pH對(duì)乳糖-乳鐵蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)及理化特性的影響

黃利華，陳帥，張業(yè)輝*，張友勝，江如藍(lán)，鐘偉銳，焦文娟，趙甜甜

（1.廣州城市職業(yè)學(xué)院食品科學(xué)與美食養(yǎng)生學(xué)院，廣東廣州 510405）（2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510610） （3.加州大學(xué)戴維斯分校營(yíng)養(yǎng)系，美國(guó)加州 95616）（4.汕尾市五豐海洋生物技術(shù)有限公司，廣東汕尾 516626）

乳鐵蛋白（Lactoferrin，LF）是一種與鐵結(jié)合的轉(zhuǎn)運(yùn)糖蛋白，在人的機(jī)體中參與鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)，并具有抗氧化、抗菌、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等功能活性，是哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)中的重要成分。食品中的乳鐵蛋白是一種從牛初乳中提取的鐵結(jié)合性糖蛋白[1]，其分子量約為80 ku，由約689個(gè)氨基酸組成LF的一級(jí)結(jié)構(gòu)。乳鐵蛋白的等電點(diǎn)在8.4～9.0之間，高于大多數(shù)食品蛋白質(zhì)[2,3]。LF的三級(jí)結(jié)構(gòu)由兩個(gè)對(duì)稱(chēng)的子葉（N葉和C葉）組成，即乳鐵蛋白多肽鏈的N末端和C末端，由一個(gè)短α-螺旋連接[4]。LF包含兩個(gè)熱變性溫度峰（61和93 ℃），分別對(duì)應(yīng)于N-和C-葉上的展開(kāi)[5]。乳鐵蛋白具有廣泛的生理活性，例如抗菌活性、抗氧化活性、抗炎活性、免疫調(diào)節(jié)特性、抗癌等[6-8]，表明它在增強(qiáng)免疫力與抗癌方面可能具有較好的應(yīng)用價(jià)值。此外，LF是一種生物降解性好、生物相容性高、無(wú)毒性的天然化合物，在嬰幼兒食品、化妝品和醫(yī)藥產(chǎn)品中同樣具有廣泛的應(yīng)用[9]?！秶?guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB14880-2012》允許在嬰兒配方奶粉中添加乳鐵蛋白，其添加量≤1.0 g/kg。

蛋白質(zhì)的熱敏性是限制LF應(yīng)用的原因之一，蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)加熱處理后暴露了疏水性基團(tuán)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集，聚集體之間不斷發(fā)生相互作用，最終導(dǎo)致沉淀的形成[10]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道蛋白質(zhì)與多糖結(jié)合形成共價(jià)或非共價(jià)復(fù)合物，能提高LF在加工過(guò)程中的熱穩(wěn)定性。已有研究表明，多糖的加入可以抑制蛋白質(zhì)的熱變形，提高蛋白質(zhì)多糖復(fù)合物的熱穩(wěn)定[11-13]。此外，在不同的pH條件下，蛋白質(zhì)多糖復(fù)合物還可以形成大小可控的粒子，這有利于研究蛋白質(zhì)多糖復(fù)合物作為食品或藥物的載體[14]。因此，本文主要研究了不同pH誘導(dǎo)LF-乳糖復(fù)合物的形成過(guò)程、微觀結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)的變化規(guī)律，研究結(jié)果為提高乳鐵蛋白在食品中的應(yīng)用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳鐵蛋白（純度≥91%），湖北威德利化學(xué)科技有限公司；乳糖，天津市福晨化學(xué)試劑廠；碧云天試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；甲醇，天津市百世化工有限公司；冰乙酸，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；β-巰基乙醇，天津市大茂化學(xué)試劑廠；考馬斯亮藍(lán)，上海源葉生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉（SDS），天津市福晨化學(xué)試劑有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800型紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；電泳儀，美國(guó)Thermo Fisher公司；ST85B3-1型真空冷凍干燥機(jī)，美國(guó)Milirock公司；JascoJ-815型圓二色譜儀，日本分光公司；VERTEX33型傅里葉變換紅外光譜儀，德國(guó)Bruker公司；SZ-100納米顆粒分析儀，美國(guó)Malvern Instruments公司；S-3400N型掃描電子顯微鏡，日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 LF-乳糖糖復(fù)合物的制備

LF和乳糖分別溶解在蒸餾水中，加入0.02%（m/V）疊氮化鈉，以防止細(xì)菌生長(zhǎng)，室溫（22 ℃）攪拌2 h，制備固定濃度為1%（m/V）的原溶液。把制備好的溶液用保鮮膜封口，在冰箱（4 ℃）中保存過(guò)夜，以確保完全水合。

1.3.2 濁度測(cè)定

濁度的測(cè)量采用Li等[15]的方法。使用UV-1800型紫外分光光度計(jì)在600 nm處測(cè)定不同pH條件下LF-乳糖溶液的濁度。以去離子水為空白對(duì)照，對(duì)濁度值進(jìn)行校正。搖勻后測(cè)定，每個(gè)樣品一式三份。

1.3.3 粒徑測(cè)定

使用美國(guó)Malvern Instruments公司的SZ-100納米顆粒分析儀測(cè)定樣品的粒徑大小及分布。數(shù)據(jù)報(bào)告為平均直徑或體積直徑。

1.3.4 掃描電子顯微鏡（SEM）

將凍干的LF-乳糖復(fù)合物粉末用雙面膠帶固定在圓形鋁樁上，用離子濺射儀鍍金后，在15 kV加速電壓下用掃描電子顯微鏡（日本Olympus公司的S-3400N）進(jìn)行檢查和拍照。

《雷雨》是曹禺先生在“沒(méi)有太陽(yáng)的日子里的產(chǎn)物”，無(wú)論是哪一個(gè)女性形象，都是以悲劇結(jié)局收尾。這場(chǎng)命中注定的雷雨，這場(chǎng)無(wú)法回避的悲劇，將人世間一切的丑惡揭露開(kāi)來(lái)，無(wú)論什么人都無(wú)法逃脫命運(yùn)的囹圄。好一場(chǎng)雷雨，于黑暗中訴說(shuō)了一個(gè)家庭的悲劇，展示了人性的扭曲，揭露了殘酷的現(xiàn)實(shí)！它是一場(chǎng)暴風(fēng)雨，是一場(chǎng)文字的雷雨，字字血淚，擲地有聲！四鳳死了，繁漪瘋了，侍萍生不如死。一場(chǎng)雷雨，花謝知多少？花非花，似花，非花無(wú)花，夢(mèng)中淚花，一場(chǎng)雷雨，夢(mèng)碎一場(chǎng)空；夢(mèng)非夢(mèng)，似夢(mèng)非夢(mèng)，無(wú)夢(mèng)，夢(mèng)碎一場(chǎng)空！三十年，走完一場(chǎng)悲哀。

1.3.5 傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）

將冷凍干燥后的LF-乳糖復(fù)合物與溴化鉀（KBr）按1:100的比例進(jìn)行混合壓片后，在400～4000 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，分辨率為4 cm-1，掃描32次。

1.3.6 圓二色譜測(cè)定

分別移取300 μL不同pH條件下的LF-乳糖復(fù)合物溶液于光程為1 mm的比色皿中，在波長(zhǎng)為190～260 nm，持續(xù)通入氮?dú)獾臈l件下，進(jìn)行樣品的圓二圖譜掃描，重復(fù)兩遍實(shí)驗(yàn)。

1.3.7 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）

參考Laemmli[16]的方法，根據(jù)電泳試劑盒說(shuō)明書(shū)，選用4%濃縮膠和10%分離膠進(jìn)行配膠。取0.5 mL樣品溶液與等體積上樣緩沖溶液進(jìn)行混合，煮沸5 min，于冰水混合物中冷卻并恢復(fù)至室溫后上樣，每孔上樣量10 μL。采用恒壓模式，濃縮膠時(shí)電壓為25 V，分離膠電壓為80 V，凝膠用染色液（含0.02%考馬斯亮藍(lán)，45%甲醇和10%冰乙酸）染色2～4 h，隨后用脫色液（含45%甲醇和10%冰乙酸）脫色至條帶清晰可見(jiàn)并進(jìn)行拍照。

還原SDS-PAGE中上樣緩沖液中加入10%β-巰基乙醇，其他同上。

1.4 數(shù)據(jù)分析

測(cè)定和分析結(jié)果采用Origin 8.0、CDNN和Prodata軟件處理數(shù)據(jù)，SPSS V20.0軟件進(jìn)行單因素差異性及相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同pH條件下LF-乳糖復(fù)合物的濁度變化

如圖1a所示，所有溶液在熱處理前都是透明的。相比之下，加熱后B1和B2組仍然澄清，B3/B4/B5出現(xiàn)渾濁。此外，在B3/B4/B5玻璃瓶可以觀察到大的聚集體，而且聚集體隨著pH的增大也逐漸增多，這顯然是熱處理后LF分子的變性和聚集所致[17,18]。

熱處理前后不同pH值條件下樣品的濁度變化如圖1b所示。加熱前，pH值對(duì)LF-乳糖復(fù)合物的濁度基本沒(méi)有影響，復(fù)合物溶液在的吸光值大約在0.05左右，溶液呈澄清透明狀態(tài)。加熱后，隨著混合溶液中pH值的增加，LF-乳糖復(fù)合物的濁度逐漸變大。特別是在pH值6時(shí)，復(fù)合物溶液的濁度開(kāi)始急劇增加（吸光值約pH為2時(shí)的30倍），直到pH值為10，吸光值增加到2.4左右。從圖中可以看出，高pH值條件下，熱處理后LF-乳糖復(fù)合物的變性和聚集更易發(fā)生，這可能與LF分子在堿性環(huán)境中對(duì)熱不穩(wěn)定的原因有關(guān)[19]。

2.2 不同pH條件對(duì)LF-乳糖復(fù)合物粒徑的影響

在不同pH條件下熱處理后LF-乳糖復(fù)合物的平均粒徑如圖2a所示，從圖中可以明顯的得出，環(huán)境中pH對(duì)LF-乳糖復(fù)合物顆粒的形成具有促進(jìn)作用。隨著混合溶液中pH的增加，LF-乳糖復(fù)合物顆粒呈顯著增大的趨勢(shì)，在pH=10時(shí)，LF-乳糖復(fù)合物顆粒粒徑達(dá)到最大值465 nm。在強(qiáng)酸性環(huán)境中（pH=2和pH=4），LF和乳糖分子呈共溶狀態(tài)，顆粒平均直徑基本維持在10 nm左右。在弱酸和堿性環(huán)境中（pH=6、pH=8和pH=10），LF-乳糖復(fù)合物的粒徑形成，并逐漸變大（224增加到467 nm），這可能與LF在弱酸和堿性環(huán)境中不穩(wěn)定相關(guān)[20,21]。當(dāng)復(fù)合物中靜電相互作用較弱且凈電荷相對(duì)較高時(shí)，可溶復(fù)合物就會(huì)形成。相反，當(dāng)靜電相互作用較強(qiáng)且凈電荷較低時(shí)，就會(huì)形成共聚物[22]。熱處理導(dǎo)致LF-乳糖復(fù)合物聚集體的形成，弱酸和堿性環(huán)境降低了LF本身的正電荷，從而引起了LF-乳糖復(fù)合物聚集體間的靜電斥力降低，聚集體之間不斷相互作用，最終到導(dǎo)致沉淀的生成。從圖1a中瓶底部的沉淀也可以說(shuō)明，pH值越大LF-乳糖溶液中沉淀越多。

為了更好地說(shuō)明不同pH值對(duì)LF-乳糖復(fù)合物顆粒形成的影響，我們測(cè)定了樣品的尺寸分布，如圖2b所示。在pH=2和pH=4，溶液的粒徑基本一致，分布很窄；隨后隨著pH值的增加粒徑分布的峰值明顯向大尺寸方向移動(dòng)，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)更寬的尺寸分布，這也表明LF-乳糖復(fù)合物的形成。

2.3 不同pH條件下LF-乳糖復(fù)合物的微觀結(jié)構(gòu)

采用掃描電鏡表征不同形態(tài)的LF-乳糖復(fù)合物微觀結(jié)構(gòu)。圖3顯示，LF、乳糖均呈球狀或橢圓狀，LF分子相對(duì)較大。圖3b和3c中，LF和乳糖分子呈無(wú)規(guī)則狀態(tài)，這是由于在強(qiáng)酸環(huán)境中LF和乳糖分子均被質(zhì)子化，靜電斥力阻礙了LF與乳糖的結(jié)合，它們處于共溶狀態(tài)[23]。在宏觀圖1a中，也可以明顯在的看到LF-乳糖呈透明狀態(tài)。圖3d和3e中，可以明顯看到LF和乳糖結(jié)合在一起，NaCl附著在其表面形成鹽橋促進(jìn)LF-乳糖復(fù)合物的形成。并且隨著pH值的變大，LF-乳糖復(fù)合物之間進(jìn)一步發(fā)生相互作用，形成更大的聚集體。但是在粒徑結(jié)果中，在pH=6和pH=8時(shí)，LF-乳糖復(fù)合物的粒徑變化不大，說(shuō)明測(cè)聚集體之間主要靠鹽鍵連接，聚集體在水溶液中部分溶解。在圖3f中（pH=10），觀察到長(zhǎng)條狀聚合物，由于LF分子在堿性條件中不穩(wěn)定，加熱處理后，LF分子完全變性，導(dǎo)致蛋白分子間聚集，生成沉淀。圖2a和圖1a中復(fù)合溶液的粒徑的突然增大以及玻璃瓶底部有大量沉淀的生成也可以說(shuō)明了這點(diǎn)。除此之外，有關(guān)報(bào)道指出，LF在90 ℃ 10 min條件下就完全變性，喪失其原有的空間結(jié)構(gòu)[4]，但在LF-乳糖復(fù)合物中發(fā)現(xiàn)LF的原有的球形結(jié)構(gòu)（pH=6和pH=8），因此可以推測(cè)，乳糖的加入一定程度上抑制了LF的熱變性。

2.4 不同pH條件下LF-乳糖復(fù)合物的紅外光譜分析

乳鐵蛋白、乳糖及不同pH條件下LF-乳糖復(fù)合物的紅外光譜圖如圖4所示。LF和乳糖在酰胺A帶（3000～3700 cm-1）內(nèi)有個(gè)很寬的峰，這是由于-OH的伸縮振動(dòng)引起的。LF在酰胺一帶（1600～1700 cm-1）和酰胺二帶（1500～1600 cm-1）均有峰值，這是LF分子中的肽鍵產(chǎn)生的，其中酰胺一帶（1652.77）主要由C=O伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的，酰胺二帶（1542.51）是由N-H的彎曲振動(dòng)和C-N伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的[24]。乳糖在酰胺一帶有峰值（1654.97），這是乳糖中C=O伸縮振動(dòng)引起的，在890 cm-1吸收峰是乳糖中β-糖苷鍵的特征峰[25]。在所有復(fù)合物樣品中都存在酰胺帶（酰胺一帶和酰胺二帶）和890 cm-1處β-糖苷鍵的特征峰，這說(shuō)明LF與乳糖發(fā)生了相互作用形成了LF-乳糖復(fù)合物。

如表1所示，總的來(lái)說(shuō)，當(dāng)混合溶液的pH值為酸性時(shí)，LF-乳糖復(fù)合物的酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶略有藍(lán)移現(xiàn)象，酰胺A帶由3410.33 cm-1藍(lán)移至3396.36 cm-1。當(dāng)混合溶液的pH值為堿性時(shí)，LF-乳糖復(fù)合物的酰胺Ⅰ帶和酰胺二帶略有藍(lán)移現(xiàn)象，而酰胺A帶由3410.33 cm-1紅移至3421.32 cm-1，這表明混合溶液的酸堿性影響了LF-乳糖復(fù)合物的-OH。可能是由于混合溶液中環(huán)境的酸堿性改變了-OH伸縮振動(dòng)的大小，從而導(dǎo)致酰胺A帶的藍(lán)移或紅移現(xiàn)象。

表1 不同pH下LF-乳糖復(fù)合物對(duì)應(yīng)的光譜帶分析Table 1 Spectral band analysis of LF-lactose complex at different pH values

2.5 不同pH條件對(duì)LF-乳糖復(fù)合物二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

LF-乳糖復(fù)合物不同pH值條件下二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化如圖5所示。有報(bào)道稱(chēng)LF的遠(yuǎn)紫外圖譜含有兩個(gè)特征吸收峰，在195 nm左右的正峰帶和210 nm左右的負(fù)峰帶[26]，這是蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的典型峰。從圖中可以明顯看出，隨著溶液中pH值逐漸增大，195 nm左右的正峰帶強(qiáng)度變化較小，210 nm左右負(fù)峰帶的強(qiáng)度逐漸減弱，這說(shuō)明隨著溶液中pH值逐漸增大，更多的二級(jí)結(jié)構(gòu)遭到破壞，這與LF在堿性條件下不穩(wěn)定是一致[19]。氫鍵是維持蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)最主要的作用力。這種變化可能是因?yàn)樗嵝原h(huán)境中增強(qiáng)了氫鍵作用力，從而保護(hù)了LF的二級(jí)結(jié)構(gòu)不受破壞；而堿性環(huán)境中，降低了氫鍵作用力，破壞了LF的二級(jí)結(jié)構(gòu)。此外，在酸性條件下（pH=2和pH=4）210 nm左右負(fù)峰帶有藍(lán)移現(xiàn)象，這與紅外分析結(jié)果一致。

通過(guò)Prodata和CDNN軟件處理圓二圖譜計(jì)算二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，如表2所示?？梢缘贸?，α-螺旋含量逐漸降低，同時(shí)無(wú)規(guī)則卷曲和β-折疊含量逐漸增大，β-轉(zhuǎn)角基本保持不變。由于LF-乳糖復(fù)合物中LF分子在堿性環(huán)境中不穩(wěn)定，熱處理加大了蛋白分子變性的程度，導(dǎo)致α-螺旋展開(kāi)，蛋白質(zhì)中其他結(jié)構(gòu)向無(wú)規(guī)則卷曲和β-折疊轉(zhuǎn)變，引起其含量增加[27]。黎慶等[28]和劉猛等[4]在研究LF的熱變性時(shí)，也發(fā)現(xiàn)其二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋含量降低，β-折疊含量升高，與本研究結(jié)果相似。

表2 熱處理后不同pH條件下LF-乳糖復(fù)合物的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化Table 2 Secondary structure changes of LF-lactose complex at different pH after heat treatment

2.6 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）

由圖6a可以看出，LF在66～95 ku區(qū)域內(nèi)有一條密度較高的寬大條帶。在pH為2時(shí)，條帶的密集度明顯降低，這可能由于在強(qiáng)酸性環(huán)境中LF發(fā)生降解。有研究報(bào)道表明，LF在pH=2時(shí)，部分高級(jí)結(jié)構(gòu)展開(kāi)，釋放大量結(jié)合的鐵離子[29,30]。在pH為4時(shí)條帶密度與LF相同，pH為6時(shí)，條帶密度略微減低，這說(shuō)明LF-乳糖合物在pH=6時(shí)出現(xiàn)變性。在pH為8時(shí)，只有一條很淺的條帶，同時(shí)在濃縮膠頂端也有條帶，這說(shuō)明LF-乳糖合物形成大量聚集體，且大部分聚集體不能進(jìn)入分離膠。在pH為10時(shí)，LF-乳糖合物幾乎全部形成了更大的聚集體，聚集體堆積在濃縮膠頂端，不能進(jìn)入分離膠。

弱酸和堿性環(huán)境中LF-乳糖分子均發(fā)生交聯(lián)，堿性越強(qiáng)交聯(lián)越緊密，導(dǎo)致形成聚集體，且相對(duì)分子質(zhì)量增大，不能通過(guò)濃縮膠。但在還原性電泳圖譜中（圖6b），只有pH為8時(shí)條帶明顯加深，pH為6時(shí)條帶略微加深，而且在pH為8和10時(shí)，在濃縮膠頂端仍發(fā)現(xiàn)聚集體，這說(shuō)明在堿性環(huán)境中形成了不被β-巰基乙醇破壞的聚集體。閆旭東等[31]研究表明，較強(qiáng)烈的熱處理打斷了LF分子內(nèi)的二硫鍵從而釋放出游離的巰基，導(dǎo)致了LF分子結(jié)構(gòu)的巨大改變。因此可以推測(cè)這種聚集體可能以非二硫鍵的共價(jià)鍵或以靜電作用和疏水相互作用為主的非共價(jià)鍵作用形成[28]。倪娜等[32]在研究pH對(duì)羊血漿蛋白熱誘導(dǎo)凝膠特性時(shí)，也發(fā)現(xiàn)在pH=5.0、85 ℃的持續(xù)加熱導(dǎo)致了凝膠中非二硫共價(jià)鍵的形成。

3 結(jié)論

pH值可以調(diào)控LF-乳糖復(fù)合物的粒徑大小，隨著pH值（2～10）逐漸增大，LF-乳糖復(fù)合物的粒徑也不斷增大（從10到460 nm）。弱酸性環(huán)境中，LF-乳糖復(fù)合物中僅有少量的蛋白分子變性，LF-乳糖復(fù)合物主要以鹽鍵和氫鍵作用形成。堿性環(huán)境中，蛋白分子大量變性，形成大量聚集體，聚集體間主要以靜電作用及疏水作用形成。不同的pH值條件，影響了形成LF-乳糖復(fù)合物的主要作用力，改變了LF-乳糖復(fù)合物結(jié)合狀態(tài)，導(dǎo)致其在水溶液中不同的存在形式。本研究結(jié)果對(duì)探索多羥基物質(zhì)對(duì)LF分子結(jié)構(gòu)和功能的變化提供一定的理論參考，也拓寬了乳鐵蛋白在食品中的應(yīng)用。