孕晚期孕婦血管內(nèi)皮鈣黏蛋白水平和IgG抗A/B抗體效價對ABO型胎兒新生兒溶血病的產(chǎn)前診斷價值*

姜丹丹，丁建娥，邵淑玲，丁金鈺，董秀梅，劉 鵬

(青島市黃島區(qū)人民醫(yī)院，青島 266400)

胎兒新生兒溶血病(haemolytic disease of the fetus and newborn，HDFN)一般指胎母血型不合引起的胎兒或新生兒同種免疫性溶血性疾病，臨床表現(xiàn)有胎兒水腫、早期流產(chǎn)或死胎，新生兒黃疸、貧血、肝脾腫大等，嚴重者可出現(xiàn)核黃疸，甚至死亡[1]。在我國以ABO血型不合HDFN(ABO-HDFN)發(fā)病率高，重癥者時有報道，因此有必要在產(chǎn)前規(guī)律監(jiān)測母體IgG抗A/B抗體水平，但目前臨床對新生兒溶血嚴重程度與孕婦血清抗體效價間的相關性存在意見差異[2]。已有研究通過測定血管內(nèi)皮微粒體(endothelial microparticles，EMPs)證實，ABO-HDFN患兒的血管內(nèi)皮受到損傷，且EMPs水平與疾病嚴重程度呈正相關[3]。由此，筆者思考患兒在宮內(nèi)發(fā)病時，能否通過胎盤等影響母體外周血中血管內(nèi)皮損傷標志物[如血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(vascular endothelial cadherin，VE-Cad)]的濃度。本研究通過檢測孕晚期母體外周血VE-Cad水平及IgG抗A/B抗體效價，對其與ABO-HDFN的發(fā)生發(fā)展進行相關性分析，以期為產(chǎn)前診斷和早期防治ABO-HDFN提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年4月至2021年2月在青島市黃島區(qū)人民醫(yī)院產(chǎn)檢的O型Rh(D)陽性孕婦80例，不規(guī)則抗體篩查均為陰性，且孕婦與丈夫血型不同。排除標準：(1)其他血型系統(tǒng)新生兒溶血及其他原因?qū)е碌男律鷥喝苎?地中海貧血癥、遺傳性球形紅細胞癥、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏等)；(2)合并感染：臨床診斷為感染(包括敗血癥、肺炎等)或CRP>10mg/L者；(3)新生兒缺氧：胎兒宮內(nèi)窘迫、圍產(chǎn)期窒息；(4)大的頭部血腫或嚴重挫傷；(5)母親吸煙或慢性高血壓、糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡或其他自身免疫性疾病；(6)母親生育過新生兒溶血病患兒等。孕婦年齡20～45(30.44±5.30)歲，A-O血型夫妻40例，B-O血型夫妻36例，AB-O血型夫妻3例。依據(jù)新生兒發(fā)生ABO-HDFN情況將孕婦分為ABO-HDFN組(n=42)與對照組(n=38)。本研究經(jīng)本院倫理委員會組織審核批準，所有受試者均取得孕婦和家屬同意，并自愿簽署知情同意書。

1.2 實驗分組依據(jù) 新生兒溶血三項試驗——直抗、游離、放散試驗均為陰性的孕母歸為對照組；放散試驗陽性，無論直抗、游離試驗結(jié)果如何，均認定為ABO新生兒溶血病，其孕母歸為ABO-HDFN組。

1.3 試劑與儀器 抗-A、抗-B、ABO反定紅細胞、抗-D試劑、β-巰基乙醇(上海血液生物醫(yī)藥提供，且在有效期內(nèi)使用)，人血管內(nèi)皮鈣黏蛋白ELISA試劑盒(江萊生物技術(shù))，低離子抗人球蛋白卡(微柱凝膠法)(瑞士達亞美)；DIANA免疫微柱孵育器(西班牙基立福)，振蕩恒溫金屬浴(MB-102，杭州博日科技)，醫(yī)用離心機(T-24，邁克醫(yī)療電子)，醫(yī)用離心機(BY-150C，北京白洋醫(yī)療器械)，全自動血型分析儀(IH1000，美國伯樂公司)，全自動生化分析儀(DA7600，日本日立)。

1.4 研究方法

1.4.1 血型血清學檢測及不規(guī)則抗體篩查 將孕婦及新生兒血標本3000r/min離心5min，使用微柱凝膠卡在IH1000全自動血型分析儀上完成，稀釋、加樣、孵育、離心、結(jié)果判讀均由儀器自動完成，操作方法嚴格按標準操作規(guī)程執(zhí)行。

1.4.2 溶血三項試驗 采集新生兒標本(外周靜脈血或臍帶血)，洗滌，進行溶血三項試驗：直接抗人球蛋白試驗、游離抗體試驗與抗體釋放試驗。直抗試驗以出現(xiàn)凝集為陽性，游離和放散試驗均以檢出可以和新生兒紅細胞反應的抗體為陽性，以放散試驗陽性為ABO-HDFN的確診標準。

1.4.3 IgG抗A/B抗體效價測定 取100μL孕婦血漿加等量β-巰基乙醇，混勻，置37℃溫育10min，用生理鹽水倍比稀釋，加與丈夫血型相同的ABO試劑紅細胞，37℃孵育30min，測定相應的IgG血型抗體效價。具體操作嚴格按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程(第3版)》[4]完成。

1.4.4 血管內(nèi)皮鈣黏蛋白檢測 采用EDTA抗凝標本離心所得孕婦血漿進行酶聯(lián)免疫吸附試驗，用酶標儀在450nm波長處測定OD值。所有操作均按試劑操作說明進行。

1.4.5 觀察指標 收集所有受試者的年齡、妊娠史、新生兒性別、血型、體重、總膽紅素(total bilirubin，TBIL)等一般資料。

2 結(jié) 果

2.1 孕婦和新生兒的臨床資料 ABO-HDFN組與對照組的孕婦年齡、分娩方式、新生兒性別比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 孕婦和新生兒臨床資料的比較[n(%)]

2.2 ABO-HDFN組與對照組孕婦VE-Cad水平比較 與對照組相比，ABO-HDFN組孕婦的VE-Cad水平升高，差異有統(tǒng)計學意義[0.65(0.21～1.62) vs 2.25(1.15～5.12)ng/mL，P<0.0001]。

2.3 孕婦抗體效價與其患兒例數(shù)的分布情況 ABO-HDFN組孕婦IgG抗-A/B效價≥1∶64者41例，占97.62%；對照組≥1∶64者17例，占44.74%，效價≤1∶32者21例，占55.26%(表2)。

表2 孕婦抗體效價與其患兒例數(shù)的分布情況

2.4 VE-Cad水平、IgG抗體效價與新生兒TBIL的相關性分析 孕婦VE-Cad水平與新生兒總膽紅素呈正相關(r=0.4264，P<0.05),但IgG抗體效價與新生兒總膽紅素無顯著相關性(r=0.0635，P=0.730)，見圖1。

2.5 VE-Cad水平、IgG抗體效價對ABO-HDFN的診斷價值 ROC曲線分析結(jié)果顯示，VE-Cad水平的曲線下面積(AUC)為0.762，診斷界值(cut-off)取1.008ng/mL，敏感度為80.95%，特異度為63.16%；IgG抗體效價的AUC為0.862，cut-off值為1：64，敏感度為88.10%，特異度為71.05%；兩者聯(lián)合診斷的AUC為0.915，敏感度為92.86%，特異度為84.21%。見圖2、表3。

表3 VE-Cad水平、IgG抗體效價及聯(lián)合因子的AUC

3 討 論

ABO-HDFN是指由于母嬰血型不合，母體內(nèi)存在著針對胎兒紅細胞抗原的IgG抗體，抗體通過胎盤與胎兒體內(nèi)的靶抗原結(jié)合所發(fā)生的一系列癥狀。研究表明，越早發(fā)現(xiàn)、早診斷，HDFN的治療效果越好[5]，但ABO-HDFN的產(chǎn)前診斷一直是挑戰(zhàn)產(chǎn)科醫(yī)生和輸血人員的一個難題。

患兒母親血清IgG抗-A/B效價對預測患兒罹患HDFN有較大的預判作用，臨床通常將孕婦血清抗體效價1∶64作為臨界值[6]，若效價≥1∶64時，表明嬰兒有發(fā)生ABO-HDFN的可能性。本研究42例ABO-HDFN組中抗體效價≥1∶64者41例(占97.62%)，符合相關文獻報道[7]，但也有1例效價為≤1∶32，表明臨床上不能忽視母親抗體效價低的高膽紅素血癥患兒；而對照組中抗體效價≥1∶64者高達44.74%，其中2例抗體效價≥1∶512并未發(fā)生HDFN，且IgG抗-A/B效價與新生兒TBIL未見明顯相關性(P>0.05)，這可能與抗體亞型、血型物質(zhì)含量、胎盤作用等因素有關[8]。

ABO血型抗原是組織血型抗原，廣泛存在于人體組織和器官中，并且強烈表達于內(nèi)皮細胞表面。研究報道[9]，CD144+微粒體可作為ABO-HDFN患兒發(fā)生血管內(nèi)皮損傷的標志物，并且患兒EMPs水平與血管功能障礙和疾病嚴重程度呈明顯相關性。可見，母體的抗A、抗B抗體不僅與患兒紅細胞表面相應抗原結(jié)合引起溶血，也可與內(nèi)皮細胞表面的靶抗原結(jié)合繼而引起血管內(nèi)皮的損傷[10]。VE-Cad是構(gòu)成血管內(nèi)皮細胞間黏附連接的主要結(jié)構(gòu)分子，通過與連接素和肌動蛋白細胞骨架蛋白相互作用來調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮屏障的穩(wěn)定性，是血管發(fā)育和通透性調(diào)節(jié)不可缺少的物質(zhì)[11]。前期研究發(fā)現(xiàn)，VE-Cad在ABO新生兒溶血病患兒中的水平升高[12]。本研究對孕晚期孕婦的VE-Cad水平進行檢測分析，發(fā)現(xiàn)ABO-HDFN組孕婦的VE-Cad升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.0001)，且孕婦VE-Cad水平與新生兒總膽紅素水平呈顯著正相關(r=0.4264，P<0.05)。由此推測孕晚期孕婦的VE-Cad水平可作為產(chǎn)前檢測ABO-HDFN的指標。

本研究對孕婦VE-Cad水平、IgG抗體效價的診斷效能進行評價：VE-Cad水平對ABO-HDFN診斷的AUC為0.762，敏感度和特異度分別為80.95%和63.16%；IgG抗體效價的AUC為0.862，敏感度和特異度分別為88.10%和71.05%；兩者聯(lián)合診斷的AUC為0.915，敏感度為92.86%，特異度為84.21%。表明聯(lián)合測定VE-Cad水平和IgG抗體效價，可提高ABO-HDFN產(chǎn)前診斷的敏感度，對ABO-HDFN的早期診斷具有重要意義。

在國內(nèi)ABO血型不合所致的HDFN發(fā)生率較高[13]。專家推薦[14],備孕女性懷孕前或妊娠8～12周建檔時進行ABO血型鑒定和IgG血型抗體，若IgG抗-A/B效價<1∶64，妊娠28周后復查，若效價沒有變化可正常分娩；若IgG抗-A/B效價≥1∶64或效價升高≥2個稀釋度(如首次效價為4，現(xiàn)上升至16)，推薦增加檢測頻次：1次/2周(妊娠28周至分娩)，并可檢測VE-Cad水平以提高ABO-HDFN產(chǎn)前診斷率。

綜上所述，孕晚期ABO-HDFN組孕婦的VE-Cad水平和IgG抗體效價均升高，聯(lián)合檢測VE-Cad水平和IgG抗-A/B抗體效價可提高診斷敏感度，且易于臨床應用和操作，對于產(chǎn)前診斷ABO-HDFN具有重要作用。