鱉甲煎丸含藥血清對(duì)肝癌干細(xì)胞的抑制作用及潛在調(diào)控機(jī)制研究

謝楊益，林洪升，孔茵芝，潘愛萍，李明芬*

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧 530200；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，南寧 530021；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530021）

肝癌是全球第四大癌癥相關(guān)死亡原因，發(fā)病率呈不斷上升趨勢[1-2]。到2025 年，每年將有超過100 萬人受到肝癌的影響[3]。目前，手術(shù)切除和肝移植是治療早期腫瘤最有效的方法。肝癌起病隱匿，腫瘤進(jìn)展迅速，大多數(shù)肝癌患者在確診時(shí)為中晚期，失去手術(shù)根治性治療的機(jī)會(huì)。肝癌的五年總生存率僅為30%～40%[4]。腫瘤干細(xì)胞具有自我更新、分化和產(chǎn)生新腫瘤的能力[5]。肝癌干細(xì)胞的存在與肝癌的發(fā)生、進(jìn)展、復(fù)發(fā)和耐藥密切相關(guān)[6]。中藥能通過多機(jī)制和多層面抑制肝癌的發(fā)展。研究[7]發(fā)現(xiàn)，肝癌干細(xì)胞是中醫(yī)藥治療肝癌的重要靶點(diǎn)。鱉甲煎丸出自漢代名醫(yī)張仲景的《金匱要略》，現(xiàn)多應(yīng)用于肝纖維化、肝硬化、肝炎、肝癌等肝病治療中，療效顯著[8]。本課題組的前期實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，鱉甲煎丸可抑制肝癌細(xì)胞增殖[9]，但對(duì)于肝癌干細(xì)胞的研究尚未見報(bào)道。本研究通過免疫磁珠分選肝癌干細(xì)胞，制備鱉甲煎丸含藥血清干預(yù)肝癌干細(xì)胞，分析信使RNA（messenger RNA，mRNA）表達(dá)譜變化，進(jìn)一步探討鱉甲煎丸治療肝癌的作用機(jī)制，以期為針對(duì)肝癌干細(xì)胞的靶向治療提供新思路。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721，受贈(zèng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)生化教研室。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)SD 雄性大鼠，購于廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，體質(zhì)量（201.38±17.57）g，生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK（桂）2013-0005。所有操作都在國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用標(biāo)準(zhǔn)和倫理要求下進(jìn)行。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥品 鱉甲煎丸，購于武漢中聯(lián)藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z42020772。

1.4 實(shí)驗(yàn)試劑 胎牛血清，美國Gbico 公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，美國Gbico公司；CCK-8試劑盒，日本同仁公司；免疫磁珠分選系統(tǒng)，德國Miltenyi公司；人CD133-PE 流式抗體，德國Miltenyi 公司；細(xì)胞總RNA 提取試劑盒RNeasy Mini Kit，德國Qiagen 公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2條件下靜置培養(yǎng)。

2.2 鱉甲煎丸含藥血清及空白對(duì)照血清制備 用生理鹽水將鱉甲煎丸溶解配制成混懸液，鱉甲煎丸成人臨床劑量為3 g/60 kg，大鼠給藥劑量按成人劑量20 倍配制為1 g/kg。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后，按10 mL/kg灌胃給藥，分別予等量鱉甲煎丸混懸液和生理鹽水灌胃，每天2 次，連續(xù)3 d。第4 天給藥2 h 后，大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，腹主動(dòng)脈取血，靜置2 h 以上，4 ℃條件下3 000 r/min 離心15 min，分離并混合同組血清。將血清置于56 ℃水浴箱中滅活30 min 后，再使用0.45 μm 和0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，獲得鱉甲煎丸含藥血清及空白對(duì)照血清，置于-20 ℃凍存[10]。

2.3 免疫磁珠分選CD133+細(xì)胞群 收集1×107個(gè)細(xì)胞，重懸于100 μL 緩沖液中。向細(xì)胞懸液中加入20 μL CD133 抗體和10 μL 免疫磁珠，輕輕混勻后，4 ℃避光孵育15 min。離心洗滌細(xì)胞后用500 μL 緩沖液重懸，加到分選柱上，濾過細(xì)胞懸液，再加入500 μL 緩沖液將分選柱洗2 遍。從磁場中取出分選柱，加入1 mL緩沖液，收集此次細(xì)胞懸液，即為CD133+細(xì)胞。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞CD133 表達(dá) 收集細(xì)胞，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌后重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升1×106個(gè)。每管加入100 μL 細(xì)胞懸液，再向管中加入5 μL 人CD133-PE 流式抗體，混勻，室溫避光孵育10 min。加入PBS 至500 μL，輕輕混勻，用流式細(xì)胞儀檢測。

2.5 CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖能力 在96 孔板中每孔加入100 μL 濃度為每毫升2×104個(gè)的細(xì)胞懸液，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h。給培養(yǎng)板換液（含10%胎牛血清或鱉甲煎丸含藥血清或空白對(duì)照血清的DMEM 培養(yǎng)基），在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72、96 h。向每孔加入10 μL CCK-8 溶液，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀測定在450 nm 處的吸光度（OD）。

2.6 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，PBS 洗滌，調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升1×106個(gè)用無血清培養(yǎng)基重懸。取600 μL 含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基加入24 孔板下室，將Transwell小室置于24 孔板內(nèi)，分別在上室中加入100 μL 細(xì)胞懸液，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出小室，棄去培養(yǎng)基，將小室用PBS 洗2 遍后，4%多聚甲醛固定30 min，然后用0.1%結(jié)晶紫染色10 min，PBS 洗2 遍后風(fēng)干，在高倍顯微鏡下選取5 個(gè)視野觀察細(xì)胞并計(jì)數(shù)。

2.7 總RNA 收集 將細(xì)胞用含10%鱉甲煎丸含藥血清或空白對(duì)照血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，按照試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，檢測RNA 樣品的濃度和純度。

2.8 差異表達(dá)mRNA 分析 全細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析由深圳海一時(shí)代基因有限公司完成，測序平臺(tái)為Hiseq 2500 SE 50。通過DEGseq 差異分析軟件，以差異倍數(shù)≥2和P-value≤0.05 的條件篩選差異表達(dá)的mRNA。

2.9 生存分析 Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫將GEO、EGA 和TCGA 數(shù)據(jù)庫中患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)和生存信息進(jìn)行整合，評(píng)估常見腫瘤患者中各種基因表達(dá)水平與臨床結(jié)果的相關(guān)性[11]。使用 Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫評(píng)估Wnt 信號(hào)通路相關(guān)差異mRNA 在肝癌中的預(yù)后價(jià)值。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 20.0 軟件，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

3 結(jié)果

3.1 肝癌干細(xì)胞的分離與鑒定 通過免疫磁珠法分選出CD133+肝癌干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD133 表達(dá)。與肝癌細(xì)胞比較，肝癌干細(xì)胞中CD133+細(xì)胞所占比例明顯增高，達(dá)到86.6%，見圖1。采用CCK-8 法檢測肝癌干細(xì)胞的增殖能力，Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測肝癌干細(xì)胞的侵襲能力，結(jié)果顯示肝癌干細(xì)胞的增殖和侵襲能力均明顯提高，見圖2，圖3。

圖1 肝癌細(xì)胞與肝癌干細(xì)胞的CD133 表達(dá)比較

圖2 肝癌細(xì)胞與肝癌干細(xì)胞的增殖能力比較

圖3 肝癌細(xì)胞與肝癌干細(xì)胞的侵襲能力比較

3.2 鱉甲煎丸含藥血清對(duì)肝癌干細(xì)胞增殖能力的影響 肝癌干細(xì)胞經(jīng)鱉甲煎丸含藥血清干預(yù)后進(jìn)行CCK-8 實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖能力明顯受抑制，與空白對(duì)照血清組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖4。

圖4 鱉甲煎丸含藥血清對(duì)肝癌干細(xì)胞增殖能力的影響比較

3.3 差異表達(dá)mRNA 分析 對(duì)鱉甲煎丸含藥血清和空白對(duì)照血清2 組樣品進(jìn)行mRNA 差異分析，發(fā)現(xiàn)部分差異mRNA 屬于Wnt 信號(hào)通路，包括Wnt 家庭成員1（WNT1）、鳥苷酸結(jié)合蛋白1（GBP1）、連環(huán)蛋白β1（CTNNB1）、VANGL 平面細(xì)胞極性蛋白2（VANGL2）、刺細(xì)胞平面細(xì)胞極性蛋白1（PRICKLE1）和絲裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）。與空白對(duì)照血清組相比，這些基因在鱉甲煎丸含藥血清組中均表達(dá)下調(diào)。

3.4 Wnt 信號(hào)通路相關(guān)差異mRNA 生存分析 通過Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫評(píng)估Wnt 信號(hào)通路相關(guān)差異mRNA 表達(dá)與肝癌患者預(yù)后的相關(guān)性，結(jié)果顯示，WNT1、GBP1、PRICKLE1 高表達(dá)組的總生存期明顯短于低表達(dá)組（P＜0.05），CTNNB1、VANGL2、MAPK8 表達(dá)與肝癌患者預(yù)后的相關(guān)性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖5。

圖5 Wnt 信號(hào)通路相關(guān)差異mRNA 表達(dá)和肝癌患者總生存期的關(guān)系

4 討論

腫瘤干細(xì)胞能夠使腫瘤細(xì)胞自我更新，維持細(xì)胞增殖[12-14]。研究[15-17]表明，腫瘤干細(xì)胞是腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥的關(guān)鍵因素之一。許多細(xì)胞表面蛋白，如CD133、CD44、上皮細(xì)胞黏附分子與CD90，已被確定為肝癌干細(xì)胞可靠的生物標(biāo)志物[18-20]。CD133 在維持肝癌干性中起著關(guān)鍵作用。研究[21]表明，從Huh7細(xì)胞株中分離的CD133+細(xì)胞顯示出更高的增殖和致瘤能力。CD133+細(xì)胞群有助于肝癌的化學(xué)抗性和放射抗性[22]。本課題組通過免疫磁珠法分選出CD133+肝癌干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞CD133 表達(dá)，采用CCK-8 法和Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測肝癌干細(xì)胞的增殖和侵襲能力。結(jié)果顯示，分選出的肝癌干細(xì)胞中CD133+細(xì)胞所占比例達(dá)到86.6%，且肝癌干細(xì)胞的增殖和侵襲能力較肝癌細(xì)胞均明顯提高，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

為了檢測鱉甲煎丸對(duì)肝癌干細(xì)胞生長的抑制作用，本研究采用CCK-8 法檢測用含10%鱉甲煎丸含藥血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，對(duì)肝癌干細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞增殖能力明顯受抑制，與空白對(duì)照血清組對(duì)比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，驗(yàn)證了鱉甲煎丸對(duì)肝癌的有效治療作用。為了進(jìn)一步明確其作用具體機(jī)制，本研究進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)鱉甲煎丸含藥血清干預(yù)肝癌干細(xì)胞后，部分差異表達(dá)mRNA 屬于Wnt信號(hào)通路，包括WNT1、GBP1、CTNNB1、STBM、PRICKLE1 和JNK，提示W(wǎng)nt 信號(hào)通路可能參與鱉甲煎丸對(duì)肝癌干細(xì)胞的抑制作用。

突變誘導(dǎo)的Wnt/β-catenin 信號(hào)激活是人類腫瘤中常見的驅(qū)動(dòng)事件，持續(xù)的Wnt/β-catenin 途徑激活賦予腫瘤細(xì)胞自我更新生長特性，并與治療耐藥性相關(guān)[23]。多項(xiàng)研究表明，Wnt 通路在肝癌進(jìn)展中扮演重要角色，Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的關(guān)鍵信號(hào)分子異常激活，可促進(jìn)肝細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化、肝癌轉(zhuǎn)移與耐藥以及肝癌干細(xì)胞的自我更新[24]。研究[25]發(fā)現(xiàn)，蛋白酪氨酸激酶2 通過激活Wnt 信號(hào)增強(qiáng)肝癌干細(xì)胞性狀，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和索拉非尼耐藥。ATP-檸檬酸裂解酶通過影響β-catenin 的穩(wěn)定性調(diào)節(jié)Wnt 信號(hào)通路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的干性特征、遷移和侵襲能力[26]。鱉甲煎丸抑制肝癌干細(xì)胞增殖的藥理作用，可能與其下調(diào)Wnt信號(hào)通路分子的表達(dá)水平有關(guān)。對(duì)Wnt 信號(hào)通路相關(guān)差異mRNA 進(jìn)行生存分析發(fā)現(xiàn)，WNT1、GBP1、PRICKLE1 高表達(dá)組的肝癌患者總生存期明顯短于低表達(dá)組，提示這3 個(gè)基因可能在肝癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用，是潛在的肝癌預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。

綜上所述，本研究證實(shí)，鱉甲煎丸能夠抑制肝癌干細(xì)胞增殖，其抑制作用可能與下調(diào)Wnt 信號(hào)通路分子的表達(dá)水平有關(guān)。今后將結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，為闡明鱉甲煎丸的抗肝癌效應(yīng)及其藥理作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。