利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)分析甜菜多胚授粉系不同個(gè)體之間的遺傳多樣性

李月宏，李喬喬，吳則東*

(1.黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080；2.黑龍江省普通高校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080)

0 引言

甜菜(BetavulgarisL.)屬于藜科、甜菜屬的二年生草本植物，是我國(guó)北方主要經(jīng)濟(jì)作物之一，甜菜是重要的糖料作物，產(chǎn)糖量非常高。甜菜是中溫帶地區(qū)的主要糖料作物，具有耐寒、耐旱、耐鹽堿的特性，是一種抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)性廣的作物，其可以在干旱和半干旱的地區(qū)廣泛種植[1]。甜菜屬共有12個(gè)種，其中屬于普通甜菜種中的普通甜菜亞種又可以分為食用甜菜、葉用甜菜、飼用甜菜和糖用甜菜。2020年我國(guó)糖用甜菜種植面積約為213千公頃，產(chǎn)量達(dá)1198.4萬噸。甜菜原產(chǎn)于歐洲的西部和南部沿海地區(qū)，從瑞典移植到西班牙，中國(guó)大面積引種糖用甜菜始于1906年，甜菜生產(chǎn)前景較好。種質(zhì)資源是作物的遺傳改良和基礎(chǔ)研究的物質(zhì)基礎(chǔ)[2]。只有滿足作物種質(zhì)資源足夠的數(shù)量和優(yōu)異的質(zhì)量以及種質(zhì)研究所需知識(shí)的深度,才能使種質(zhì)資源的利用效率進(jìn)一步提高，使種業(yè)可持續(xù)發(fā)展[3]。甜菜育種的重要內(nèi)容之一是優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源的開發(fā)利用。通過對(duì)甜菜種質(zhì)資源的識(shí)別，可以充分了解每種甜菜種質(zhì)的表型特征，從而找到更好的甜菜種質(zhì)并有效利用[4]。

我國(guó)甜菜種質(zhì)資源最早都是從國(guó)外引進(jìn)的多胚種子中進(jìn)行選擇而來，由于大部分甜菜種質(zhì)資源具有自交不親和性，引進(jìn)的種子比較雜合，我國(guó)的甜菜育種家們?yōu)榱诉m應(yīng)我國(guó)甜菜育種生產(chǎn)的發(fā)展和制糖產(chǎn)業(yè)的需求，分別在不同地區(qū)進(jìn)行選擇?；仡櫸覈?guó)甜菜育種的歷史進(jìn)程，自上個(gè)世紀(jì)50年代以來，為了選育優(yōu)良品種，衍生出一些育種方法，從系統(tǒng)選擇法到混合選擇法及母系選擇法[5]，以及輪回選擇法等等，但是這些育種方法選育出的品種均具有一定的異質(zhì)性，后來開始利用雄性不育作為母本生產(chǎn)雜交種，而父本則是利用多胚授粉系，我國(guó)目前使用的甜菜多胚授粉系的主要選擇方法就是母系選擇法和混合輪回選擇的方法，這兩種方法選擇出的授粉系在不同個(gè)體之間會(huì)存在一定的異質(zhì)性，因此我們準(zhǔn)備利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定我國(guó)多胚授粉系的遺傳多樣性，也就是同一授粉系不同個(gè)體之間的差異性。 在育種過程中為了提高甜菜的育種效率，選擇優(yōu)良的雜交組合，獲得優(yōu)良的創(chuàng)新品種，需要進(jìn)一步分析種質(zhì)資源的遺傳背景和內(nèi)部遺傳結(jié)構(gòu)，這樣可以高效的提高甜菜育種的工作效率，達(dá)到育種所需的種質(zhì)資源品質(zhì)[6]。

隨著DNA分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展，農(nóng)作物品種的鑒定已經(jīng)轉(zhuǎn)移到基因?qū)用鎇7]。最常見的分子標(biāo)記技術(shù)包括 RFLP[8]、RAPD[9]、AFLP[10]、ISSR[11]、SSR[12]、SRAP[13]和 SNP[14]。SSR 為簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeat)，SSR 標(biāo)記又稱為微衛(wèi)星 (Microsatellites)標(biāo)記，是由 Moore 等于 1991 年建立的基于 PCR 的一種分子標(biāo)記技術(shù)。SSR技術(shù)由于其遺傳共顯性和技術(shù)簡(jiǎn)單，被廣泛用于分析甜菜的遺傳多樣性，是最常見的分子標(biāo)記技術(shù)之一[15]。本試驗(yàn)利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)甜菜多胚授粉系不同個(gè)體之間的遺傳多樣性進(jìn)行分析。了解我國(guó)多胚授粉系不同個(gè)體之間的混雜程度，為將來更好的品種選育打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究中所用4份甜菜授粉系(每份授粉系包括50個(gè)單株)的編號(hào)、名稱以及來源詳情見表1。

表1 4份甜菜授粉系材料的編號(hào)、名稱及來源

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取與檢測(cè)

在甜菜嫩葉時(shí)期，采集4份甜菜多胚授粉系材料的新鮮嫩葉，每份授粉系提取50個(gè)個(gè)體，將采集的甜菜樣品按照其編號(hào)分別裝入PC管中，放入液氮中使其達(dá)到液氮的溫度，再用震蕩研磨機(jī)打碎，采用 CTAB 法提取基因組DNA，利用超微量分光光度計(jì)測(cè)定提取DNA的濃度和純度。

1.2.2 PCR擴(kuò)增體系和程序

SSR 引物選用實(shí)驗(yàn)室已篩選并驗(yàn)證的多態(tài)性好、條帶清晰的15對(duì) SSR 引物(表 2)，均由上海生工生物工程有限公司合成。

PCR 擴(kuò)增體系為5 μL，其中包括DNA模板1.0 μL,2.5 μL Mix,1.1 μL ddH2O以及0.4 μL Primer。

參考劉蕊等[16]所使用的程序，稍作修改，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃，預(yù)變性3 min；95℃變性15 s，退火(引物不同，退火溫度不同)20 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。

1.2.3 電泳檢測(cè)

使用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。每孔點(diǎn)樣量為1.5 μL，緩沖液為0.5×TBE，恒壓180 v，電泳90 min。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

電泳結(jié)束后，采用Gelred核酸染料進(jìn)行凝膠染色[17]，觀察并統(tǒng)計(jì)條帶。利用50 bp DNA Marker 作為分子量參考，每個(gè)SSR 位點(diǎn)，不同授粉系的單株在相同遷移率上有帶記為 1，無帶記為 0，建立 SSR 分子標(biāo)記的 1/0 矩陣數(shù)據(jù)庫(kù)。利用MEGA7.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用UPGMA方式進(jìn)行聚類分析，得到4份多胚授粉系的遺傳關(guān)系樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物多態(tài)性

本研究通過15對(duì)SSR引物對(duì)4份甜菜多胚授粉系進(jìn)行擴(kuò)增，15對(duì)SSR引物共擴(kuò)增出63條帶，且均為多態(tài)性條帶，其中TC55擴(kuò)增條帶最多為6條，LNX47為2條，其余引物擴(kuò)增的條帶總數(shù)為2～3條，實(shí)驗(yàn)中用到的引物名稱及其序列見表2。如圖1為引物L(fēng)59對(duì)50份單株材料的擴(kuò)增條帶圖，總共擴(kuò)增出3條帶，多態(tài)帶3條。擴(kuò)增結(jié)果表明，這15對(duì)引物可以用于甜菜不同單株之間的遺傳多樣性分析。

表2 SSR引物信息

圖1 引物L(fēng)59對(duì)2B796的40個(gè)甜菜單株的PCR擴(kuò)增圖譜

2.2 遺傳距離及聚類分析

利用MEGA 7.0計(jì)算同一授粉系不同個(gè)體之間的遺傳距離。結(jié)果顯示授粉系2B051的不同單株間的最大遺傳距離為0.563，最小為0.141，平均遺傳距離0.350，授粉系2B051的聚類分析圖見圖2(另外三個(gè)授粉系的聚類圖略)，根據(jù)遺傳相似矩陣，在遺傳距離為0.195處，可將50個(gè)單株分為2個(gè)大類群，類群Ⅰ包括6個(gè)單株，類群Ⅱ包括44個(gè)單株。類群Ⅰ、Ⅱ又可以分為多個(gè)亞群，類群Ⅰ在遺傳距離為0.185時(shí)又可以將類群Ⅰ分為2個(gè)亞群(Ⅰ-1、Ⅰ-2)，亞群Ⅰ-1共有43個(gè)單株，亞群Ⅰ-2共有1個(gè)單株。類群Ⅱ在遺傳距離為0.150時(shí)可以分為2個(gè)亞群(Ⅱ-1、Ⅱ-2)，亞群Ⅱ-1共有1個(gè)單株，亞群Ⅱ-2共有5個(gè)單株。

圖2 2B051的50個(gè)單株聚類分析圖

授粉系2B796的不同單株間最大的遺傳距離為0.538，最小遺傳距離為0.115，平均遺傳距離為0.356。根據(jù)遺傳距離越大，其兩者的親緣關(guān)系越疏遠(yuǎn)的理論基礎(chǔ)分析，以遺傳距離為0.175標(biāo)準(zhǔn)，將50個(gè)單株分為8個(gè)類群，第1個(gè)類群共有2個(gè)單株，第2類群共有4個(gè)單株，第3個(gè)類群共有3個(gè)單株，第4個(gè)類群共有2個(gè)單株，第5個(gè)類群，共有10個(gè)單株，第6個(gè)類群共有8個(gè)單株，第7個(gè)類群共有10個(gè)單株，第8個(gè)類群，共有11個(gè)類群。

授粉系2B802的遺傳距離在0.132～0.528 之間，平均遺傳距離為0.342。當(dāng)遺傳距離為0.200時(shí)，授粉系2B802可以分為2個(gè)大類群，當(dāng)遺傳距離為0.1750時(shí)，可以分為5個(gè)類群分別為類群一包括單株3共一個(gè)單株，類群二包括單株39、單株34、單株40共3個(gè)單株，類群三包括單株36、單株27共單株，類群四包括11個(gè)單株8、12、16、4、18、24、22、23、17、41、43，類群五包括單株10、14、46、45、13、32、21、48共8個(gè)單株。1 、44、30、15、19、2、36、20、33、9、49、37、42、5、29、7、6、28、31、38、25、26、50、11、47，共25個(gè)單株。

授粉系2B807的遺傳距離在0.140～0.509 之間，其平均遺傳距離是0.352。當(dāng)遺傳距離為0.200時(shí)，授粉系2B807的50個(gè)單株可以分為2大類群，類群Ⅰ包括49個(gè)單株，類群Ⅱ只有1個(gè)單株。當(dāng)遺傳距離在0.195時(shí)，類群Ⅰ可以分為亞群Ⅰ-1、亞群Ⅰ-2。亞群Ⅰ-1包括48個(gè)單株，亞群Ⅰ-2包括1個(gè)單株。

綜合4個(gè)授粉系的信息表明，同一授粉系不同個(gè)體之間存在較大的差異性，同一授粉系內(nèi)部遺傳差異較大。

3 討論與結(jié)論

種質(zhì)資源的遺傳多樣性主要是指種群內(nèi)個(gè)體間遺傳的差異，是生物遺傳進(jìn)化和再生產(chǎn)的基礎(chǔ)，是遺傳多樣性的核心和重要組成部分，對(duì)甜菜品種改良和新品種選育有直接影響的是種質(zhì)遺傳多樣性的豐富程度[18]。李滿紅等指出甜菜新品種種植和生產(chǎn)的瓶頸問題是缺乏優(yōu)良的種質(zhì)資源，特別是缺乏高產(chǎn)、高糖和多種適合抗病機(jī)械化作業(yè)的資源材料[19]。

本實(shí)驗(yàn)通過15對(duì)引物分別對(duì)4份甜菜授粉系50個(gè)單株進(jìn)行PCR擴(kuò)增及引物多態(tài)性分析，結(jié)果表明四份甜菜授粉系內(nèi)部具有極其豐富的多態(tài)性。通過遺傳距離及聚類分析結(jié)果表明，甜菜2B051的遺傳距離在0.141～0.563之間，甜菜2B796的遺傳距離在0.115～0.538之間，甜菜2B802的遺傳距離在0.132～0.528 之間，甜菜2B807的遺傳距離在0.140～0.509 之間，其平均遺傳距離分別為0.350、0.356、0.342、0.352。表明這四種甜菜多胚授粉系不同單株之間的遺傳距離大，遺傳多樣性高，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。聚類分別將四份授粉系的50個(gè)單株分為多個(gè)類群，由此進(jìn)一步說明同一授粉系的不同單株之間的遺傳多樣性高。

近年來發(fā)現(xiàn)國(guó)外甜菜品種的一致性非常好，但是國(guó)產(chǎn)甜菜品種的一致性較差，原因可能是由于國(guó)外甜菜品種的父母本比較純，母本為較純的自交系，而父本也可能具有自交可育基因，經(jīng)過多代自交而成。而我國(guó)多胚種質(zhì)資源中缺乏自交可育基因，因此大都通過母系選擇或者混合輪回選擇的方法創(chuàng)造多胚授粉系，通過本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這種方法創(chuàng)造的授粉系內(nèi)部遺傳差異較大，純度低，這也造成了我國(guó)自育的甜菜品種一致性較差。

在育種工作中，可以有目的地選擇和使用甜菜材料。決定甜菜育種成敗的關(guān)鍵是親本選配，在選擇親本材料作為雜交育種親本時(shí)，除考慮材料間的親緣關(guān)系外，還要考慮其復(fù)雜的遺傳組分，盡可能挑選親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，遺傳背景不同的材料作為父母本，這樣才能提高雜種優(yōu)勢(shì)，有助于選育出更好的后代雜交種[20]。在今后的的育種中，我們要更多的引入具有自交可育基因的多胚種質(zhì)資源，創(chuàng)造甜菜多胚自交系，對(duì)指導(dǎo)甜菜雜交育種工作與未來的甜菜育種研究具有重要指導(dǎo)意義。

致謝

本研究由財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-170111)資助。