山楂葉總黃酮對(duì)心肌缺血再灌注大鼠心肌病變及Akt/Nrf 2 通路的影響

劉書紅

（邯鄲市中心醫(yī)院藥學(xué)部，河北 邯鄲 056000）

急性心肌梗死是臨床較為常見的急危重癥。藥物溶栓或經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療使血流再通是臨床上搶救急性心肌梗死患者的關(guān)鍵[1]。血流再灌注過程常導(dǎo)致心肌的二次損傷，即心肌缺血再灌注損傷，病理生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)與心肌缺血再灌注損傷密切相關(guān)。山楂葉總黃酮（hawthorn leaves flavonoids，HLF）是從山楂樹葉子中提取的黃酮類化合物，具有良好的抗氧化、抗炎活性[2-3]，研究[4-5]發(fā)現(xiàn)HLF 能夠通過抑制氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)對(duì)肺組織、腦組織缺血再灌注損傷起到一定保護(hù)作用。蛋白激酶B/核因子E2相關(guān)因子2（protein kinase B/Nuclear factor E2 related factor 2，Akt/Nrf2）通路在機(jī)體氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要調(diào)控作用[6]。本實(shí)驗(yàn)通過夾閉左冠狀動(dòng)脈前降支30 min 復(fù)制心肌缺血再灌注大鼠模型，以臨床治療心肌缺血再灌注一線用藥維拉帕米（Verapami，Ver）作為陽性對(duì)照藥物，探究HLF 對(duì)心肌缺血再灌注后心肌組織病理學(xué)改變的影響以及Akt/Nrf2 通路在其中發(fā)揮的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性Sprague Dawley（SD）大鼠192 只，7 周齡，210 g～240 g，購自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK（冀）2018-004]；實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，環(huán)境設(shè)置：室溫（25±1）℃，相對(duì)濕度（60±5）%，明暗12 h交替，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水。本研究經(jīng)邯鄲市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)[批件號(hào)：HDZXLL（K）字2020-036]。

1.2 藥物與試劑 HLF 購自山西晉城中晉藥業(yè)有限公司，總黃酮含量≥95%，批號(hào)：20 190527；Ver 購自哈藥集團(tuán)三精制藥股份有限公司，規(guī)格：2 mL，5 mg，批號(hào)：190412；硝基藍(lán)四氮唑（nitro blue tetrazolium，NBT）購自上海前進(jìn)試劑廠，批號(hào)：190105；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）試劑盒和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）酶聯(lián)免疫（enzymelinked immunoassay，ELISA）試劑盒購自南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20190413、20190127、20190506、20190411、20190317、20 190125；Akt、磷酸化Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）抗體購自英國Abcam 公司，批號(hào)：ab179463、ab38449；Nrf 2、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）抗體購自北京博奧森生物科技有限公司，批號(hào)：20190131、20 190427；β-actin 抗體購自美國CST 公司，批號(hào)：3700S；山羊抗兔IgG 二抗購自美國Bioworld 公司，批號(hào)：BS13278。

1.3 動(dòng)物分組、給藥與模型制備 按照隨機(jī)數(shù)表法，將192 只實(shí)驗(yàn)用SD 大鼠分為假手術(shù)組、模型組、HLF（25、50、100 mg/kg）組和Ver 1 mg/k 組[7-9]，各32 只；造模前10 min 腹腔注射給藥，假手術(shù)組和模型組大鼠給予0.9%氯化鈉溶液。除假手術(shù)組外的其他組大鼠均參照文獻(xiàn)[10]報(bào)道的夾閉左冠狀動(dòng)脈前降支30 min 的方法復(fù)制心肌缺血再灌注大鼠模型，夾閉左冠狀動(dòng)脈前降支后心電圖ST 段弓背抬高、T 波高聳，30 min 后恢復(fù)血流再灌注后ST 段抬高降低、T 波降低，即可判定為造模成功；假手術(shù)組行手術(shù)通路但不夾閉冠狀動(dòng)脈前降支。再灌注2 h 后檢測(cè)各指標(biāo)。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 心肌梗死體積檢測(cè) 各組隨機(jī)取8 只大鼠，麻醉后頸椎脫臼處死，開胸后取左冠狀動(dòng)脈前降支血流供應(yīng)區(qū)的左心室組織，2 mm 厚度切片，置濃度2%的NBT溶液、恒溫37 ℃避光孵育1 h（正常區(qū)呈紫黑色），通過圖像分析系統(tǒng)計(jì)算心肌梗死體積。

1.4.2 心肌組織病理學(xué)檢查及損傷評(píng)分 各組隨機(jī)取8只大鼠，麻醉后頸椎脫臼處死，開胸后取左冠狀動(dòng)脈前降支血流供應(yīng)區(qū)的左心室組織，置濃度4%多聚甲醛溶液常溫固定72 h后，行石蠟浸泡包埋、5 μm 厚度切片、脫蠟水化、HE 染色（蘇木素溶液染色10 min、伊紅水溶液染色3 min）、梯度乙醇脫水和二甲苯透明后采用中性樹膠封片，通過顯微鏡觀察。損傷評(píng)分：根據(jù)心肌組織病變面積分別從出血、間質(zhì)水腫、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、變性壞死4個(gè)方面進(jìn)行評(píng)分：未見病變計(jì)0分，病變視野比例≤1/4 計(jì)1 分、＞1/4 計(jì)2 分、≥1/2 計(jì)3 分，4 個(gè)方面之和即為損傷評(píng)分。

1.4.3 心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察 各組隨機(jī)取8只大鼠，麻醉后頸椎脫臼處死，開胸后取左冠狀動(dòng)脈前降支血流供應(yīng)區(qū)的左心室組織，切割成5 mm3組織塊置于4℃、4%戊二醛固定24 h，4 ℃、1%鋨酸固定3 h，然后依次進(jìn)行脫水、氧化丙烯置換、環(huán)氧樹脂包埋處理后，70 nm 厚度超薄切片，經(jīng)醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛雙重電子染色后通過透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.4.4 心肌組織生化指標(biāo)檢測(cè) 取各組剩余的8 只大鼠，麻醉后頸椎脫臼處死，開胸后取左冠狀動(dòng)脈前降支血流供應(yīng)區(qū)的左心室組織，剪碎、研磨勻漿后加入4 ℃裂解液，冰上靜置30 min 充分裂解，4 ℃、3 500 rpm 離心15 min 取上清液，采用硫代巴比妥酸法檢測(cè)心肌MDA 含量，黃嘌呤氧化法、鉬酸銨法檢測(cè)SOD、CAT 活力，ELISA 法檢測(cè)TNF-α、IL-1β、IL-6含量。

1.4.5 心肌組織蛋白表達(dá)檢測(cè) 取1.4.4 制備的心肌組織勻漿液，4 ℃、12 000 rpm 離心30 min 取上清液，BCA 法測(cè)定總蛋白量、沸水浴5 min 行蛋白高溫變性，取30 μg總蛋白行SDS-PAGE膠電泳分離、轉(zhuǎn)PVDF膜、5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h、滴加目標(biāo)蛋白、β-actin一抗4 ℃孵育過夜，洗膜后滴加IgG 二抗室溫孵育1 h，洗膜后滴加DAB 顯色劑，以β-actin 為內(nèi)參，通過條帶灰度值半定量目的蛋白相對(duì)表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 17.0 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多樣本間比較行單因素方差分析，樣本間兩兩比較行LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HLF 對(duì)心肌缺血再灌注大鼠心肌梗死體積的影響 與假手術(shù)組比較，模型組心肌梗死體積百分比顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，HLF 50、100 mg/kg 組和Ver 1 mg/kg 組心肌梗死體積百分比顯著降低（P＜0.01）；與Ver 1 mg/kg 組比較，HLF 100 mg/kg組心肌梗死體積百分比顯著降低（P＜0.01）。見表1。

2.2 HLF 對(duì)心肌缺血再灌注大鼠心肌組織病理學(xué)改變及損傷評(píng)分的影響 假手術(shù)組大鼠左心室心肌纖維排列整齊有序、心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，未見異常；模型組呈現(xiàn)心肌纖維紊亂無序，可見部分心肌纖維斷裂，心肌細(xì)胞數(shù)量減少，胞核固縮、深染、偏移，可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；較模型組，HLF 各劑量和Ver 1 mg/kg組左心室心肌組織病理學(xué)改變呈不同程度減輕；其中HLF 100 mg/kg 組未見心肌纖維斷裂和胞核偏移，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較少。損傷評(píng)分：較假手術(shù)組，模型組左心室心肌損傷評(píng)分顯著升高（P＜0.01）；較模型組，HLF 50、100 mg/kg 組和Ver 1 mg/kg 組損傷評(píng)分顯著降低（P＜0.01）；較Ver 1 mg/kg 組，HLF 100 mg/kg組損傷評(píng)分顯著降低（P＜0.05）。見表1，圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織病理學(xué)改變的影響（×200 倍，n =8）

表1 各組大鼠心肌梗死體積和損傷評(píng)分比較（，n =8）

表1 各組大鼠心肌梗死體積和損傷評(píng)分比較（，n =8）

注：與假手術(shù)組比較，## P ＜0.01；與模型組比較，△△P ＜0.01；與Ver 組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01

2.3 HLF 對(duì)心肌缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變的影響 假手術(shù)組左心室心肌細(xì)胞膜、胞核、細(xì)胞器、染色質(zhì)等超微結(jié)構(gòu)均未見異常；模型組可見胞膜破裂，肌絲溶解斷裂，線粒體數(shù)量減少、膜破裂、嵴斷裂溶解，核仁邊界不清，染色質(zhì)固縮等超微結(jié)構(gòu)病變；較模型組，HLF 各劑量和Ver 1 mg/kg 組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)病變呈不同程度減輕，其中HLF 100 mg/kg組線粒體數(shù)量較多、結(jié)構(gòu)完整，核較為清晰，染色質(zhì)分布均勻。見圖2。

圖2 各組大鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變的影響（×10 000 倍，n=8）

2.4 各組大鼠心肌組織MDA 含量和SOD、CAT 活力的影響 見表2。

表2 各組大鼠心肌組織MDA 含量和SOD、CAT 活力的影響（，n =8）

表2 各組大鼠心肌組織MDA 含量和SOD、CAT 活力的影響（，n =8）

注：與假手術(shù)組比較，## P ＜0.01；與模型組比較，△△ P ＜0.01；與Ver 組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01

2.5 各組大鼠心肌組織TNF-α、IL-1β、IL-6 含量的影響 見表3。

表3 各組大鼠心肌組織TNF-α、IL-1β、IL-6 含量的影響（，n =8） pg/mg

表3 各組大鼠心肌組織TNF-α、IL-1β、IL-6 含量的影響（，n =8） pg/mg

注：與假手術(shù)組比較，## P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05，△△ P ＜0.01；與Ver 組比較，▲P ＜0.05

2.6 HLF 對(duì)心肌缺血再灌注大鼠心肌Akt、p-Akt、Nrf2、NF-κB 蛋白表達(dá)及Akt 磷酸化的影響 與假手術(shù)組比較，模型組左心室心肌p-Akt、Nrf2 表達(dá)明顯下調(diào)而NF-κB 表達(dá)明顯上調(diào)、Akt 磷酸化（p-Akt/Akt）顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，HLF 50、100 mg/kg 組和Ver 1 mg/kg 組p-Akt、Nrf2 表達(dá)明顯上調(diào)且NF-κB 表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.01），Akt 磷酸化顯著升高（P＜0.01）；與Ver 1 mg/kg 組比較，HLF 100 mg/kg 組p-Akt、Nrf2 表達(dá)上調(diào)且NF-κB 表達(dá)下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01），Akt磷酸化升高（P＜0.01）。見圖3，圖4。

圖3 各組大鼠心肌Akt、p-Akt、Nrf2、NF-κB 蛋白表達(dá)的影響（n =8）

圖4 各組大鼠心肌Akt、p-Akt、Nrf2、NF-κB 蛋白相對(duì)表達(dá)及Akt 磷酸化的影響

3 討論

近年來，急性心肌梗死發(fā)生率呈逐年上升趨勢(shì)，及時(shí)通過藥物或手術(shù)治療恢復(fù)血流能夠挽救部分急性心肌梗死患者生命。心肌缺血再灌注損傷嚴(yán)重影響著急性心肌梗死患者預(yù)后。

HLF 為山楂葉的主要有效成分，具有良好的抗炎、抗氧化等藥理學(xué)作用。山楂葉為常用中藥品種，《本草綱目》有記載山楂葉性平、味酸，具有活血化瘀、理氣通脈、化濁降脂之功效，多用于氣滯血瘀、胸痹心痛等癥的治療。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HLF 治療能夠有效降低心肌缺血再灌注大鼠左心室心肌梗死體積，改善心肌纖維斷裂、紊亂及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、心肌細(xì)胞壞死等病理性改變，降低心肌損傷評(píng)分，改善心肌細(xì)胞膜破裂、線粒體數(shù)量減少、嵴斷裂溶解、染色質(zhì)固縮等超微結(jié)構(gòu)病變，并且HLF 100 mg/kg 組效果優(yōu)于Ver 1 mg/kg 組，提示HLF 對(duì)心肌缺血再灌注大鼠心肌病理學(xué)改變和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)病變具有保護(hù)作用。

氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在心肌缺血再灌注損傷疾病進(jìn)展過程中發(fā)揮著重要作用。急性心肌梗死及血流再灌注過程，線粒體電子傳遞鏈遭破壞導(dǎo)致活性氧（reactive oxygen species，ROS）大量生成、以ROS 為底物的SOD、CAT 等抗氧化酶被過度消耗，致使ROS不能被還原代謝而蓄積，攻擊核酸、蛋白質(zhì)等大分子，破壞生物膜不飽和脂肪酸，生成具有生物毒性的MDA[11]。心肌缺血發(fā)生后將病理性刺激炎癥因子大量釋放，其中TNF-α、IL-1β、IL-6 做為炎性趨化因子，能夠激發(fā)炎癥反應(yīng)而損傷心肌組織，并且TNF-α、IL-1β 能夠刺激機(jī)體免疫應(yīng)激，進(jìn)一步促進(jìn)炎癥因子產(chǎn)生和釋放，引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[12]；IL-6 能夠激活炎癥細(xì)胞而加重炎癥反應(yīng)，能夠刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放ROS[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HLF 治療能夠有效降低心肌缺血再灌注大鼠左心室心肌MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6 含量，提高SOD、CAT 活力，并且HLF 100 mg/kg組效果優(yōu)于Ver 1 mg/kg 組，提示HLF 對(duì)心肌缺血再灌注大鼠心肌氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)具有抑制作用。

Nrf2 是一種核轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)具有重要的調(diào)控作用[14]，生理狀態(tài)下的Nrf2 與抑制劑Keap1 結(jié)合以無活性狀態(tài)存在。Akt 是一種原癌基因，被磷酸化（p-Akt）激活后，能夠誘導(dǎo)Nrf2 與Keap1 復(fù)合體解離，促進(jìn)Nrf2 核轉(zhuǎn)位并上調(diào)表達(dá)[15]。Nrf2 能夠與激活抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合而誘導(dǎo)抗氧化酶（包括SOD、CAT）轉(zhuǎn)錄表達(dá)[16]；HO-1 為Nrf2 下游基因，研究[17]發(fā)現(xiàn)Nrf2/HO-1 通路是保護(hù)心血管系統(tǒng)氧化應(yīng)激損傷的重要途徑，HO-1 能夠被Nrf2 誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)位和上調(diào)表達(dá)，HO-1 能夠催化降解血紅素、CO 等，抑制氧化應(yīng)激損傷。NF-κB 能夠誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥細(xì)胞因子大量釋放。任國強(qiáng)等[18]通過藥物抑制NF-κB 表達(dá)能夠顯著降低心肌缺血再灌注大鼠炎癥反應(yīng)。研究[19]發(fā)現(xiàn)HO-1 能夠抑制NF-κB 啟動(dòng)子IKKβ磷酸化進(jìn)而抑制NF-κB 活化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HLF治療能夠明顯上調(diào)心肌缺血再灌注大鼠左心室心肌p-Akt、Nrf2 表達(dá)并提高Akt 磷酸化，下調(diào)NF-κB 表達(dá)，HLF 100 mg/kg 組對(duì)p-Akt、Nrf2、NF-κB 表達(dá)的調(diào)控作用優(yōu)于Ver 1 mg/kg 組，提示HLF 對(duì)心肌缺血再灌注大鼠心肌氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的抑制作用可能與激活A(yù)kt/Nrf2 通路有關(guān)。

綜上所述，HLF 對(duì)心肌缺血再灌注大鼠心肌病理學(xué)改變和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)病變具有保護(hù)作用，作用機(jī)制可能與激活A(yù)kt/Nrf2 通路，抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有關(guān)。