X連鎖隱性點(diǎn)狀軟骨發(fā)育不良胎兒超聲影像與基因變異分析

朱海燕,陳媛媛,牛艷艷,張?jiān)粕?吳 迪,姜 琳

(中國人民解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心 a.婦產(chǎn)科;b.超聲醫(yī)學(xué)科，北京 100048)

X連鎖隱性點(diǎn)狀軟骨發(fā)育不良(chondrodysplasia punctata 1,X-linked recessive,CDPX1,OMIM:302950)，是一種相對罕見的以骨礦化異常為特征的先天性骨和軟骨發(fā)育缺陷，活產(chǎn)嬰兒發(fā)病率為1/100000，具有高度的臨床異質(zhì)性和遺傳異質(zhì)性[1]。CDPX1主要臨床表現(xiàn)包括：(1)軟骨內(nèi)骨形成區(qū)的點(diǎn)狀鈣化，嬰兒期X線檢查可觀察到骨骼具有特征性的骨骺點(diǎn)狀鈣化斑點(diǎn)(點(diǎn)狀骨骺)，斑點(diǎn)可在2～3歲間消失；(2)嚴(yán)重的面中部發(fā)育不良，鼻梁缺失或發(fā)育不全，導(dǎo)致鼻基部平坦，鼻尖突出減少；(3)遠(yuǎn)端指(趾)骨短縮；(4)身材矮??；(5)部分患者可合并傳導(dǎo)與感音混合性聽力下降。骨骼異常在成年期有所改善，但部分患者因嚴(yán)重的鼻頜發(fā)育不良、氣管和支氣管軟骨內(nèi)廣泛鈣化所致的上下氣道狹窄可導(dǎo)致呼吸異常，或伴有頸椎狹窄、不穩(wěn)定，采取對癥治療可部分緩解病情，絕大多數(shù)患者壽命正常。

門診就診的患兒，其面部特征或呼吸問題顯而易見，但妊娠期胎兒的面容或呼吸在產(chǎn)前超聲檢查過程中不易發(fā)現(xiàn)，因此關(guān)于CDPX1的產(chǎn)前診斷報道較少。本研究結(jié)合產(chǎn)前超聲檢查發(fā)現(xiàn)的胎兒面中部發(fā)育異常，應(yīng)用基于新一代高通量測序(next generation sequencing,NGS)技術(shù)的基因組拷貝數(shù)變異測序(copy number variation sequencing,CNV-seq)及全外顯子組測序(whole-exome sequencing,WES)技術(shù)，對胎兒進(jìn)行全面遺傳學(xué)分析及研究，最終為胎兒明確診斷為CDPX1，為該家系再生育提供遺傳咨詢，為產(chǎn)前超聲診斷及臨床咨詢提供實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料 孕婦(I:1)，35歲，G2P1，第一胎(II:1，與前夫生育)男性健康，見家系圖(圖1A)。外省醫(yī)院建檔產(chǎn)檢，胎兒(II:2)12周超聲CRL 5.8cm，NT 1.2mm。當(dāng)?shù)蒯t(yī)院NIPT檢測提示21、18、13號染色體非整倍體低風(fēng)險。22周超聲：胎兒生長發(fā)育與LMP孕周相符，因鼻孔顯示不清轉(zhuǎn)診我院。我院胎兒超聲復(fù)查：雙頂徑5.81cm，頭圍22.67cm，腹圍17.82cm，股骨長4.07cm；雙側(cè)腦室7.1mm；上唇連續(xù)；鼻尖低平，鼻額角>135°(圖1B)，可見兩個距離較遠(yuǎn)的鼻孔樣回聲(圖1C)，鼻骨可見，長約1.0cm，兩片鼻骨之間呈“八”字形張開(圖1D)，距離約1cm；眶間距比：3.90/1.74=2.2；左心室強(qiáng)回聲光點(diǎn)，約3mm。提示：孕周23+5周；胎兒鼻形態(tài)異常，眼間距增寬。孕婦妊娠期間無患病及用藥史。夫妻雙方表型均正常，非近親，無不良家族史。夫妻要求產(chǎn)前診斷，尋找病因，后于妊娠26周要求終止妊娠。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(HZKY-PJ-2020-48)。

1.2 方法

1.2.1 胎兒標(biāo)本取樣 夫妻簽署知情同意書后，進(jìn)行羊膜腔穿刺，采集羊水30mL。

1.2.2 染色體核型分析 20mL羊水分兩線常規(guī)培養(yǎng)，G顯帶，染色體核型分析。

1.2.3 基因組DNA制備 采用血液/組織基因組DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Mini kit,Qiagen,Germany)，提取夫妻外周靜脈血及羊水細(xì)胞的基因組DNA。

1.2.4 CNV-seq檢測及分析 根據(jù)專家共識[2]，對超聲檢查發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)異常的胎兒進(jìn)行染色體拷貝數(shù)變異分析，了解其微缺失/重復(fù)變異。取胎兒羊水細(xì)胞基因組DNA，按操作流程構(gòu)建文庫，質(zhì)控合格后于NextSeq CN500基因測序儀上機(jī)測序，測得數(shù)據(jù)使用專用軟件分析，判斷對應(yīng)染色體檢測區(qū)域的拷貝數(shù)(單倍體、二倍體、多倍體)或嵌合等。

1.2.5 WES檢測及數(shù)據(jù)分析 委托第三方檢測公司進(jìn)行，取胎兒基因組DNA，打斷法構(gòu)建文庫，定量后，與全外顯子組捕獲探針(Nano WES Human Exome V1.0，Berry genomics,Beijing,China)試劑進(jìn)行雜交、富集及純化，使用高通量測序儀器(Illumina Hiseq 2500)進(jìn)行雙向測序。對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行測序質(zhì)量評估，根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG)變異的分類與標(biāo)準(zhǔn)[3-4]，對測序結(jié)果的病理學(xué)意義進(jìn)行分析解讀。

1.2.6 Sanger測序突變驗(yàn)證 依據(jù)WES檢測分析結(jié)果，針對ARSE(NM_000047.2)基因11外顯子，采用Primer3軟件(Primer3webversion4.1.0，http://bioinfo.ut.ee/primer3/)設(shè)計(jì)引物，F(xiàn)5'-TGAAGATGCCATTCTCCAGC-3'，R5'-CCAGCTGGTTTGTTTCAATTTGA-3'。對胎兒及夫妻進(jìn)行該位點(diǎn)PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物回收純化后經(jīng)Genetic Analyzer 3500dx型測序儀(ABI，美國)毛細(xì)管電泳測序，與標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對。

1.2.7 引產(chǎn)胎兒觀察 胎兒眼距明顯增寬，面部扁平，面中部發(fā)育不良，整個鼻部似塌陷于面中部，幾乎沒有鼻部隆起，鼻翼寬，鼻頭扁(內(nèi)陷)，鼻孔未張開。脊柱、四肢及外生殖器(男性)等未見異常。

2 結(jié) 果

2.1 核型分析 胎兒羊水細(xì)胞染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)未見異常。

2.2 CNV-seq分析 胎兒檢測顯示seq[hg19]del(5)(p15.32p15.31)，提示5號染色體p15.32-p15.31(chr5:g 4660001_6960000)區(qū)域雜合缺失2.3Mb(臨床意義未明)。夫妻雙方CNV-seq驗(yàn)證，提示胎兒該變異來自父親。

2.3 WES檢測 胎兒WES數(shù)據(jù)分析顯示，ARSE基因NM_000047.2:c.1743G>A;p.(Trp581X)半合子變異。該變異導(dǎo)致第581位色氨酸(TGG)密碼子突變?yōu)榻K止密碼子，翻譯終止。人類基因突變數(shù)據(jù)庫(human gene mutation database,HGMD)有收錄[5]，為致病變異。分析胎兒5pp15.32-p15.31雜合缺失區(qū)域內(nèi)NSUN2基因的測序數(shù)據(jù)，未見該基因序列變異。

2.4 Sanger測序驗(yàn)證 胎兒ARSE基因c.1743G>A半合子變異，孕婦該位點(diǎn)為雜合變異，丈夫?yàn)橐吧?圖2)。

3 討 論

點(diǎn)狀軟骨發(fā)育不良(chondrodysplasia punctata，CDP)是較為罕見的骨骼發(fā)育異常綜合征，病因復(fù)雜，根據(jù)不同致病基因及遺傳方式，CDP分為多種類型。其中，X連鎖隱性遺傳的CDPX1，表現(xiàn)為嚴(yán)重的鼻頜發(fā)育不全、點(diǎn)狀軟骨發(fā)育不全、身材矮小和遠(yuǎn)端指骨縮短。致病基因ARSE位于X染色體短臂(Xp22.33)，靠近擬常染色體區(qū)域，其最后一個外顯子(外顯子11)是最大的一個外顯子，而且是編碼蛋白的關(guān)鍵區(qū)域。在CDPX1患者中，ARSE基因的變異類型[1]涉及單個或多個外顯子的缺失、整個基因的缺失、錯義突變、單個堿基的插入或缺失突變等，但不同類型變異的基因型與表型嚴(yán)重程度之間沒有明確相關(guān)性。

本研究中胎兒在妊娠中期超聲顯示面中部發(fā)育不良，上頜角增大，未見胎兒典型的飽滿的面部、鼻部的隆起及鼻孔回聲。羊水細(xì)胞核型分析未見染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)異常，CNV-seq檢測顯示胎兒5p15.32-p15.31區(qū)域2.3Mb雜合缺失(臨床意義不明)，該變異來自表型正常的父親。該區(qū)域包含NSUN2基因[OMIM:610916]的全部，該基因突變與常染色體隱性遺傳的智力發(fā)育遲緩5型(mental retardation-5,MRT5，[OMIM:611091])相關(guān)，主要表現(xiàn)為產(chǎn)后生長發(fā)育遲緩，中度至重度智力障礙，神經(jīng)運(yùn)動發(fā)育遲緩，特殊面容(鼻翼發(fā)育不全)，構(gòu)音障礙，反射亢進(jìn)等。雖然超聲影像顯示胎兒鼻發(fā)育異常表型與MRT5特殊面容相關(guān)，但后續(xù)的WES未檢測到NSUN2基因存在其他序列變異，經(jīng)查詢DGV、DECIPHER、UCSC公共數(shù)據(jù)庫資源，未見NSUN2基因缺失導(dǎo)致MRT5的病例報道。因而，根據(jù)MRT5的遺傳方式，認(rèn)為該微缺失變異與胎兒鼻發(fā)育異常無明顯相關(guān)，因而排除該雜合缺失的致病可能性。同時WES檢測發(fā)現(xiàn)胎兒ARSE基因的半合子變異，遺傳自母親，胎兒的表型與該基因變異導(dǎo)致的CDPX1相符，引產(chǎn)后胎兒面部及鼻部的發(fā)育異常較超聲觀察更為明確。本研究胎兒的c.1743G>A (p.Trp581X)變異，位于基因的最后一個外顯子，雖然靠近基因的末端，但仍位于編碼蛋白的關(guān)鍵功能區(qū)域內(nèi)。該變異最早于1998年報道[5]，在一個家系的多個患者存在該變異。另有研究[6]報道，16例患者中12例檢測到ARSE基因變異，4例為c.1743G>A，均明確了該變異的致病性。本研究中，母親拒絕為其健康的兒子進(jìn)行基因檢測，而且家系中沒有其他患者，未能在家系內(nèi)完成表型與基因型共分離的檢測，但通過胎兒的表型與基因型分析，結(jié)合該變異位點(diǎn)已有的相關(guān)致病性研究，綜合分析為胎兒明確診斷為CDPX1。

多數(shù)患有CDPX1的胎兒，在妊娠期通常缺少顯著的主要臟器結(jié)構(gòu)異常，產(chǎn)前診斷較難發(fā)現(xiàn)。有研究[7]報道，1例新生兒出生后發(fā)現(xiàn)鼻發(fā)育不良、呼吸困難、四肢短，X線檢查發(fā)現(xiàn)典型的點(diǎn)狀鈣化灶，基因檢測提示ARSE基因c.1219G>A半合子變異，診斷為CDPX1。有報道[8]對產(chǎn)前超聲發(fā)現(xiàn)長骨發(fā)育落后但未見面部及鼻骨發(fā)育異常的胎兒直接進(jìn)行WES檢測，發(fā)現(xiàn)ARSE基因的新錯義突變c.265A>G(p.Ser89Gly)，并通過多種功能實(shí)驗(yàn)(RT-qPCR、Western blot及ARSE酶學(xué)分析)證實(shí)該錯義突變的致病性，證實(shí)為CDPX1。本研究中胎兒僅表現(xiàn)為嚴(yán)重的面中部發(fā)育不良，鼻部塌陷，超聲未發(fā)現(xiàn)脊柱、長骨的異常鈣化影像，與這些報道病例的表型略有不同。由于家人要求盡快處理引產(chǎn)胎兒，未進(jìn)行X線檢測。該病例的影像學(xué)和分子遺傳學(xué)分析研究，為產(chǎn)前診斷工作中發(fā)現(xiàn)胎兒面部發(fā)育異常的病例積累了經(jīng)驗(yàn)。在胎兒超聲篩查中，觀察到胎兒眶間距增寬、面部平(鼻頜角增大)、鼻骨發(fā)育不良等異常時，建議關(guān)注主要臟器結(jié)構(gòu)的同時還應(yīng)注意觀察胎兒脊柱、四肢等骨骼鈣化及發(fā)育情況。在進(jìn)一步的產(chǎn)前遺傳檢測分析工作中，在常規(guī)核型分析及CNV-seq檢測的同時，還要考慮到相關(guān)的單基因病。

伴隨NGS技術(shù)的快速發(fā)展和應(yīng)用推廣，基因組或外顯子組測序在產(chǎn)前診斷中越來越體現(xiàn)出其技術(shù)優(yōu)勢，在產(chǎn)前超聲篩查發(fā)現(xiàn)異常但染色體分析未見異常而進(jìn)行的WES研究顯示，基因致病變異的整體檢出率為10%，而在存在超過2個以上的結(jié)構(gòu)異常的胎兒中，基因致病變異的檢出率達(dá)19%[9]。美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會(American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG)建議[10]，當(dāng)存在一個或多個顯著異常的胎兒無法使用常規(guī)產(chǎn)前方法獲得診斷時，可考慮WES，有利于及時判斷相應(yīng)的疾病和可能的預(yù)后，有助于臨床進(jìn)一步診斷和治療的選擇。