KLF15和GSTM5在宮頸癌中的表達(dá)及其作用機(jī)制*

李 君，李 潔，李 鷗,，張瑾瑾，蔣麗利，石琳然，馬 冬

(1.唐山中心醫(yī)院婦科，唐山 063000；2.唐山市工人醫(yī)院婦產(chǎn)科，唐山 063000；3.華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，唐山 063210;4.教育部神經(jīng)與血管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，石家莊 050017)

宮頸癌(carcinoma of the cervix,CC)是女性常見(jiàn)惡性腫瘤，中晚期預(yù)后較差，發(fā)病機(jī)制及有效治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)仍然十分重要[1]。Krüppel樣因子(KLFs)家族是一類DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活或抑制基因表達(dá)發(fā)揮細(xì)胞增殖、分化、炎癥和凋亡等功能[2]。與CC相關(guān)研究較多的亞型是KLF4、KLF5和KLF6[3]，如KLF4在CC的發(fā)生發(fā)展中起抑癌功能[4-5]。同課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，KLF5表達(dá)升高促進(jìn)CC的發(fā)生、發(fā)展[6]。近年來(lái)KLF15在腫瘤研究中備受關(guān)注，如甲狀腺腫瘤[7]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[8]、肉瘤[9]、肺癌[10]、卵巢癌[11]等。谷胱甘肽代謝作為重要的氧化還原過(guò)程參與氧化損傷修復(fù)和腫瘤的發(fā)生發(fā)展。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase,GST)是抗氧化反應(yīng)和促進(jìn)藥物代謝的關(guān)鍵酶，包括5個(gè)亞型GSTM1-5，通過(guò)與GSH結(jié)合發(fā)揮解毒作用(包括致癌物、治療藥物、環(huán)境毒素和氧化應(yīng)激產(chǎn)物)。最新研究發(fā)現(xiàn)，KLF15調(diào)節(jié)脂質(zhì)和全身代謝穩(wěn)態(tài)[12]，且GSTM5作為腫瘤抑制基因在膀胱癌中表達(dá)降低[13]。目前仍無(wú)KLF15和GSTM5表達(dá)在CC中的相關(guān)研究報(bào)道。因此，推測(cè)轉(zhuǎn)錄因子KLF15調(diào)控GSTM5表達(dá)影響細(xì)胞谷胱甘肽代謝可能與CC相關(guān)。通過(guò)檢測(cè)不同病理宮頸組織中KLF15和GSTM5基因的表達(dá)以及谷胱甘肽的含量，生信分析KLF15、GSTM5基因等表達(dá)與CC的預(yù)后關(guān)系，染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)KLF15與GSTM5的調(diào)控關(guān)系，為發(fā)現(xiàn)新的宮頸癌分子治療靶點(diǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源 2015年9月至2018年9月唐山市工人醫(yī)院收集CC組織標(biāo)本40例，患者平均年齡(50.77±3.09)歲。選取門診刮宮或住院手術(shù)治療的子宮上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasias，CIN)患者40例，其中CINI 14例，CIN II/III型26例，患者年齡(50.8±3.22)歲。選取同期因良性子宮疾病行子宮全切除術(shù)患者的45例宮頸組織為對(duì)照組(Control)，平均年齡(50.55±3.01)歲。3組患者的平均年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.585)。標(biāo)本采集后均經(jīng)病理專家閱片而確定，主要分成兩份，一份于中心實(shí)驗(yàn)室-80℃冰箱留存，另外一份經(jīng)中性福爾馬林固定、石蠟包埋用于免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)。標(biāo)本取材患者知情同意，唐山市工人醫(yī)院倫理委員會(huì)已準(zhǔn)許本研究。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA和總RNA提取 采用基因組DNA抽提試劑盒提取宮頸組織DNA，Trizol法提取總RNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA和總RNA完整性。

1.2.2 免疫熒光染色檢測(cè)宮頸組織中KLF15表達(dá) 采用免疫組化試劑盒SP法分析。4%多聚甲醛固定宮頸組織標(biāo)本，組織蠟塊4μm連續(xù)切片，脫蠟、浸水、高壓抗原修復(fù)，山羊血清封閉，一抗4℃孵育過(guò)夜，暗室室溫孵育熒光標(biāo)記二抗，DAPI胞核染色。Image-Pro Plus 6.0軟件(美國(guó)MEDIA CYBERNETIC)分析紅色熒光在整個(gè)視野內(nèi)所占百分比。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)KLF15和GSTM5 mRNA表達(dá) Trizol法提取宮頸組織中總RNA，試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)檢測(cè)。PCR反應(yīng)條件：95℃ 2min，95℃變性20s，60℃退火20s，72℃延伸45s，共36個(gè)循環(huán)。所有反應(yīng)重復(fù)3次，用公式2-△△Ct循環(huán)閾值法將NRG1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平歸一化為內(nèi)參GADPH相對(duì)表達(dá)水平。qRT-PCR引物序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.4 谷胱甘肽含量測(cè)定 按還原型谷胱甘肽(GSH)含量檢測(cè)試劑盒(上海滬崢)操作。液氮研磨宮頸組織至粉末，每50mg宮頸組織加M溶液500μL含10μL蛋白酶抑制劑進(jìn)行渦旋，冰上操作。勻漿液在4℃冰箱中放置10min，4℃條件下10000r/min離心10min，取上清用于測(cè)量總GSH含量。

1.2.5 生信分析DPEP1、GSTM5和GSTM3基因表達(dá)與CC生存分析 利用在線GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得KLF15、DPEP1、GSTM5和GSTM3三種基因mRNA表達(dá)在CC中的5年總生存曲線。根據(jù)GSTM5檢測(cè)結(jié)果，對(duì)40例CC患者隨訪并進(jìn)行總生存率分析。

1.2.6 染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(ChIP)[14]依據(jù)Genbank中基因序列(Gene ID:2949)，設(shè)計(jì)PCR引物并擴(kuò)增GSTM5啟動(dòng)子包含3個(gè)位點(diǎn)(site1-3)的不同序列，ChIP方法參考試劑盒說(shuō)明書(Upstate公司)。50mg宮頸組織眼科剪剪碎，加1%甲醛室溫固定，4℃超聲波破碎并純水稀釋，取20μL稀釋液作為對(duì)照。其余稀釋液加蛋白A瓊脂糖磁珠進(jìn)行沉淀，分為加抗KLF15抗體和加非特異性IgG抗體2組，洗脫沉淀物后用PCR純化試劑盒純化DNA片段，進(jìn)行PCR檢測(cè)。引物序列：Site 1(-280bp)：F-5'-TTGTGAGTCTGAAGAAAC-3'，R-5'-TGCATTCATCTAAAGACATA-3'；Site 2(-1230bp)：F-5'-CTCAAGCGCACAGCCAAGTC-3'，R-5'-TCCGGGAGCGAGGTCAGGGC-3'；Site 3(-1400bp)：F-5'-CCTGACCTCGCTCCCGGAAC-3'，R-5'-GGTGCTGGTTGGTGCGGATT-3'。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)錄因子KLF5在宮頸鱗癌組織中表達(dá)降低 對(duì)照組(Control)及宮頸癌(CC)組患者的年齡、初潮年齡、月經(jīng)周期、經(jīng)期、流產(chǎn)次數(shù)、吸煙以及飲酒各方面比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。通過(guò)對(duì)3例Control和3例CC組織進(jìn)行RNA-測(cè)序分析，聚類分析差異表達(dá)的mRNAs。與control組比較，KLF15表達(dá)在CC組織中顯著減少(圖1)；qRT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證KLF15表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

2.2 不同病理程度宮頸鱗癌組織中KLF15蛋白表達(dá) 與control組比較，KLF15蛋白陽(yáng)性染色在CC組織中減少；并且隨著宮頸病變進(jìn)程的加劇，KLF15陽(yáng)性染色程度逐步下降(P<0.05)(圖3、4)。表明轉(zhuǎn)錄因子KLF15表達(dá)下降參與宮頸癌的病理進(jìn)程。

2.3 正常宮頸組織與宮頸鱗癌組織的RNA測(cè)序結(jié)果分析 基因本論(GO)分析發(fā)現(xiàn)，基因富集主要集中于細(xì)胞代謝過(guò)程(占28%，圖5A)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，蛋白多肽代謝過(guò)程種類較多，其中谷胱甘肽代謝過(guò)程最顯著，見(jiàn)圖5B，提示該代謝通路可能參與宮頸癌的發(fā)病進(jìn)程。

2.4 不同病理程度宮頸組織中總GSH含量 在宮頸癌變過(guò)程中GSH含量逐漸減少，且不同組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[Control組：(108.2±24.5)nmol/mg，CIN I組：(93.6±17.9)nmol/mg，CINII～I(xiàn)II組：(71.7±18.6)nmol/mg，CC組：(63.4±19.2)nmol/mg，P<0.05]。

2.5 GSTM5表達(dá)降低與宮頸癌相關(guān) 依據(jù)宮頸癌組織的RNA-seq篩查結(jié)果，采用差異表達(dá)基因的聚類法分析谷胱甘肽代謝過(guò)程中的相關(guān)基因，結(jié)果顯示DPEP1、GSTT1、GSTM5和GSTM3 mRNA表達(dá)降低顯著，而GSTP1表達(dá)升高，見(jiàn)圖6A。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果示，宮頸組織中GSTM5表達(dá)下降(圖6B)。利用GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)上述基因和KLF15表達(dá)在CC中進(jìn)行5年生存曲線分析，結(jié)果顯示GSTM5與CC患者的5年總生存率相關(guān)，低表達(dá)GSTM5的CC患者表現(xiàn)出更低的總生存率(圖6C)。本實(shí)驗(yàn)中40例CC患者預(yù)后總生存率統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，GSTM5低表達(dá)與宮頸癌患者預(yù)后生存率相關(guān)性沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但仍有一定趨勢(shì)(圖7)。表明GSTM5表達(dá)影響CC的預(yù)后生存率，在宮頸癌進(jìn)展中具有重要作用。

2.6 KLF15調(diào)控GSH相關(guān)基因GSTM5的轉(zhuǎn)錄表達(dá) 為了探究參與宮頸癌變過(guò)程中GSH代謝紊亂的GSTM5表達(dá)降低是否與轉(zhuǎn)錄因子KLF15表達(dá)下調(diào)相關(guān)，采用GTRD(Gene Transcription Regulation Database)網(wǎng)站分析轉(zhuǎn)錄因子KLF15在GSTM5基因啟動(dòng)子上的可能結(jié)合位點(diǎn)情況。結(jié)果表明GSTM5基因啟動(dòng)子存在3個(gè)重要的KLF15結(jié)合位點(diǎn)，并依據(jù)這些位點(diǎn)設(shè)計(jì)3對(duì)PCR引物進(jìn)行免疫染色質(zhì)沉淀(ChIP)檢測(cè)(圖8)?？筀LF15抗體能夠從正常宮頸組織中成功地免疫沉淀GSTM5基因啟動(dòng)子DNA片段(-280位點(diǎn))，其他位點(diǎn)未檢測(cè)出特異性片段；而在宮頸癌組織中均未檢出。采用非特異性IgG抗體在兩組中同樣均未檢測(cè)出信號(hào)。綜上所述，GSTM5表達(dá)降低可能與KLF15表達(dá)抑制相關(guān)，進(jìn)而影響谷胱甘肽代謝過(guò)程并促進(jìn)宮頸腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

3 討 論

盡管癌前篩查及手術(shù)治療在SCC早期階段得到了廣泛應(yīng)用，但SCC的局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移亦嚴(yán)重影響了治療效果及預(yù)后，闡明其發(fā)病分子機(jī)制，尋求有效的治療分子靶點(diǎn)，對(duì)于提高其治愈率，降低死亡率具有重要的意義。本研究結(jié)果表明，與正常組比較，CC組中轉(zhuǎn)錄因子KLF15表達(dá)降低，生信分析和宮頸組織中GSH檢測(cè)結(jié)果證實(shí)GSH代謝異常降低，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)KLF15靶向調(diào)控GSTM5的轉(zhuǎn)錄表達(dá)參與GSH代謝，這些結(jié)果為宮頸癌的診治提供新的分子靶點(diǎn)參考。

KLFs家族通過(guò)與富含GC序列元件的基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合激活或抑制基因轉(zhuǎn)錄機(jī)制參與細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡和代謝等細(xì)胞過(guò)程。其主要家族成員KLF4、KLF5、KLF9、KLF11與子宮內(nèi)膜癌相關(guān)[15-16]，KLF6對(duì)卵巢癌細(xì)胞有抑制作用[17]。KLF15作為基因轉(zhuǎn)錄的激活子或抑制子、促進(jìn)或抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、致癌基因或抑癌基因從而發(fā)揮不同作用主要依賴于細(xì)胞和遺傳背景的不同[18]。大量研究表明，KLF15能參與心臟脂質(zhì)代謝,影響乳腺癌、人肺腺癌等癌癥形成[19-22]。本研究對(duì)正常和CC組織進(jìn)行RNA測(cè)序，并通過(guò)免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)證實(shí)KLF15含量降低(P<0.01)，且與control組比較，從CINI至CC過(guò)程中，KLF15的染色程度逐漸降低。提示KLF15表達(dá)下調(diào)可能參與了CC癌變過(guò)程，是腫瘤增殖的負(fù)向調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子。

GSH作為細(xì)胞內(nèi)重要的調(diào)節(jié)代謝物質(zhì)，激活多種酶并參與三羧酸循環(huán)和糖代謝等過(guò)程，從而促進(jìn)脂肪、蛋白質(zhì)和糖類的代謝。GSH分子通過(guò)活性巰基(-SH)基團(tuán)保護(hù)體內(nèi)蛋白中巰基不被氧化、滅活，進(jìn)而活化氧化還原系統(tǒng)、激活酶類、發(fā)揮解毒作用、維持胞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和能量代謝等作用[23]。盡管較高的GSH水平與腫瘤的耐藥性和侵襲性相關(guān)[24]，但是新近報(bào)道顯示，GSH代謝的增加能抑制小鼠肝細(xì)胞癌的發(fā)生[25]。本研究通過(guò)RNA測(cè)序等一系列實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在宮頸病變過(guò)程中，KLF15和GSH含量均減少，推測(cè)兩者之間可能存在直接或間接的關(guān)系，這為研究GSH代謝與CC的發(fā)生發(fā)展是否存在直接或間接的聯(lián)系提供新思路。

很多轉(zhuǎn)移酶參與了GSH代謝過(guò)程，如GSTM亞型、GSTT亞型等。本研究通過(guò)對(duì)GSH代謝過(guò)程相關(guān)差異基因的聚類分層分析發(fā)現(xiàn)，CC組織中GSTM5的mRNA表達(dá)含量下降最為明顯，說(shuō)明在宮頸癌變過(guò)程中谷胱甘肽代謝減少與GSTM5表達(dá)可能相關(guān)。據(jù)此，通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)DPEP1、GSTM5和GSTM3的mRNA表達(dá)在SCC中的5年生存率分析發(fā)現(xiàn)，GSTM5低表達(dá)時(shí)CC的總生存率低(P<0.05)。盡管在本實(shí)驗(yàn)40例宮頸癌患者預(yù)后總生存率統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，GSTM5低表達(dá)與宮頸癌患者更低的預(yù)后生存率相關(guān)性沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是仍有一定趨勢(shì)呈現(xiàn)正相關(guān)，提示更大樣本量隨訪驗(yàn)證是必要的。進(jìn)一步通過(guò)JASPAR數(shù)據(jù)庫(kù)和ChIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證在正常宮頸組織中KLF15與GSTM5基因啟動(dòng)子結(jié)合，而在CC組織中消失，提示KLF15可能參與對(duì)GSTM5基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，通過(guò)調(diào)節(jié)谷胱甘肽代謝阻止宮頸腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。本研究通過(guò)部分實(shí)驗(yàn)和生物信息學(xué)預(yù)測(cè)證實(shí)了這個(gè)理論假設(shè)，但是本研究的限制是沒(méi)有通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證GSTM5啟動(dòng)子和KLF15的結(jié)合位點(diǎn)及其對(duì)下游GSH代謝的影響，也未采用動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)KLF15及其下游靶基因GSTM5與宮頸癌的關(guān)系，因此這也提出了我們課題組下一步研究工作的方向。

綜上所述，在宮頸組織癌變過(guò)程中KLF15表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致GSTM5的表達(dá)減少，從而引起谷胱甘肽代謝障礙，促進(jìn)宮頸上皮細(xì)胞的失穩(wěn)態(tài)和惡性增殖，并最終導(dǎo)致SCC的發(fā)生、發(fā)展。