)胞區(qū)室都含有一個(gè)或者多個(gè)不同的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。Wang Ye等[78]報(bào)道了在釀酒酵母中異源表達(dá)了來源于Grosmannia clavigera的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GcABC-G1，分別提高了酵母耐受(＋)-3-蒈烯、D-檸檬烯和β-蒎烯的能力。乳酸克魯維酵母（K. lactis）、釀酒酵母（S. cerevisiae）、解脂耶氏酵母（Y. lipolytica）等菌屬中也有與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GcABC-G1相似的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABC-G1，其中釀酒酵母中含有ScABC-G1的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為Pdr5p、Pdr10p、Pdr15p。Hu Zhihui等[41]利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qPCR）技術(shù)在低、高濃度D-檸檬烯脅迫下檢測(cè)了10種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)量，根據(jù)表達(dá)量之間的差異篩選出對(duì)D-檸檬烯濃度差響應(yīng)最為顯著的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，并發(fā)現(xiàn)在低質(zhì)量濃度（42.1 mg/L）D-檸檬烯脅迫下過量表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Pdr5p和Pdr15p基因能顯著地提高重組菌株對(duì)D-檸檬烯的耐受性，其中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Pdr15p對(duì)D-檸檬烯的耐受性能力強(qiáng)于Pdr5p。

表5 釀酒酵母中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的分布Table 5 Subfamily distribution of ABC transporter proteins in Saccharomyces cerevisiae

3 結(jié) 語

隨著合成生物學(xué)和代謝工程的發(fā)展，實(shí)現(xiàn)了在釀酒酵母中構(gòu)建檸檬烯合成途徑的目標(biāo)，但目前檸檬烯的產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場化需求。為了進(jìn)一步提高檸檬烯的產(chǎn)量，可以從以下4 個(gè)方面進(jìn)行深入研究：1）檸檬烯合成需要大量的輔酶NADPH和能量，因此其合成途徑的進(jìn)入會(huì)干擾釀酒酵母原有的代謝網(wǎng)絡(luò)，如何調(diào)整酵母體內(nèi)新代謝網(wǎng)絡(luò)的代謝平衡（氧化還原平衡、能量供應(yīng)）及保持代謝流朝著檸檬烯合成方向，是采取過量表達(dá)MVA路徑中限速酶、強(qiáng)化磷酸戊糖途徑等措施強(qiáng)化原有代謝路徑的代謝通量和輔酶供應(yīng)，還是引入外源基因改造原有代謝路徑或者構(gòu)建新的代謝路徑等措施增加代謝通量與底物供應(yīng)，達(dá)到減少碳源的流失及節(jié)約能量和輔酶消耗的目的，進(jìn)而重新調(diào)控新的代謝網(wǎng)絡(luò)以達(dá)到最佳的狀態(tài)；2）如何從其他生物體內(nèi)挖掘到更高活性、特異性的檸檬烯合成酶或者對(duì)檸檬烯合成酶的催化機(jī)理進(jìn)行全面、深入的研究，進(jìn)而對(duì)檸檬烯合成酶采取酶定向進(jìn)化的措施篩選到更高催化活性、專一性的檸檬烯合成酶，這將進(jìn)一步為檸檬烯商業(yè)化及其他萜類化合物的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)；3）檸檬烯對(duì)酵母的生長具有毒害作用，目前雙相發(fā)酵可以有效地減弱其毒性，但仍不能滿足工業(yè)化的需求。如何構(gòu)建一株高產(chǎn)檸檬烯、耐高濃度檸檬烯的酵母菌株，這對(duì)于檸檬烯商業(yè)化具有重要意義，然而檸檬烯的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制及耐性機(jī)理的研究不是很充分，這些限制了檸檬烯的異源高產(chǎn)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)以及代謝組學(xué)等的快速發(fā)展使得在釀酒酵母中挖掘出與檸檬烯轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和提高耐性的蛋白成為可能；4）菌株發(fā)酵控制對(duì)提高檸檬烯產(chǎn)量有著同樣至關(guān)重要的作用，如何根據(jù)菌株高密度生長及發(fā)酵特性適時(shí)調(diào)整發(fā)酵策略是關(guān)鍵，對(duì)發(fā)酵過程中碳源、萃取劑、溶氧、pH值等進(jìn)行優(yōu)化與調(diào)控，以及對(duì)發(fā)酵尾氣多級(jí)回收等均可實(shí)現(xiàn)提高檸檬烯產(chǎn)量的目的。綜上所述，結(jié)合代謝工程和合成生物學(xué)構(gòu)建高產(chǎn)檸檬烯菌株和發(fā)酵控制等多種手段，將有望實(shí)現(xiàn)檸檬烯及其他萜類化合物在釀酒酵母中定向、高效的異源合成。