種子引發(fā)對植物次生代謝的影響

周 珂，劉乃新，2

(1.黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080； 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部甜菜品質(zhì)監(jiān)督檢驗測試中心，黑龍江 哈爾濱 150080)

0 引言

非生物脅迫比如干燥和惡劣的溫度對農(nóng)產(chǎn)品有著很大的不利影響。這些非生物脅迫是抑制或延遲種子萌發(fā)和幼苗建立的原因。發(fā)芽是植物生長過程中的一個關(guān)鍵階段，對環(huán)境條件的變化有高度的反應(yīng)，它被與胚胎發(fā)育相關(guān)的生理、生化和分子過程控制。非生物脅迫會導(dǎo)致細胞中幾個生理、生化和分子過程的一系列變化，它們擾亂植物細胞的代謝平衡，這可能導(dǎo)致氧化應(yīng)激，膜損傷、細胞呼吸減少和活性氧產(chǎn)生。

種子引發(fā)是一種前景良好的策略，通過提高發(fā)芽率和出苗整齊度來提高種子的萌發(fā)表現(xiàn)，從而使幼苗更好更快地發(fā)育。目前已經(jīng)開發(fā)了幾種種子引發(fā)方法來改善種子萌發(fā)和幼苗生長，用幾種藥劑引發(fā)種子，從而增強植物抗逆性已經(jīng)發(fā)展成為一種有前景的方法。種子可以用不同的化學(xué)物質(zhì)、離子、有機化合物、激素和抗氧化劑來引發(fā)；種子引發(fā)的成功與引發(fā)過程中的環(huán)境變量、植物種類、種子數(shù)量和活力以及引發(fā)方法密切相關(guān)。

種子引發(fā)刺激許多涉及發(fā)芽早期階段的生理、生化和分子機制，并且它可以誘導(dǎo)非生物脅迫耐受機制，從而在幼苗建立期間和之后改善生長。種子引發(fā)激活一系列生理、生化、細胞、系統(tǒng)和分子調(diào)節(jié)，在非生物脅迫條件下增強植物的生長。

種子引發(fā)通過吸脹過程中的代謝修復(fù)、滲透調(diào)節(jié)和刺激發(fā)芽前的代謝過程來提高種子的發(fā)芽率和均勻性。包括早期的儲備動員，修復(fù)機制，和復(fù)制過程中的DNA處理帶來的影響。種子引發(fā)促進了很多種子萌發(fā)的相關(guān)的活動，如能量代謝、儲備動員、胚乳弱化、呼吸和支持胚細胞的擴張。種子引發(fā)通過調(diào)節(jié)DNA修復(fù)途徑、降解酶、過氧化氫酶和其他抗氧化清除酶、蛋白質(zhì)和核酸的合成、磷脂和固醇的積累來促進萌發(fā)。

種子引發(fā)還促進了與非生物脅迫相關(guān)的特定防御機制。它增加了保護蛋白的積累，如熱休克蛋白(HSPs)和胚胎形成豐富的晚期，增強抗氧化清除酶，如SOD, GPX和CAT，激活膜外排泵，上調(diào)過氧化物還原蛋白基因編碼。種子引發(fā)可以調(diào)節(jié)耐受性，通過增加蛋白質(zhì)合成潛力和翻譯后修飾以及保持翻譯轉(zhuǎn)化率的最優(yōu)商。

國外很多國家已經(jīng)廣泛地使用種子引發(fā)技術(shù)，我國這幾年才意識到種子引發(fā)的重要性，由于起步時間晚，形成了我國的甜菜種子引發(fā)技術(shù)一直處于摸索階段的局面。我國關(guān)于甜菜的種子引發(fā)的技術(shù)的研究越來越多，如程大友等利用氯化鈉鹽溶液對甜菜種子進行外理。表明低濃度的氯化鈉溶液對甜菜種子的萌發(fā)有一定的促進作用[1]。劉軍利用4種不同濃度的微量元素及植物生長調(diào)節(jié)劑對甜菜種子浸種表明錳、硼、鋅等微量元素浸種能激化甜菜種子的活力，提高發(fā)芽勢和發(fā)芽率，促進幼苗的生長[2]。魯兆新等利用植物生長劑、維生素、微量元素等多種藥劑，進行甜菜種子活化劑的配方篩選及室內(nèi)發(fā)芽試驗選出1個效里好的配方制成甜菜種子活化劑[3]。王海鳳等利用不同濃度的水楊酸對甜菜抗、感叢根病品種進行浸種處理，表明適宜濃度的水楊酸均對抗病品種和感病品種的種子萌發(fā)有促進作用[4]。宋柏權(quán)等研究引發(fā)技術(shù)對甜菜紙筒育苗出苗的影響，表明引發(fā)技術(shù)處理過的甜菜種子出苗快，利于紙筒育苗苗床管理，提高育苗質(zhì)量[5]。

1 種子引發(fā)的主要方法

1.1 液體引發(fā)(Liquid priming)

液體引發(fā)是以溶質(zhì)為引發(fā)劑, 種子置于溶液濕潤的濾紙上或浸于溶液中, 通過控制溶液的水勢調(diào)節(jié)種子吸水量。常用的包括無機鹽類，如：硝酸鉀、磷酸鉀、硝酸鈣、氯化鈉、氯化鎂、氯化鈣等小分子化合物, 聚乙二醇6000(PEG 6000) 或聚乙二醇8000 ( PEG 8000) 、交聯(lián)型丙烯酸鈉(SPP) 、聚乙烯醇(PVA)等大分子化合物。SPP 是一種高度親水樹脂, 吸水量強達 500 倍, 保水力強, 且可均勻緩慢地釋放水分, 在提高豌豆、番茄、菠菜、甜椒等種子的活力方面, 表現(xiàn)出很好的效果[6]。PVA 在引發(fā)黃瓜、苦瓜、線椒、茄子、菜豆等種子上也有很好的效果, 能明顯地提高種子活力、萌發(fā)率和抗冷能力[7-10]。

1.2 固體基質(zhì)引發(fā)(Solidmatrix priming,SMP)

利用固體載體為基質(zhì)進行引發(fā)[11]。此方法是將要處理的種子、預(yù)先定量的固體基質(zhì)材料及定量的水混合，且使溶液達到穩(wěn)定，然后將混合液放置在能使空氣進入，還要能減少蒸發(fā)損耗的容器內(nèi)(例如上部有小開口的密閉容器)，在一定溫度下處理種子一段時間，使種子從基質(zhì)中充分吸水但不萌發(fā)，達到水分含量均衡的狀態(tài)，最終使植株活力增強。任何種子都可以通過這種方法處理，包括大量的蔬菜、林木及農(nóng)作物種子。如黃瓜、生菜、胡蘿卜、洋蔥、甜瓜、甜玉米、番茄、茄子、辣椒、豆類、蘿卜、南瓜、豌豆、花種、紫花首蓓及大豆等[12]。

1.3 滾筒引發(fā)(Drum priming)

英國國際園藝研究組織根據(jù)引發(fā)的基本原理發(fā)明了滾簡引發(fā)體系，這一技術(shù)發(fā)明者Rowse于1991年、1992年申請到專利[13]。此法是先將種子放置在鋁質(zhì)的滾筒內(nèi)，然后噴入水汽，滾筒以水平軸轉(zhuǎn)動，滾筒內(nèi)種子在滾筒周線上以每秒1-2 cm的速度轉(zhuǎn)動，同時把水按照可控的比例釋放入腔室，種子僅在接觸腔室內(nèi)壁的過程中充分吸收水分，通過控制一定時間的吸水，可使種子達到萌發(fā)的含水量水平時停止水合，防止種子提前萌芽。一般來說種子在滾筒內(nèi)吸濕5 d至15 d，然后用空氣流干燥種子[14]。試驗采用滾筒引發(fā)方法處理蜜紅無籽西瓜種子, 研究發(fā)現(xiàn)在21℃、70%濕度條件下,引發(fā)處理48 h的效果最好,種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均為最高,與對照相比,分別提高了48.7個百分點、43.7個百分點和11.0[15]。

1.4 生物引發(fā)(Bio-priming)

生物引發(fā)是將種子生物處理與播前控制吸水方法相結(jié)合的種子處理新技術(shù)，引發(fā)期間利用有益真菌或細菌作為種子保護劑，讓其大量繁殖布滿種子表面，使幼苗免遭有害菌的侵襲[16]。生物引發(fā)的一般步驟是先將種子進行表面消毒，用成膜劑(如甲基纖維素)包膜種子，然后將種子放在兩層發(fā)芽紙或紙巾間在適宜的溫度下緩慢吸水至一定水平。據(jù)報道，甜玉米種子用帶有熒光假單細菌(Pseudomonas fluorescens)AB254的1.5%甲基纖維素懸浮液包衣，包衣種子短暫回干2 h，然后在23℃下吸水20 h并立即播種，能在一定程度上防止猝倒病的發(fā)生且提高4周苗齡的苗高[17]。可以將生物引發(fā)與滲透引發(fā)結(jié)合，可以提高番茄健康苗的比率[18]。

1.5 膜引發(fā)(Membrane Priming)

此方法是將種子與一種半滲透性膜(該膜具有內(nèi)、外兩個表面)的外表面接觸 ,PEG溶液直接與膜的內(nèi)表面接觸，種子通過半滲透性膜從PEG溶液中吸取水分[19]。在吸取水分的過程中，種子和半滲透性膜不斷周期性地相互滾動，使水分均勻轉(zhuǎn)移，并充分覆蓋了種子的整個表面，從而完成種子的引發(fā)過程。這種處理方法既可適用于大量的種子引發(fā)，也可對少量的種子(如名貴的花卉種子)進行引發(fā)，并且優(yōu)于基質(zhì)引發(fā)，引發(fā)后不需要進行種子分離。這種引發(fā)方法應(yīng)用于:胡荽、茴香、牛至屬植物、辣椒、歐芹、韭、櫻草屬的植物、天竺葵、旱芹、紫羅蘭等，其最大優(yōu)點是適用于表面有粘液的種子的引發(fā)，如紫羅蘭和鼠尾草的種子[20]。

1.6 水引發(fā)(Water Prming)

水引發(fā)是在控制給水條件下使種子定量吸水，達到促進萌發(fā)且不引起吸脹傷害(Imbibition damaze)的浸種技術(shù)。Rowse發(fā)明的滾筒引發(fā)技術(shù)(Drum priming，是水引發(fā)技術(shù)中具有開拓性的成果。該法是先將種子放置在鋁質(zhì)滾筒內(nèi)，然后噴入水汽和控制滾筒轉(zhuǎn)速，每批種子的吸水量和吸水速率采用計算機系統(tǒng)控制，處理時間5-15 d。Warren等在此基礎(chǔ)上作了改進，按一定的間隔時間定量加水，有效地使甜玉米種子緩慢吸水，取得了很好的引發(fā)效果。該技術(shù)已在蔬菜種子中大規(guī)模應(yīng)用，如：洋蔥、胡蘿卜[21]。

2 影響種子引發(fā)的因素

種子引發(fā)的有效性主要受激發(fā)液的滲透勢、激發(fā)時間、環(huán)境溫度、激發(fā)方式、種子批號與活力、植物種類以及激發(fā)種子的貯存條件等環(huán)境變量的影響。

2.1 溫度

種子的引發(fā)和萌發(fā)都需要相似的溫度和其他環(huán)境因素。每種作物都有不同的最適發(fā)芽溫度。由此可見，番茄種子的最適引發(fā)和萌發(fā)溫度為27- 28℃。然而，洋蔥種子在20℃下引發(fā)效果更好。這可能是由于每一種植物都有不同的最適溫度來進行引發(fā)種子。種子吸脹過程中的低溫會延緩種子引發(fā)的生理生化過程，即使種子吸收了大量的水分，也需要更長的時間才能達到相同的效果。

2.2 氧氣

大多數(shù)種子可以在含20%氧氣的環(huán)境中發(fā)芽，但在種子引發(fā)過程中，它們甚至可以在含氧量較低的環(huán)境中發(fā)芽。種子灌漿降低了種子對低氧水平的敏感性。種子需要足夠的氧氣(超過10%)。在較低的氧氣水平下，一些種子發(fā)生無氧呼吸，導(dǎo)致乙醇增加。在許多作物中，這種處理促進了種子更快的萌發(fā)和幼苗的生長。另一方面，種子在曝氣溶液中長期浸泡會對種子引發(fā)產(chǎn)生有害影響，因為這會增加種子的代謝和鹽滲透。由于氧的溶解度低(50%)和遷移率低(10%)，種子的相對氧可利用性降低了5%。因此，需要通氣系統(tǒng)來支持種子呼吸，特別是在PEG溶液中。與不加氣的PEG溶液相比，加氣PEG溶液中的種子萌發(fā)率有更高的提高。研究發(fā)現(xiàn)，加氣K3PO4溶液與不加氣K3PO4溶液對生菜種子萌發(fā)沒有影響。此外，在加氣PEG或鹽溶液中浸泡種子比潮濕的固體介質(zhì)更有好處。

2.3 滲透勢和溶液濃度

在蒸餾水中滲透勢為零(0 MPa)，在啟動液中為負(>～2.0 MPa)，但在風(fēng)干種子中，由于細胞質(zhì)中溶質(zhì)含量高，滲透勢可低至-350～-50 MPa。當(dāng)種子浸泡在引發(fā)液中時，水會從水勢較高的溶液中移到水勢較低的溶液中，直到達到平衡。浸種過程中種子的自吸特性與種子粒徑、表皮滲透性和可水化基質(zhì)含量直接相關(guān)。引發(fā)液的濃度和水勢是決定種子引發(fā)效果的重要因素。引發(fā)液中的離子濃度過高時，會對種子引發(fā)產(chǎn)生不良影響。在種子內(nèi)很容易被吸收和積累，由于營養(yǎng)不平衡和細胞毒性作用，導(dǎo)致種子引發(fā)受到抑制。如果濃度低于最低值，引發(fā)處理將不能啟動預(yù)期的引發(fā)的生理生化過程。另一方面，如果引發(fā)液的濃度過高或者持續(xù)的時間過長，由于毒性作用，種子引發(fā)會受到抑制或者完全受到抑制。在干旱或者鹽脅迫的情況下，引發(fā)液的濃度會影響種子的性能。用高濃度的鹽溶液作底液，處理時間長，發(fā)芽率低。用低濃度的鹽溶液，處理時間短，提高了種子的性能，從而提高了種子的發(fā)芽率，提高了幼苗的活力，提高了耐鹽脅迫能力。

不同的研究表明，在引發(fā)液中增加藥劑(如NaCl、CaCl2、KNO3和微量元素)濃度可能會降低許多作物的發(fā)芽指數(shù)和幼苗生長。這些降低可能是由于更大的滲透壓和離子毒性。

2.4 處理時間

處理時間的長短對于某些植物來說很重要?？煽匚欠N子引發(fā)技術(shù)的基礎(chǔ)，會受到浸泡時間的影響。引發(fā)時間和最佳引發(fā)培養(yǎng)基濃度是決定種子引發(fā)成功和幼苗建立的一個非常重要的因素。這是因為在引發(fā)過程中，種子達到種子吸水的飽和水平。在胚根出芽前，對種子進行引發(fā)是有益的。然而進一步延長引發(fā)時間，可能導(dǎo)致種子在干燥過程中死亡，會對種子的引發(fā)造成不利的影響。理想的引發(fā)時間因引發(fā)劑種類、溶液滲透勢和引種溫度的不同而不同。

引發(fā)溫度在10℃-25℃之間，啟動時間在12 h-5 d之間，視作物而定。種子處理、引發(fā)時間和引發(fā)溫度對胡蘿卜、生菜和洋蔥種子的發(fā)芽率有顯著影響。

一般來說，種子引發(fā)的成功受到引發(fā)時間和蔬菜種類的影響。一般情況下，種子引發(fā)成功與否受引發(fā)時間長短和蔬菜品種的影響。

2.5 種子質(zhì)量

種子質(zhì)量是影響種子引發(fā)過程的關(guān)鍵因素。為了獲得一個良好的引發(fā)效果，使用有活力和無菌的種子，對于種子的引發(fā)過程，使用質(zhì)量好的種子是很必要的。不同種子的活力存在差異。因此，不同種子批次的種子引發(fā)存在差異，為了使種子具有最大的活力，需要在接近生理成熟期的時間收獲種子。

2.6 光照

如果植物需要光來進行萌發(fā)，在引發(fā)過程中可能需要光。光胚種子如生菜和芹菜需要光來發(fā)芽，可以在種子引發(fā)時，將種子暴露在光下，以此減少種子的休眠。

3 種子引發(fā)的生理機能

種子引發(fā)是一項控制種子緩慢吸水和逐步回干的種子處理技術(shù)[22]，是在控制條件下使種子緩慢吸水停留在吸脹的第二階段,讓種子進行預(yù)發(fā)芽的生理生化代謝和修復(fù)作用,促進細胞膜、細胞器的修復(fù)和酶的活化,處于準(zhǔn)備發(fā)芽的代謝狀態(tài),但防止胚根的伸出,為萌發(fā)提前進行生理準(zhǔn)備的一種播前種子處理技術(shù)。引發(fā)的目的在于提高種子迅速、整齊出苗能力和幼苗的抗逆性[23],從而間接節(jié)約種子,降低成本,提高效益[21]。

種子發(fā)芽時的水分吸收是一個正常的三相過程。首先是快速的初始吸水(第一階段，即吸脹)，接著是一個水分含量略有變化的激活階段(第二階段)，然后隨著胚胎軸的伸長和生長的恢復(fù)，吸水進一步增加(第三階段)。在激活期結(jié)束之前，種子的引發(fā)是一個可逆過程，在貯藏過程中，種子可以再次脫水并保持存活，在適當(dāng)?shù)臈l件下又可以重新發(fā)芽。當(dāng)水分進入干燥的種子時，不受休眠和表皮通透性影響的種子引發(fā)過程分為三個階段。吸水過程可分為以下三個階段:

3.1 初期的快速吸收

當(dāng)干燥的種子浸泡在水里，種子細胞內(nèi)的溶質(zhì)降低了膨壓勢，導(dǎo)致快速吸水(第一階段)，并且隨著種子在吸漲過程中的水勢增加，種子的含水量也在增加。細胞壁的膨脹阻力導(dǎo)致細胞內(nèi)充盈電位的增加。在種子吸脹過程中，在胚胎中合成蛋白質(zhì)，利用現(xiàn)有的和新的信使核糖核酸(mRNA)，并修復(fù)和合成DNA和線粒體。當(dāng)種子中細胞的水勢增加時，水分吸收減慢，種子進入滯后期(階段Ⅱ)。

3.2 開始代謝過程的種子(遲滯期)

第二階段被稱為滯后階段，在這一階段，種子的水勢與種子環(huán)境的水勢保持平衡。在這一階段，種子在相對較長的時間內(nèi)吸收少量水分，顯著的代謝活動與酶的激活和呼吸的增加有關(guān)。因此，種子可以完成萌發(fā)前的所有生理過程，并且為胚根的出現(xiàn)和萌發(fā)相關(guān)的主要代謝變化做好準(zhǔn)備，如新的線粒體和蛋白質(zhì)合成，都在這個階段開始。因此，它也被稱為激活階段。第一階段和第二階段是種子引發(fā)過程中最微妙的階段，是種子引發(fā)成功的關(guān)鍵。

3.3 后續(xù)胚根的出現(xiàn)和恢復(fù)增長

當(dāng)胚萌發(fā)前，階段Ⅱ完成時，進入階段Ⅲ，胚根突破種皮，水分和氧氣吸收迅速增加。同時，這一階段促進根的生長，其出現(xiàn)與細胞的分裂和擴大相一致。

4 種子引發(fā)的作用

在正常和逆境條件下，種子的引發(fā)和種植是影響種子生命周期的主要因素。為了提高種子的性狀，采用了很多方法來改進引發(fā)進程。種子引發(fā)是提高種子萌發(fā)潛力和提高非生物脅迫耐受性最常用的方法。不同的催種方法和催種劑在許多作物上都有很好的催種效果，這種有益的作用不僅用于種子的引發(fā)，還可以延伸到后期。種子引發(fā)是提高種子萌發(fā)性能的一種方式，特別是在不同的環(huán)境條件下或者對質(zhì)量較差的種子進行引發(fā)。種子引發(fā)的好處也在隨后的幼苗生長中發(fā)現(xiàn)，形成了更強的作物抗倒伏能力，有較強的與雜草競爭和耐病原體感染的能力和在非生物脅迫條件下改善植物的生長。種子引發(fā)可以打破或緩解生菜和菊苣等植物的光休眠和熱休眠。種子發(fā)芽較早，發(fā)芽均勻，幼苗生命力強，耐受性強。種子引發(fā)促進根毛的增殖，這可能導(dǎo)致更有效的營養(yǎng)和水分吸收。此外，它還能減少幾種種子傳播的病原體，包括蕓苔屬種子中的油菜黃單胞菌和芹菜中的葡萄球菌。種子引發(fā)是一項低成本、簡單、低風(fēng)險的技術(shù)，對農(nóng)民來說，是一項有用的技術(shù)。

4.1 提高種子發(fā)芽和出苗能力

經(jīng)引發(fā)的種子，發(fā)芽率高、出苗整齊、畸苗率較低。甜椒種子經(jīng)PEG引發(fā)后，胚根長勢及活力指數(shù)均明顯高于對照，幼苗地上部鮮重、干重及根鮮重、干重也明顯高于對照[24]。引發(fā)的番茄種子，出苗提早，葉面積增大，光合能力增強，植株生長量增加[25]，用硝酸鈣溶液引發(fā)油菜種子，提高了大田油菜的活力[26]，在20%和25%的水分條件下，種子的發(fā)芽指數(shù)顯著提高，平均發(fā)芽天數(shù)顯著縮短。25%PEG滲透調(diào)節(jié)能提高苦瓜種子活力，滲透調(diào)節(jié)4h，發(fā)芽率、生長勢和活力指數(shù)分別由對照62.5%、3.05%和1.95%提高到90.6%、7.88%和7.15%[8]。

4.2 提高種子的抗逆性

經(jīng)過鹽混合引發(fā)后的水稻種子的淀粉酶活性顯著高于未處理的干種子，且處理后0.58% NaCl鹽逆境處理對其淀粉酶活性的影響較小，表明引發(fā)有利于種子在逆境條件下分解貯藏物質(zhì)，供給芽生長[27]。引發(fā)可以促進雜交水稻種子對已有果糖的利用，降低種子內(nèi)部果糖水平，增加種子內(nèi)部脯氨酸含量，并提高后期鹽脅迫幼苗內(nèi)部果糖水平，從而增強雜交水稻幼苗的耐鹽性[28]。鹽引發(fā)有效地將雄性不育香瓜在冬季15℃低溫下的發(fā)芽率提高50%左右。這說明經(jīng)引發(fā)后的種子對低溫的抗性提高[29]。PEG引發(fā)番茄種子，由于耐鹽性和種子活力的提高，從而提高了種子在含有 NaCl 0.80 g/kg土壤中的發(fā)芽率和產(chǎn)量，并且平均發(fā)芽時間縮短了33%[30]。

4.3 提高未成熟種子和老化種子的活力

未成熟種子由于胚部尚未發(fā)育成熟，發(fā)芽率很低，通過引發(fā)種子可以進一步實現(xiàn)生理成熟，從而提發(fā)芽率。老化種子由于質(zhì)膜結(jié)構(gòu)受到嚴重破壞，細胞質(zhì)物質(zhì)外滲，使種子活力下降。在引發(fā)過程中，種子緩慢吸水，使細胞膜有充分時間進行修復(fù)，進行生化作用及修補老化結(jié)構(gòu)，從而提高種子的活力，PEG引發(fā)后老化甜椒種子發(fā)芽指數(shù)提高，發(fā)芽速度加快。

4.4 打破種子休眠

芹菜、萵苣種子在高溫下萌發(fā)時容易進入熱休眠狀態(tài)，通常溫度在25-30℃時發(fā)芽就受到抑制，當(dāng)溫度高于35℃時很少有種子發(fā)芽。用PEG引發(fā)、無機鹽小分子引發(fā)都能使芹菜、萵苣種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)以及發(fā)芽勢顯著提高，即打破休眠[31]。

4.5 降低種皮粘度

對于香瓜種子利用硝酸鉀引發(fā)6 d后，種皮粘性降低，發(fā)芽速度提高，縮短從定植到收獲的時間[32]。

5 種子引發(fā)時的生理、生化和分子的反應(yīng)

5.1 種子內(nèi)部形態(tài)和生理生化的變化

種子引發(fā)后的生理生化變化引發(fā)過后種子內(nèi)部會發(fā)生形態(tài)和各種生理生化的變化。主要表現(xiàn)在以下幾個方面:(1)弱化了種子內(nèi)部胚根周圍的限制組織(如番茄種子的胚乳帽)和促進胚根生長；(2)增加細胞彈性和促進胚生長；(3)促進細胞膜修復(fù)和提高膜的完整性，降低種子內(nèi)容物的外滲，即使在低溫逆境下，引發(fā)種子細胞吸脹仍均勻，細胞器發(fā)育良好，ATP酶在質(zhì)膜上分布均勻，膜結(jié)構(gòu)與功能發(fā)育正常；(4)引起一些與種子發(fā)芽、活力和抗劣變相關(guān)酶活性的提高；(5)引起種子內(nèi)源激素水平變化；(6)促進RNA和蛋白質(zhì)合成以及ATP利用；(7)活化水解酶而引起種子內(nèi)蛋白質(zhì)、脂肪和淀粉等貯存物的遷移降低染色體畸變頻率，修復(fù)因老化引起的染色體損傷[33]。

5.2 種子引發(fā)引起分子水平的變化

Castro等[34]通過DNA含量的分析研究了番茄引發(fā)種子胚根尖細胞周期的作用。結(jié)果表明干種子的細胞停留在細胞周期的G1階段,在標(biāo)記中未見到微管蛋白。引發(fā)吸收水24 h后，處于G2階段的細胞的數(shù)量增加，在24-48 h期間開始發(fā)現(xiàn)55-KD的微管蛋白。因而,滲透引發(fā)使微管蛋白和DNA含量增加。引發(fā)后的發(fā)芽率、微管蛋白和DNA含量均表現(xiàn)較快的增加。各處理微管蛋白和含量的增加均比可見的發(fā)芽表現(xiàn)早。Castro等[35]后來通過數(shù)量遺傳和細胞分析對DNA合成和微管蛋白的積累的研究,鑒定了番茄種子吸水和引發(fā)期間胚的細胞周期情況。結(jié)果表明大多數(shù)的未處理的種子胚細胞限制在G1階段,說明沒有DNA的合成,經(jīng)證實是缺乏澳脫氧尿苷的合成。引發(fā)后，在整個胚芽時期，一直可以觀察到DNA的合成和微管束的形成的全過程。在引發(fā)吸水的過程中，細胞周期蛋白的前期激活可能與發(fā)芽能力的提高有關(guān)。喬愛民等[36]利用RAPD技術(shù)對菜苔人工老化種子DNA的損傷和PEG引發(fā)處理的修復(fù)作用進行了研究,結(jié)果表明人工老化對菜苔種子基因組DNA具有損傷作用,表現(xiàn)為隨老化程度的加深，DNA帶逐漸減弱直至完全消失,而PEG引發(fā)對老化的菜苔種子損傷的DNA具有修復(fù)作用,表現(xiàn)為新的DNA帶產(chǎn)生,原有DNA帶增強。Achard等選擇了先前標(biāo)定的核糖體原生質(zhì)體蛋白PRL21的PRL21基因,用于分析發(fā)芽期間基因表達的活性。引發(fā)回干后發(fā)現(xiàn)種子AUBEI仍然存在,因此認為AUBEI可作為菠菜種子引發(fā)的標(biāo)記基因。

種子的播種至出苗時期，對作物立地起著重要的作用。種子引發(fā)被用來提高種子的發(fā)芽率和均勻性。因為吸脹時間縮短，種子引發(fā)的次數(shù)較多，增強種子的萌發(fā)代謝，改善修復(fù)過程。種子引發(fā)通過生理、生化、分子和細胞的變化，提高了種子的性能，使其更早、均勻地發(fā)芽。

種子引發(fā)的好處包括上調(diào)細胞分裂、細胞壁修飾、轉(zhuǎn)錄、儲備動員、翻譯、氧化應(yīng)激反應(yīng)和水運輸?shù)牡鞍踪|(zhì)和基因，其中DNA和膜修復(fù)優(yōu)于正常的吸脹。通過種子引發(fā)來改善萌發(fā)。種子引發(fā)上調(diào)了參與胚乳弱化的蛋白質(zhì)編碼基因，如木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)葡糖苷酶、甘露聚糖酶和擴張蛋白?；钚院捅磉_的蛋白質(zhì)可能通過胚乳收縮、細胞壁溶解和細胞質(zhì)凝結(jié)的收縮來降低胚根突起的物理耐受性。某些儲存蛋白如十字花科和球蛋白只在種子引發(fā)時被發(fā)現(xiàn)，而在種子萌發(fā)時不被發(fā)現(xiàn)。同樣的，應(yīng)激相關(guān)蛋白如熱休克蛋白是在滲透過程中合成的，而不是在水的自吸過程中合成的。這些蛋白質(zhì)在滲透過程中保護細胞免受水分脅迫，它們作為分子伴侶，保護自然受損的蛋白質(zhì)。低濃度的ROS起信號分子的作用。非生物脅迫條件導(dǎo)致過量的ROS產(chǎn)生和積累，導(dǎo)致氧化損傷。它們對高水平的分子有有害影響。它們會導(dǎo)致DNA氧化，導(dǎo)致DNA鏈斷裂，從而導(dǎo)致發(fā)芽失敗。種子引發(fā)在低水平上刺激ROS的產(chǎn)生，這反映了細胞分裂的強烈激活。引發(fā)的種子增強了細胞代謝中最重要的酶的活性。這些酶包括酸性磷酸酶、酯酶、乙醛糖酶和涉及調(diào)動儲存的酶，如α和β淀粉酶、異檸檬酸裂解酶。此外，種子引發(fā)可提高抗氧化酶活性的積累。這些增加可以通過減少活性氧的產(chǎn)生和增加種子萌發(fā)過程中活性氧的清除來優(yōu)化防御機制。在種子干燥過程中修復(fù)DNA的能力與種子的萌發(fā)過程有關(guān)。發(fā)芽前的代謝過程對從DNA損傷中恢復(fù)至關(guān)重要，其中包括清除ROS和DNA修復(fù)機制，如同源重組核苷酸、非同源端連接和堿基切除修復(fù)(Huang et al. 2008)。種子引發(fā)的分子反應(yīng)包括DNA修復(fù)機制和新RNA和蛋白質(zhì)合成的基因表達。胚胎中的DNA修復(fù)機制必須保持在合適的水平，以增加成功發(fā)芽的機會。在吸脹過程中激活的DNA修復(fù)機制恢復(fù)了胚胎細胞的細胞周期進程，進行DNA的復(fù)制，然后提高了引發(fā)效率，但DNA修復(fù)缺陷導(dǎo)致細胞死亡增加。DNA修復(fù)是種子引發(fā)的最有價值和最重要的過程，它決定了種子引發(fā)的潛在效益。種子引發(fā)促進萌發(fā)可能與某些特定基因的上調(diào)有關(guān)，如萌發(fā)相關(guān)基因、抗氧化劑和植物生長促進基因。種子引發(fā)誘導(dǎo)萌發(fā)前代謝所需的952個基因和75個蛋白質(zhì)的表達，包括轉(zhuǎn)錄活性，DNA的復(fù)制和修復(fù)機制。此外，它還誘導(dǎo)表達參與細胞周期調(diào)控和維持的基因編碼蛋白，直接或間接參與DNA修復(fù)的基因，以及APX、CAT和SOD基因。

6 脅迫誘導(dǎo)萌發(fā)種子的代謝變化

脅迫條件對許多植物種子的發(fā)芽有負面影響。在植物的生物生命周期中，種子的發(fā)芽和幼苗的生長是對非生物脅迫最敏感的階段。即使高質(zhì)量的種子，各種非生物壓力也會延遲或阻止種子發(fā)芽。在種子發(fā)芽的早期階段，非生物脅迫會對核酸、原蛋白和脂質(zhì)造成氧化損傷。

6.1 干旱、鹽分和高溫對植物生化、生理和代謝的影響

干旱、鹽分和高溫是對作物的發(fā)育、生長和產(chǎn)量產(chǎn)生不利影響的主要非生物脅迫。它們會引起植物的各種生化、生理和代謝變化，包括ROS的產(chǎn)生，可誘發(fā)膜脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致膜損傷、DNA的嚴重損害、細胞的滲漏和光合成分的破壞。鹽分影響種子發(fā)芽，它會通過滲透作用阻止浸泡期間的水吸收，或通過鈉離子和氯離子降低胚胎活力，鈉離子和氯離子對胚胎具有毒性作用。離子的毒性作用破壞了酶和其他大分子結(jié)構(gòu)，損害了細胞和細胞器，抑制了蛋白質(zhì)的合成。此外，鹽分改變了植物組織中的激素平衡。過多的鹽分與植物組織中的輔助素、赤霉素、水楊酸和細胞因子的減少以及脫落酸(ABA)和茉莉酸(JA)的增加有關(guān)。種子發(fā)芽被鹽分誘導(dǎo)的代謝過程的干擾所抑制，如：水吸收的減少和儲存的儲備動員的變化，從而影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)組織。

植物對鹽度和干旱的脅迫的反應(yīng)顯示出類似的生理機制。植物細胞將這兩種壓力視為缺水。同時，冷脅迫會擾亂細胞的代謝平衡，導(dǎo)致細胞呼吸減少和膜損傷。將發(fā)芽的種子暴露在各種非生物脅迫下會導(dǎo)致氧化脅迫，表現(xiàn)為過氧化氫、超氧化物和羥基自由基的過度產(chǎn)生，這些自由基具有很強的活性，會通過氧化核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，使細胞老化，對細胞造成損害 。

6.2 ROS與植物的抗氧化系統(tǒng)對植物非生物脅迫的影響

植物有一個抗氧化系統(tǒng)來清除有毒的ROS(活性氧)。抗氧化劑防御系統(tǒng)的有效運行對植物不耐受的非生物脅迫至關(guān)重要。ROS在植物中扮演兩個相反的角色：在低濃度時，它們作為信號分子調(diào)節(jié)防御反應(yīng)。同時，細胞中過量的ROS會對蛋白質(zhì)、膜脂質(zhì)、核酸、碳水化合物、色素、葉綠體和酶造成損害，最終導(dǎo)致氧化脅迫。ROS的損害取決于在適當(dāng)?shù)臅r間和地點生產(chǎn)和清除以維持ROS之間的平衡，而這種平衡可能被非生物脅迫所擾亂。當(dāng)植物在正常條件下生長時，ROS的產(chǎn)生和清除處于一種動態(tài)平衡。但當(dāng)植物暴露在各種非生物脅迫下時，ROS的產(chǎn)生和積累會破壞這種微妙的平衡。ROS引發(fā)細胞大分子(蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì))的損傷，并最終損害細胞結(jié)構(gòu)，甚至損害抗氧化系統(tǒng)。在非生物脅迫下，脂質(zhì)過氧化可能是參與抑制種子發(fā)芽的最重要的分子機制之一。非生物脅迫引起的ROS的產(chǎn)生增加了丙二醛(MDA)的含量，它是脂質(zhì)過氧化的最具誘變性的產(chǎn)物，并可能通過與細胞大分子反應(yīng)對細胞造成損害。一些研究報告了在各種非生物壓力下MDA含量的增加。它還可以提供非生物脅迫下細胞水平膜損傷的指示。因此，它的含量反映了植物組織的氧化損傷。損傷程度取決于ROS的形成與抗氧化清除系統(tǒng)對其的清除之間的平衡，抗氧化清除系統(tǒng)對氧化損傷提供了關(guān)鍵的保護，它似乎是一個相對重要的耐應(yīng)激特性。應(yīng)激引起的ROS積累是由抗氧化的系統(tǒng)來對抗的。抗氧化系統(tǒng)包括許多酶，比如抗氧化酶(如SOD和CAT)和低分子質(zhì)量抗氧化劑的非酶化合物，如AsA、谷胱甘肽、硫氧還蛋白和胡蘿卜素。因此，協(xié)助清除ROS和保護植物細胞的抗氧化能力與它們的耐鹽性有關(guān)。超氧化物在SOD的作用下轉(zhuǎn)化為過氧化氫(H2O2)，最后由CAT轉(zhuǎn)化為分子氧和水，從而防止H2O2形成極其危險的羥基自由基。在細胞膜改變過程中，這在種子內(nèi)部起著許多重要的作用。

種子生理學(xué)的重要組成部分是要承受由于ROS產(chǎn)量增加而造成的嚴重氧化損傷。從種子在母株上發(fā)育成熟和種子萌發(fā)開始，種子的代謝活性隨種子含水量的改變而發(fā)生巨大變化。代謝物濃度的改變主要是由于線粒體的呼吸活性增強和許多酶如NADPH氧化酶、草酸氧化酶、過氧化物酶和β-氧化途徑的活性增加。另一方面，ROS的產(chǎn)生會導(dǎo)致氧化損傷，直接影響萌發(fā)過程。在ROS分子中，H2O2發(fā)揮其作為信號分子的作用。然而，種子必須配備強大的ROS解毒系統(tǒng)，以迅速降低有害分子的濃度。這種解毒是由一個有效的系統(tǒng)進行的，該系統(tǒng)包括酶(即超氧化物歧化酶、谷胱甘肽還原酶、單脫氫抗壞血酸還原酶、過氧化氫酶)和非酶抗氧化分子(即還原谷胱甘肽、抗壞血酸)。在較低濃度下，ROS的產(chǎn)生也被認為是信號分子，如H2O2、硫化氫和一氧化氮，它們負責(zé)將種子從休眠階段轉(zhuǎn)變?yōu)槊劝l(fā)階段。

同樣，Kubala(2015a)等人證實，種子水合再干燥再回到原始含水量的過程會導(dǎo)致ROS的產(chǎn)量增加以及抗氧化酶系統(tǒng)的誘導(dǎo)。菠菜種子滲透引發(fā)后的AsA、GSH和APS的誘導(dǎo)也伴隨著超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的產(chǎn)生。因此，菠菜種子吸脹過程中AsA-GSH循環(huán)的誘導(dǎo)明確表明了它可以降低吸收種子中脂質(zhì)過氧化成分的水平。此外，Kubala等人(2015a)也描述了抗氧化防御系統(tǒng)的誘導(dǎo)僅僅是幼苗建立的需要，這發(fā)生在萌發(fā)的最后階段，因為過氧化氫酶的產(chǎn)量增加了。他們還通過整合蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法證實，由于引發(fā)引起的萌發(fā)與抗氧化系統(tǒng)的誘導(dǎo)密切相關(guān)。在甘藍型油菜種子的引發(fā)研究中，作者記錄了由于滲透引發(fā)對CAT2和PER21編碼基因的上調(diào)，并觀察了GR蛋白的積累。同樣，他們也記錄了PER13基因的上調(diào)導(dǎo)致種子在萌發(fā)過程中過氧化物酶、過氧化物還原蛋白和DHAR這些引物的積累。此外，作者推測甘藍型油菜水發(fā)種子的耐脅迫潛力與萌發(fā)過程中抗氧化代謝活性的誘導(dǎo)有關(guān)。CAT、SOD和APX產(chǎn)量的增加與各自基因的擴增表達有關(guān)。同樣，Nouman等人(2014年)認為，辣木葉提取物引發(fā)辣木種子即使在鹽脅迫條件下也能促進植物生長，這都是由于POD、CAT、SOD等抗氧化酶的產(chǎn)生。同樣，由于用β-氨基酸丁酸啟動的種子在萌發(fā)過程中POX和SOD的活性增強，會增加對氯化鈉和聚乙二醇脅迫的耐受性。同樣在煙草品種中，由于用腐胺引發(fā)種子后會誘導(dǎo)抗氧化酶，因此提高了對低溫脅迫耐受性(Nouman等人，2014年)。在Islam等人(2015年)進行的一項關(guān)于水引發(fā)小麥種子的研究中，APX、POD和CAT產(chǎn)量的增加會導(dǎo)致小麥幼苗的耐鹽性。應(yīng)用PEG，通過滲透作用改善了在嚴重干燥條件對高粱種子萌發(fā)和高粱幼苗建立的影響，這與SOD、POD、CAT、APX等抗氧化劑活性的增加有關(guān)(Zhang等2015a，b)。同樣，APX活性的增加以及CAT、POD和SOD活性的降低，也可以減少水稻種子中氧化鋅納米顆粒脅迫引起的負面影響(Salah等2015)。在貯藏期間，ROS的產(chǎn)生顯著影響種子的年齡。ROS會誘導(dǎo)種子的質(zhì)量降低。由于老化引起的種子質(zhì)量問題的恢復(fù)可以通過激活CAT來恢復(fù)，而種子引發(fā)在CAT的激活中起著重要作用。此外，已經(jīng)觀察到向日葵種子的老化會增加過氧化氫的儲存和CAT在基因表達水平以及蛋白質(zhì)含量上的減少(Kibinza等人，2011)。通過種子水引發(fā)消除了老化的負面影響，然后通過誘導(dǎo)基因的表達和酶的翻譯來合成CAT。引發(fā)會引起種子代謝發(fā)生巨大變化，從而增加了許多次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。這些代謝物在緩解種子的有害氧化刺激、恢復(fù)種子的老化以及調(diào)節(jié)ROS的產(chǎn)生方面發(fā)揮著重要作用。